中药对合浦珠母贝插核手术伤口愈合效果和珍珠质量的影响

研究了3种中药对合浦珠母贝（Pinctada fucata）插核手术后体重日增长速度、伤口的愈合效果及其对珍珠质量的影响。试验采用白藜芦醇、芦荟胶和云南白药对插核伤口进行单次处理（插核手术后及时处理）和3次处理（手术后第5天和第10天分别进行第2次和第3次处理）,对体质量日增长速度、愈合率和珍珠质量进行统计分析。结果显...     

合浦珠母贝基因组微卫星富集文库的构建与分析

采用生物素标记的(AC)_(15)探针和磁珠富集法构建合浦珠母贝(Pinctada fucata)基因组DNA微卫星富集文库。随机挑选2097个克隆进行筛选,得到483个候选克隆(23.03%),对其中135个阳性克隆测序分析发现122个克隆含有微卫星重复单元(90.37%)。进一步通过序列比对,最终得到65个具有特异微卫星序列的阳性克隆(53.28%),其中包含85个微卫星DNA结构域,其中完美型(perfect)70个,占82.36%;非完美型(imperfect)7个,占8.24%;混合型(compound)8个,占9.41%,重复次数主要分布在5~20(95.74%),平均重复次数为7.83,(AC/GT)n重复所占比例最高(75.53%)。基于微卫星两端的侧翼序列,利用Primer Premier 5.0设计引物,获得11对具有多态性的微卫星引物。本研究为开展合浦珠母贝分子育种及资源评价分析提供了基础资料。     

合浦珠母贝转录因子PF-CREB3L2基因的克隆和鉴定

克隆得到了合浦珠母贝(Pinctada fucata)PF-CREB3L2蛋白的c DNA序列,其c DNA全长1 983 bp,其中开放阅读框长度为1 728 bp,编码的蛋白含有575个氨基酸残基。组织表达分布实验发现,其在合浦珠母贝内脏囊中表达量最高,在外套膜和鳃中也有大量表达,推测其广泛参与合浦珠母贝的贝壳形成等生理活动。贝壳损伤修复实验中发现,在合浦珠母贝贝壳受到损伤后,PF-CREB3L2和基质蛋白的表达量会迅速上升,且PF-CREB3L2的峰值出现更早,推测其通过影响基质蛋白转录,参与合浦珠母贝生物矿化的调控过程。PF-CREB3L2与合浦珠母贝基质蛋白表达相关性的分析发现,PF-CREB3L2与Prisilkin39、KRMP的表达量呈现显著的正相关,说明其可能特异性地调控某些基质蛋白的转录。     

合浦珠母贝3个养殖群体双列杂交F1代的生长和遗传分析

为开展合浦珠母贝(Pinctada fucata)遗传改良和培育优质新品种,作者利用合浦珠母贝北海养殖群体(B)、徐闻养殖群体(X)和三亚养殖群体(S)进行双列杂交,获得3个种群内自繁群体及6个种群间杂交群体。对8月龄F1代的壳长、壳高、壳宽和体质量4个生长性状进行了测定,计算了各组合的一般配合力、特殊配合力及杂种优势。结果表明,杂交组合的各性状值普遍高于自繁群体,其中S(♀)×B(♂)和S(♀)×X(♂)杂交组合的各性状值极显著高于其他组合。三亚群体各性状的一般配合力最大,S(♀)×X(♂)组合各性状特殊配合力最大,其次是S(♀)×B(♂)组合。杂交子一代4个生长指标均表现出一定程度的杂种优势(0.24%~52.62%)。不同杂交组合间和不同性状间的杂种优势存在差异,其中,S(♀)×B(♂)杂交组合杂种优势明显,其反交组合B(♀)×S(♂)杂交优势程度不高,且在壳宽上表现出较低的杂种优势率(0.24%);S(♀)×X(♂)杂交组合杂种优势率比反交组合X(♀)×S(♂)高。体质量的平均杂种优势率均高于其他3个性状。该研究的结果表明杂交群体性状的改进为进一步选育奠定了基础。     

三倍体和二倍体合浦珠母贝育珠比较初步研究

利用人工诱导培育的三倍体合浦珠母贝Pinctada martensii(D.)进行插核育珠试验,并同处理组内的二倍体同胞进行比较。结果表明:三倍体合浦珠母贝的留核率和正圆珠比率分别为81.0％和58.8％,而二倍体则为71.3％和37.8％;在非正圆珠中两者的污珠率差别不大,但三倍体的尾巴珠和素珠的比率明显低于二倍体;三倍体的正圆珠珍珠层平均厚度和平均重量分别为381μm和163mg,二倍体分别为265μm和105mg,两者差异极显著(P<0.01)。初步表明,利用三倍体合浦珠母贝培育珍珠,能缩短育珠期,提高珍珠的产量和质量。     

