高温胁迫下坛紫菜(Pyropia haitanensis)对无机碳的利用

采用藻类二氧化碳浓缩机制(CO2 Concentrating Mechanism, CCM)关键酶胞外碳酸酐酶(periplasmic Carbonic Anhydrase, pCA)的抑制剂AZ (acetazolamide)、DIDS (4’4’-diisothiocyanatosilbene-2, 2-disulfonic acid)和SITS (4-acetamido-4’-isothiocyano-2, 2’-stibene-disulfonate)等对不同生长阶段的坛紫菜(Pyropia haitanensis)叶状体进行处理, 利用pH-drift技术研究了高温胁迫下坛紫菜利用无机碳的特点。结果表明: (1) 坛紫菜主要依赖pCA利用HCO3?, 且能力较强; (2) 高温抑制坛紫菜吸收利用无机碳, 温度越高影响越严重; (3) 坛紫菜未性成熟组叶片对无机碳的利用能力远大于成熟组, 但对高温胁迫的抗性低于成熟组。高温造成藻体细胞膜系统损伤和脂肪酸成分变化或许是高温抑制藻类CCM的原因之一。     

坛紫菜品系间遗传差异的RAPD分析

利用RAPD技术对六个坛紫菜品系进行了研究,从107条随机引 物中筛选10条随机引物,一共扩增出93条可重现的片段。经统计分析,六个品系间的遗传相 似系数在0.246～0.636之间。其中浙江北部沿海栽培品系间的相似系数最高为0.636.地 域间品系的遗传相似系数最低为0.246。六个品系用UPGMA方法得到的聚类关系符合传统的地 域和表型关系。通过对照品系间有稳定差异的DNA条带,表明RAPD标记是坛紫菜品系鉴定和 遗传多样性分析的有效手段。     

坛紫菜微卫星DNA序列的筛选

自坛紫菜(Porphyrahaitanensis)丝状体中提取的DNA,经Sau3AI限制性内切酶消化后,将300~900bp之间的DNA片段回收,并连接到经BamHI酶切并去磷酸化的pUC18载体上,最后转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中,构建坛紫菜小片段DNA质粒文库。选用pUC18质粒的通用引物进行PCR反应,对文库进一步筛选并检测插入片段的大小,在384个阳性克隆中,有278个含有大小合适的插入片段。经测序及序列分析,在103个克隆中获得172个微卫星序列,其中完美型107个,占62.2%,非完美型53个,占30.8%。(GC)n与(CG)n在坛紫菜DNA中非常丰富,分别占25%及17%,但重复频率相对较低。     

坛紫菜应答高光强胁迫的生理指标分析

以坛紫菜(Pyropia haitanensis)叶状体为材料,测定了其在不同光强强度胁迫下细胞内超氧阴离子自由基(O~-_2·)、过氧化氢(H_2O_2)、羟自由基(·OH)、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、还原型谷胱甘肽(GSH)含量、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性、过氧化氢酶(CAT)活性的变化.结果表明,在光强为200μmol/(m~2·s)即检测到了O~-_2·含量的显著上升,而当光强继续升高至500μmol/(m~2·s)以上时,O~-_2·含量开始显著减少,H_2O_2和·OH含量开始显著上升;SOD和CAT的酶活伴随光强升高而呈现为逐渐下降的趋势,GSH的含量在光强超过500μmol/(m~2·s)时显著下降,只有APX酶活在整个高光强胁迫过程中呈现为活性逐渐增强的趋势.这些结果说明,坛紫菜细胞内存在着一套应答高光强胁迫的活性氧清除机制,APX在其中发挥重要作用.但当光强超过500μmol/(m~2·s)以上时,坛紫菜细胞内的活性氧清除机制难以满足活性氧清除的需要,氧化性更强的·OH迅速积累,引起细胞膜脂的严重损伤.     

坛紫菜耐高温品系选育及经济性状的初步研究

将人工杂交选育的坛紫菜新品系Z-26,Z-61,Z-81,Z-17的子3代(F₃)与野生型对照组进行遗传性状的比较,旨在筛选耐高温品系。实验结果表明:(1)在高温29℃下培养40 d,人工选育的4个新品系丝状体均能正常生长发育,其中Z-26丝状体生长较快,Z-61在29℃下较易成熟,95%的营养藻丝发育成孢子囊枝,Z-17只有30%形成孢子囊枝;(2)Z-26和Z-61品系的叶状体在30℃下培养10 d,虽然藻体变白,但没有死亡,此时将其移至21℃下恢复培养3~4 d,藻体逐渐恢复为原有的色泽;(3)Z-81和Z-17的叶状体在29℃下培养7~10 d,虽然藻体发白但尚未死亡,移至21℃下培养基本可恢复正常,但在30℃下培养10 d,藻体腐烂不可恢复;(4)野生型对照组不耐高温,藻体在27℃下培养5 d就腐烂死亡,人工选育的4个品系耐受高温的幅度比野生型对照组高1~3℃;(5)4个品系叶状体在26~28℃温度下培养10 d后,其主要的藻胆蛋白和叶绿素a的含量与21℃培养下的含量差异不显著,说明短时间的高温培养并不影响其品质。     

