LED灯的光照对雨生红球藻细胞生长及虾青素积累的影响

为提高雨生红球藻的生物量以及细胞内虾青素的积累量,通过不同光源、不同光照强度照射培养藻细胞。研究表明,在总光强为2500lx,红光与白光的强度比例为2:1时,雨生红球藻干重可以达到0.98g/L,比单独使用白光和红光照射下分别提高了36.11%和15.91%。在雨生红球藻转化产虾青素阶段,对比蓝光LED、目光灯以及两者的组合光源照射转化的结果,发现在总光强为7000lx,蓝光与白光的强度比例为3:1时,雨生红球藻中虾青素的积累量为39.79mg/L,明显高于单独使用白光与蓝光转化下的产量。     

雨生红球藻紫外诱变及抗铵品系筛选

经紫外诱变,筛选出在碳酸氢铵浓度为400 mg/L条件下可以生存的突变株。通过培养基中氮、磷、铁、温度、光照及pH值对雨生红球藻诱变株生长的影响进行比较,对以上3种营养盐及3种环境因子分别进行三因素三水平正交实验,以优化培养条件。进而对雨生红球藻野生型及诱变株的生长状况及色素含量进行比较。实验结果表明,雨生红球藻抗铵品系在培养基中NaNO30.1 g/L,KH2PO40.01 g/L,FeCl3.6H2O 1.0 mg/L,在pH值为8.0,光照强度100μmol.m-2.s-1,温度为18℃的培养条件下,雨生红球藻的生物量得到有效提高。     

玉米素和水杨酸对雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)生长及虾青素积累的影响

虾青素是一种具有强抗氧化活性的类胡萝卜素,而雨生红球藻是天然虾青素的主要来源。本文以雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)为材料,研究了植物激素玉米素和水杨酸对雨生红球藻的生长、虾青素含量及相关基因表达的影响。分别添加5种浓度的玉米素或水杨酸,结果发现0.05mg/L玉米素或25mg/L水杨酸处理5d后雨生红球藻虾青素积累最多。该浓度玉米素或水杨酸可显著提高光胁迫下藻细胞密度,最高分别达到3.4×10~5cell/mL和3.0×10~5cell/mL;同时玉米素与水杨酸组中虾青素含量显著上升,分别为1.7%和1.6%,比对照组分别增加29.2%和25.6%。玉米素缓解了高光逆境条件下光合作用基因——Rubisco大亚基(rbcL)及其活化酶(rca)、碳酸酐酶(ca)的下调表达,但对虾青素合成途径β-胡萝卜素酮化酶基因(bkt)的表达量没有显著影响;而水杨酸则相反,在胁迫后期不能缓解光合作用相关基因的下调表达,但可使bkt基因显著上调,最高可达对照组的2.5倍。本研究首次比较了玉米素和水杨酸对雨生红球藻生长和虾青素积累的影响,发现玉米素比水杨酸具有更好的促进雨生红球藻中虾青素积累的效果。     

不同培养模式对雨生红球藻细胞绿色生长以及虾青素积累的影响

研究了分批培养、pH反馈补料培养、定量补料培养与培养基完全更换培养4种培养模式对雨生红球藻绿色生长以及虾青素积累的影响。结果表明:当在绿色细胞阶段采用培养基完全更换的培养模式,能够有效的促进雨生红球藻细胞的分裂,同时藻细胞保持了较高活性。其中培养9d后藻细胞数目达到8.60E+05个/mL,游动细胞所占比例达到98.26%,细胞干重为1.12g/L,而且胁迫条件下培养10d后虾青素的产量达到53.21mg/L,明显高于其他培养模式。因此培养基完全更换培养是一种适合雨生红球藻生长与积累虾青素的培养模式。     

雨生红球藻cDNA表达文库的构建与初步分析

为了筛选雨生红球藻虾青素合成过程中的关键酶基因的反式调节因子基因,以雨生红球藻的绿细胞为材料,提取了高质量的总RNA,并分离纯化了mRNA,经过反转录后的得到cDNA,构建了以λ-ZAPExpress为载体的表达型cDNA文库。经检测,所构建的文库的滴度为5.1×105,重组率为100%。用PCR方法对文库的质量进行了鉴定,文库的平均插入片断的大小为1.7kb。雨生红球藻cDNA表达文库的构建为研究虾青素的代谢工程奠定了基础。     