珍珠生长激素在合浦珠母贝育珠中的作用

以合浦珠母贝Ｐｉｎｃｔａｄａ ｍａｒｔｅｎｓｉｉ （Ｄｕｎｋｅｒ）作为珠母贝进行插核育试验,分别以其左、右边外套膜作为小片,并用珍珠生长激素浸泡小片,两个试验用珍珠生长激素浸光怕小片各插核育珠贝２００个,空白对组用海水浸泡小片插核育珠贝２０７个,育珠时间为６个多月。试验结束时,实验组珍珠的正圆珠率,白色珍珠比例以及珠层厚度在比空白对照组分别提高了９．２８％,２２．５７％和５２μｍ。     

地塞米松和过氧化氢对合浦珠母贝珍珠层结构及基质蛋白表达的影响

分别用地塞米松(Dexamethasone,DEX)和过氧化氢(H2O2)处理合浦珠母贝(Pinctada fucata),研究其对贝珍珠层和基质蛋白表达的影响。扫描电镜观察显示,DEX可促进珍珠层生长,H2O2则抑制珍珠层生长。体外碳酸钙结晶实验表明,DEX处理组间液蛋白调控文石生成的趋势加强,并加速碳酸钙结晶速率;H2O2处理组相反。实时定量PCR实验显示,DEX处理组TGFβ和NF-кB信号通路关键因子pf-smad3、pf-rel等和基质蛋白Nacrein等基因表达水平明显降低,H2O2作用组则显著上升。由上述结果推测,DEX和H2O2可通过抑制或激活合浦珠母贝的TGFβ和NF-кB信号通路,从而调控与珍珠层形成相关的基质蛋白的表达,并影响珍珠层的结构;同时暗示贝的免疫体系和矿化系统可能存在协同作用,该作用机制具有生物进化学意义,并对养殖珍珠的培育具有借鉴作用。     

合浦珠母贝三倍体和二倍体的生长比较

合浦珠母贝Pinctada martensii(D.)三倍体和二倍体的生长测定表明,三倍体成贝平均壳高、壳长、壳宽和体重均超过二倍体同胞,差异极显著(P<0.01)。特别是抑制第一极体形成的三倍体,经两年养殖,壳高、体重和肉重分别比二倍体增加13.01％,44.03％和58.37％。在繁殖期,三倍体的增长率显著超过二倍体。非繁殖期的大多数月份,三倍体的增长率和二倍体相差不大。因此,可以认为三倍体生长速度快主要是由于三倍体的生殖腺发育受阻,体内积累的能量转移到体细胞生长所致。     

珍珠贝多糖肽对合浦珠母贝非特异性免疫的影响

以不同浓度的珍珠贝多糖肽投喂合浦珠母贝15—75d后，实验合浦珠母贝(Rinctada marlensii）的血细胞的总量及各种血细胞的数量、吞噬细胞的吞噬能力、血清对细茸的凝集、抑菌和杀菌活力等都有不同程度的增加，表明该珍珠贝多糖肽可以增强合浦珠母贝非特异性免疫能力。     

合浦珠母贝β-肌动蛋白基因的克隆和序列分析

为进一步研究珍珠质基质蛋白外排机制,同时为今后合浦珠母贝(Pinctada fucata)不同组织的基因表达研究提供阳性对照,根据大鼠(Rattus norvegicus)胞质型肌动蛋白β-actin设计引物,通过RT-PCR方法克隆鉴定了合浦珠母贝肌动蛋白同源基因片段。序列分析表明,该片段编码的氨基酸序列与相应同源片段具有较高的保守性。合浦珠母贝β-肌动蛋白有多个特有的氨基酸残基。合浦珠母贝可能是在系统进化上较早分出的一支。     

马氏珠母贝家系遗传结构的微卫星分析

利用6个微卫星位点研究了9个马氏珠母贝(Pinctada fucata)养殖家系的遗传结构,为后续育种工作提供了指导。从60对引物中筛选出6对能够稳定扩增且多态性较好的引物。6个微卫星位点在9个家系中共检测到17个等位基因,每个位点等位基因数(A)为2~4个,平均2.833个。6个位点在9个家系上的有效等位基因数(Ne)平均值为2.030~2.632,平均杂合度观测值(Ho)为0.4306~0.6354,平均杂合度期望值(He)为0.4380~0.5962。家系间遗传分化系数(FST)为0.0749。采用NJ法进行聚类分析显示,9个家系分为明显的两支,根据遗传距离计算结果, F7和F9家系之间的遗传距离最近, F11与F12家系遗传距离最远。结果表明,9个家系的遗传多样性和遗传分化处于中等水平,可以考虑F11与F12家系杂交,以期获得较好的杂种优势, F11自交培育出遗传稳定的优良家系。     