有机磷农药对坛紫菜叶状体核酸含量的影响

在实验生态条件下研究了不同浓度、不同时间甲胺磷、辛硫磷暴露对坛紫菜(Porphyra haitanensis)核酸(RNA和DNA)含量的影响。结果表明,随着污染时间的延长,所有污染物对RNA、DNA含量的影响基本上表现为先上升后下降的时间效应关系,同一污染物浓度越大就越早出现下降。同时出现随暴露剂量的增加,RNA、DNA含量先上升后下降或全部下降的剂量～效应关系。     

不同盐度胁迫对坛紫菜叶状体生理指标的影响

以坛紫菜(Pyropia haitanensis)Z-61叶状体为材料,检测了高盐(110)胁迫与低盐(0)胁迫处理不同时间(0、4、8、24h和恢复4h)后叶状体中的羟自由基(·OH~-)清除能力、过氧化氢(H_2O_2)含量、丙二醛(MDA)含量、超氧阴离子(O_2~-·)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、抗坏血酸过氧化物酶(GSH)活性以及叶绿素荧光参数[包括PS II最大光化学效率(Fv/Fm)、表观光合电子传递效率(ETR)、非光化学荧光猝灭系数(NPQ)、实际光合作用效率Y(II)]的变化,以探究坛紫菜叶状体对不同盐度海水的耐受机制.结果表明,在高盐和低盐胁迫下,H_2O_2的含量和·OH~-的清除能力随时间增加而呈现逐渐上升的趋势,而O_2~-·的含量在胁迫4h显著升高后无显著变化.且相比于高盐(110),低盐(0)胁迫下坛紫菜叶状体会产生更多H_2O_2、O_2~-·和·OH~-,膜脂过氧化物丙二醛(MDA)含量增加更明显,说明低盐胁迫引起坛紫菜叶状体的氧化损伤要显著高于高盐胁迫.高盐胁迫24h后,SOD的活性达到了最大,CAT、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、谷胱甘肽(GSH)的活性均呈现先上升后下降的变化趋势.低盐胁迫下,SOD、GSH的活性均不断增加,CAT、APX的活性先上升后下降.此外,低盐和高盐胁迫下,随时间的增加,叶绿素荧光参数均明显下降.上述结果表明,高盐和低盐胁迫下,坛紫菜叶状体的光合作用受到抑制,机体通过维持较高的抗氧化酶活性以提高活性氧的清除能力,进而保证藻体的正常存活.     

坛紫菜ISSR反应体系的建立与优化

为了利用ISSR分子标记技术对坛紫菜(Porphyra haitanensis)种质资源进行遗传分析及种质鉴定,获得清晰稳定、重复性好、多态性高的扩增结果,对影响ISSR-PCR扩增的多个因素,包括DNA模板含量、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶含量、引物浓度、dNTP浓度以及复性温度进行了全面比较和优化,建立了坛紫菜种质资源ISSR-PCR扩增的最佳反应体系:25μL的反应体系中含2.5μL 10×PCR缓冲液,5 ng模板DNA,2.5 mmol/L Mg2+,1.5 UTaqDNA聚合酶,200 nmol/L引物,200μmol/L dNTP。最佳PCR扩增程序:94℃预变性7 min;每个循环94℃变性1 min,48℃复性45 s,72℃延伸2 min,共进行35个循环;循环结束后72℃再延伸7 min。     

我国东南沿海坛紫菜遗传多样性研究

利用线粒体COX和叶绿体rbcL基因片段对我国东南沿海坛紫菜(Pyropia haitanensis Chang et Zheng)9个野生群体和2个养殖群体(共125个个体)进行遗传多样性分析。比对分析后得到408 bp的COX基因片断和488 bp的rbcL基因片断。联合分析的基因片断长度为896 bp,其中T、C、A、G的含量分别为34.9%、14.6%、34.2%和16.3%。检测到变异位点128个,其中单碱基变异位点19个,简约信息位点109个。群体的平均核苷酸多样性为0.035 9±0.028 4,单倍型多样性为0.817 0±0.024 0。125个个体共定义了31个单倍型,其中Hap1、Hap10和Hap16是核心单倍型,分别占全部样本的32.8%、12.8%和24.8%。群体遗传距离和地理距离相关性检测显示二者呈线性相关(R²=0.002 2,p=0.735 4),即遗传距离随地理距离的增大而增大,但未形成地理隔离。根据单倍型构建的ML树显示,坛紫菜群体之间没有明显的地理谱系结构,表明各个群体之间存在基因交流。     