光照强度和温度对雨生红球藻生长、虾青素及内源脱落酸积累的影响

本文探讨了光照强度和温度2个生态因子对雨生红球藻(Haematococcus plivialis)生长、虾青素及内源脱落酸积累的影响。研究表明,光照强度、温度及二者交互作用对雨生红球藻的生长、虾青素及内源脱落酸的积累均有显著影响(P0.05)。温度23℃时,细胞密度随光照强度的升高呈先上升后下降趋势,在200μmol/(m~2·s)时达到最大值4.9×105个/mL。适当的高光照强度和高温均能促进雨生红球藻中虾青素和内源脱落酸的积累,过高则起抑制作用。培养期间雨生红球藻中虾青素和内源脱落酸的最大峰值分别为6.266mg/L和322.641ng/g(干重),且最大峰值均出现于27℃、200μmol/(m~2·s)处理组。脱落酸含量的最大值出现在虾青素快速积累前,且在雨生红球藻的生活周期中,孢囊形成期的内源脱落酸含量最高。本研究所得到的规律对规模化培养雨生红球藻具有一定的指导意义。     

IPP异构酶基因遗传转化对雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)虾青素含量的影响

采用RT-PCR技术, 从雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)中克隆出IPP异构酶基因(ipiHp1), 构建双元载体pCAMBIA3300-egfp-ipiHp1和基因枪转化载体pBlueScript SKⅡ-bar-egfp-ipiHp1, 利用根癌农杆菌侵染法和基因枪转化法, 将目的基因导入雨生红球藻中, 经过含50?g/mL草丁膦BBM培养基筛选得到阳性转化子。通过荧光观察报告基因egfp和PCR扩增分析, 证明ipiHp1基因整合到转化子的基因组中。生物量测定结果表明大部分转化子的生物量与野生型相似。虾青素含量测定发现, 农杆菌侵染法转化的转化子A3虾青素含量与野生型相比有显著变化, 平均值达到16.49mg/g, 与野生型相比提高了5.16%, 而基因枪转化法转化的转化子虾青素含量与野生型无显著性差异。     

稀土元素Ce对雨生红球藻生长及虾青素积累影响的研究

采用反相高效液相色谱分析法（RP-HPLC）研究了稀土元素铈（Ce^3＋）对雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）生长及虾青素积累的影响。结果表明,低质量浓度的Ce^3＋对微藻生长和虾青素积累均具有明显的促进作用,当Ce^3＋的质量浓度为0．1mgm时,对藻生长的促进效果最佳,细胞密度较对照组提高34％;当Ce^3＋的质量浓度为1mg/L时,虾青素质量分数可达到细胞干质量的3．2％,较对照组提高167％。此外,高质量浓度Ce^3＋的对雨生红球藻有抑制作用,当Ce^3＋的质量浓度高于40mgm时,红球藻的生长完全被抑制,虾青素质量分数也明显降低。     

红球藻藻株对光强适应及在工程培养中的应用

于2007～2008年在云南楚雄,利用叶绿素连续荧光分析等技术方法,对比研究了3株雨生红球藻藻株(Haematococcus pluvialis)(H_0、H_2、H_3)不同类型细胞对光强适应能力和光化学机制、生长速率和虾青素累积情况,对比研究了红球藻细胞转化过程的光化学特性与能量分配机制。结果表明,3株雨生红球藻游动细胞、绿色不动细胞和红色不动细胞光合作用对光强需求存在明显差异性,其中绿色游动细胞H_0、H_2和H_3光饱和点分别为750、1000、750 μmol/(m~2·s),绿色不动细胞H_0、H_2和H_3光饱和点分别为750、750、500 μmol/(m~2·s),而红色不动细胞H0、H_2和H_3的光饱和点分别为500、750、500 μmol/(m~2·s)。上述数据意味着红球藻光合作用对光强需求以游动阶段细胞最高,其次为绿色不动细胞,而红色不动细胞对光需求最弱;3株红球藻光合作用对光强需求的顺序为H_2H_0H_3。从实际培养效果来看,H_0藻株游动细胞在9月、11月到次年5月生长最好,其中4月、11月比生长速度为藻株H_3的2.19倍和2.17倍,而在6～8月和10月份中,藻株H_2生长比较迅速,但是藻株之间差异性相对较小。针对3株红球藻虾青素累积而言,1～2月、4月、6月、9月、11～12月藻株H0的虾青素含量最高,3月、5月更适宜H_3积累虾青素,其余7～8月和10月H_2藻株积累虾青素更多。综合雨生红球藻细胞生长和虾青素累积二个决定产量的主要因素,作者认为,在秋末、冬、春和夏初等温度和光照相对较低季节,选择藻株H_0规模化培养可获得更好的生产效果,而在光照较强、温度较高和多雨的夏季和秋初季节,应选择藻株H_2培养产量更高。     