合浦珠母贝iPS细胞相关的转录因子的克隆及分析

转录因子Sox2、Oct4、c-Myc和KLF4在iPS细胞研究中具有重要作用,将它们加入体外培养的细胞中,可以诱导体细胞去分化成为多能干细胞。作者通过RACE-PCR技术从合浦珠母贝(Pinctada fucata)的外套膜组织中克隆获得了3个转录因子——c-Myc、Sox2及KLF4的cDNA。c-Myc全长1585bp,开放阅读框的长度为1131bp,编码376个氨基酸,蛋白结构分析表明它具有保守的HLH和Myc-N结构域。Sox2全长1908bp,开放阅读框长度为990bp,编码329个氨基酸,蛋白结构分析它具有保守的HMG-box和Soxp结构域。KLF4全长2268bp,开放阅读框长624bp,编码207个氨基酸,预测该蛋白具有两个zf-H2C2_2结构域。BLAST分析它们均与太平洋牡蛎的相关蛋白具有较高同源性,说明其与太平洋牡蛎亲缘关系更近。RT-PCR实验发现这3个基因在合浦珠母贝外套膜、足、生殖腺、内脏团、闭壳肌和鳃6种组织中均有表达,表明它们是非常保守的转录因子。本研究对于合浦珠母贝细胞系建立和研究具有启发意义。     

海洋酸化对马氏珠母贝受精及早期发育的影响

自2010年7月1日至3日,在pH值为8.1、7.7和7.4条件下研究了海洋酸化对马氏珠母贝(Pinctada martensii Dunker)受精及早期发育的影响。结果显示,海洋酸化对不同pH值下马氏珠母贝的受精率无显著影响。pH8.1、pH 7.7和pH 7.4试验组幼虫的壳长、壳高的值逐渐增大,pH 8.1组幼虫的壳长、壳高的值大于同期其他两组的值,且在实验的第24、36、48小时与其他两组同期幼虫的壳长、壳高的值差异显著,这表明海洋酸化显著影响马氏珠母贝幼虫的生长。实验期间,pH 8.1试验组幼虫的存活率和畸形率没有显著变化,而pH 7.7和pH 7.4组幼虫的存活率显著低于pH 8.1组。pH 7.4组幼虫的畸形率显著高于同期pH 8.1和pH 7.7组幼虫的畸形率,表明在海洋酸化的环境中幼虫的发育受到影响。本文将为海洋酸化的相关研究提供基础数据。     

大珠母贝微卫星DNA标记的分离与筛选

采用生物素标记的(CA)15探针和磁珠富集法构建了大珠母贝(Pinctada maxima)微卫星DNA文库,随机挑选1200个菌落,经PCR筛选得到298个候选克隆,成功测序246个,分析获得251个微卫星序列,其中完美型、非完美型和混合型分别占63%、32%和5%。除探针中使用的CA重复外,还得到AT、GT、TC、AG、GC、TAA、CAA、AGG、GATA、GACA、GTGC、CGTC、GACG、CTGT等重复序列。设计引物90对,挑选其中30对合成并筛选出21对能在大珠母贝基因组有效扩增的引物。种群PCR扩增后利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行检测,获得了10个多态位点,共检测出59个等位基因,片段长度范围为133~444 bp。各位点等位基因数2~8个,平均等位基因数5.9个;有效等位基因数为1.342 3~6.000 0,平均为4.124 0;多态性信息含量(CPI)为0.222 5~0.811 8,平均0.7179;期望杂合度(He)为0.259 3~0.847 5,平均0.717 9;观测杂合度(Ho)为0.300 0~0.800 0,平均0.533 3。这些微卫星多态性标记的获得,为进一步开展大珠母贝遗传育种、保护生物学和种群遗传多样性等研究奠定了一定基础。     

大珠母贝游离珍珠培育研究

2008~2010年,在广西涠洲岛进行了大珠母贝(Pinctada maxima Jameson)游离珍珠培育实验。实验过程中采用解剖法优选植核核位、几种术前处理方法和低温处理小片贝制备外套膜小片等技术,旨在提高育珠贝留核率、成珠率和优珠率。结果表明,在大珠母贝内脏囊缩足肌左右两侧各有一个适合培育游离珍珠的核位,分别称为左袋和右袋,实际操作中只有左袋可以植入珠核培育游离珍珠;不同术前处理实验组的植核贝休养期成活率差异不显著(P>0.05),但留核率、成珠率显著差异(P<0.05),其中采用传统术前处理和低温处理相结合的综合术前处理方法可有效提高留核率、成珠率平均达78.2%和80.1%;低温处理小片贝与传统方法制备的大珠母贝外套膜小片的育珠效果(成珠率、优珠率、正圆珠比例)存在显著差异(P<0.05),且在实验温度范围内,成珠率、优珠率、正圆珠比例随处理温度的降低而增高,在4~8℃达到最好育珠效果,成珠率、优珠率和正圆珠比例分别达到98%、53%和30%左右;在术后休养期,植核贝吐核高峰出现植核后5~15 d,手术伤口愈合时间为15~20 d,育珠贝的死亡高峰出现在术后的第20~30天。在水温25~30℃条件下,珠核表面形成珍珠层的时间为45 d左右。