Cloning and expression analysis of the chloroplast fructose- 1,6-bisphosphatase gene from Pyropia haitanensis

Fructose-1,6-bisphosphatase(FBPase) is one of the key enzymes in Calvin circle and starch biosynthesis. In this study, the full-length of cpFBPase gene from Pyropia haitanensis was cloned by using rapid amplification of cDNA ends(RACE) technology. The nucleotide sequence of PhcpFBPase consists of 1 400 bp, including a 5′ untranslated region(UTR) of 92 bp, a 3′?UTR of 69 bp, and an open reading frame(ORF) of 1 236 bp, which can be translated into a 412-amino-acid putative peptides with a molecular weight of 44.3 kDa and a theoretical pI of 5.23. Multiple sequence alignment indicated that the protein belonged to the chloroplast FBPase enzyme. Phylogenetic analysis showed that the protein assembled with the cpFBPase of a thermal tolerant unicellular red micro-algae Galdieria sulphuraria. Expression patterns analyzed by qRT-PCR revealed that the expression of PhcpFBPase gene in the thallus phage was 7-fold higher than in the conchocelis phage, which suggested the different mechanisms of inorganic carbon utilization among the different life phages of P. haitanensis. And the different response modes of PhcpFBPase mRNA levels to high temperature and desiccation stress indicated that PhcpFBPase played an important role in responsing to abiotic stress.     

海洋酸化对经济海藻坛紫菜叶状体的光照强度和温度适应范围的影响

坛紫菜(Pyropia haitanensis)养殖区的温度和光照强度变化幅度较大,坛紫菜叶状体对温度和光胁迫的耐受能力决定了产量.为了探究海洋酸化是否改变坛紫菜对温度和光胁迫的耐受能力,本研究采用实验生态学方法研究了坛紫菜的光合作用和生长对温度和光照强度的响应特点.结果表明,无论在短期(4 h)或长期(3～6 d)的...     

茉莉酸甲酯和水杨酸对坛紫菜生长与抗逆性的影响

为了探讨植物激素在藻类生理与抗逆方面的作用,本文比较了不同浓度的茉莉酸甲酯(MJ)和水杨酸(SA)对坛紫菜(Pyropia haitanensis)生长、藻胆蛋白、可溶性蛋白、脯氨酸含量和叶绿素荧光参数的影响。结果显示100?mol/L SA的添加可使坛紫菜生长率达到对照组的1.57倍,而MJ对藻的生长影响不显著。50?mol/L MJ和100?mol/L SA显著促进了坛紫菜藻胆蛋白和可溶性蛋白的积累。50?mol/L MJ和100?mol/L SA添加后在48 h脯氨酸含量分别为对照组的2.67倍和1.75倍。25~50?mol/L MJ对坛紫菜的Fv/Fm和Y(II)影响不显著,而100?mol/L SA则可以提高这两个叶绿素荧光参数。该研究表明适当浓度的MJ和SA可以促进坛紫菜生长,提高其光合能力,在一定程度上增强坛紫菜的抗逆性。     

琼胶寡糖聚合度对坛紫菜抗性诱导的影响

研究了琼胶寡糖聚合度对坛紫菜抗性诱导的效应。以琼胶3,6和12糖,3种聚合度的琼胶寡糖为材料,处理坛紫菜,通过观察叶片腐烂率比较坛紫菜生长状态;利用透射电镜观察处理后的细胞亚显微结构变化;并检测坛紫菜附生菌的数量变化;以对羟基苯乙酸(POHPAA)化学发光法检测坛紫菜H₂O₂释放量;利用实时定量PCR检测坛紫菜NADPH氧化酶基因(Phrboh)的差异表达。结果表明,经琼胶3糖和6糖处理,坛紫菜的Phboh表达出现上调,并产生H₂O₂暴发。经两种琼胶寡糖处理后,坛紫菜的附生菌数量明显减少,其中以琼胶6糖的效果最好,在较长培养时间内,坛紫菜能保护自身细胞亚显微结构的完整性,维持良好的生长状态。而琼胶12糖没发现任何诱导作用。综上所述,聚合度为3和6的琼胶寡糖能诱导坛紫菜的抗性响应,特别是形成单个螺旋结构的琼胶6糖的诱导作用最明显,但聚合度较大的琼胶寡糖则不能。     

银鲳应对高温胁迫的生理响应及其相关基因表达研究

为探究银鲳(Pampus argenteus)应对高温胁迫的生理响应及其相关基因表达研究,本研究设置4个温度组:对照组26℃和实验组28、30、32℃.并对银鲳的肝、肾和鳃的组织结构、肝组织中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶的相对活性变化和丙二醛含量变化以及hsp70基因的相对表达量的变化进行了研究.结果显示:(1)随温度的...