藻际可培养细菌对雨生红球藻生长和虾青素积累的影响

为探究雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)藻际可培养细菌多样性及可培养细菌对雨生红球藻生长和虾青素积累的影响,本实验采用培养分离法,在乙酸钠兼养条件下,共分离到8株雨生红球藻藻际细菌,通过16S rDNA测序鉴定,并在NCBI网站比较序列发现,编号为DBQ、HS、BTH、DBB、XBL、HB、FH、JH的菌株分别与Pseudomonas sp.、Methylobacterium sp.、Chryseobacterium sp.、Bacillus sp.、Paracoccus sp.、Planctopirus hydrillae、Rhodobacter vinaykumarii、Brevundimonas vesicularis的16S rDNA序列具有最高的相似性。分别将8株细菌与通过抗生素处理获得的纯种雨生红球藻共培养,测定了8株藻际细菌对雨生红球藻细胞密度、藻液pH、叶绿素及虾青素含量的影响。实验发现,HS处理组在绿色阶段培养第9天获得最高细胞密度,为3.65×10~5cells/mL,且显著高于对照组;DBB处理组虽然能够促进藻细胞密度增加,但与对照组并无显著差异;DBQ处理组藻细胞密度显著低于对照组及其他处理组。第1～7天,藻液叶绿素浓度的变化与藻细胞密度变化趋势有一定相似性,绿色阶段后期,叶绿素浓度呈现下降趋势,也说明藻细胞内部叶绿素向其他色素转变,同时标志着绿色阶段的结束。绿色阶段培养过程中,藻液pH变化幅度较大,由初始值7.0左右上升到9.30左右,但是培养后期处理组与对照组藻液pH并无显著差异。在测定藻液虾青素含量时,仅HS处理组虾青素含量略高于对照组,但并无显著差异;通过计算单个藻细胞虾青素含量发现DBQ处理组单个藻细胞虾青素含量显著高于对照组。     

温度对雨生红球藻叶绿素荧光特性及虾青素含量的影响

研究了不同温度(5～35℃)对雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)叶绿素荧光特性及虾青素含量的影响.测定的主要参数有:PSII的最大光能转化效率(Fv/Fm)、PSII的潜在活性(Fv/Fo)、PSII的实际光能转化效率(ΦPSⅡ)、光合电子传递效率(ETR)、细胞密度、叶绿素相对含量以及虾青素含量.单因子方差分析结果表明:在整个培养周期中,温度对雨生红球藻各叶绿素荧光参数、叶绿素相对含量、细胞密度以及虾青素含量均有显著影响(P<0.05).多重比较结果表明,在本实验条件下,雨生红球藻的最适生长温度是20℃,其单位体积虾青素含量以20℃处理组为最高,而单个细胞中的虾青素含量则以5℃和30℃为最高.相关性分析结果表明:培养天数为3～10天时,叶绿素相对含量与细胞密度均成显著正相关关系.本文还初步探讨了叶绿素荧光技术在筛选耐高温或耐低温微藻品系中的应用.     

钝顶节旋藻高产藻株的诱变选育

本文运用亚硝基胍(Nitrosoguanidine,NTG)诱变,并结合乙酰辅酶A羧化酶抑制剂喹禾灵筛选,获得了2株能够稳定遗传的高产钝顶节旋藻突变株623-8和623-16。与钝顶节旋藻出发株623相比,突变株的藻丝更长,更易聚集成团。在pH=8.5、光照强度45μmol·m-2·s-1和培养温度28℃的条件下,突变株623-8和623-16的生物量分别比出发株提高67.86%和46.43%。蛋白含量分别比出发株623提高1.98%和0.84%;脂类含量提高8.54%和4.88%;乙酰辅酶A羧化酶活性提高31.82%和11.36%。研究结果表明,以亚硝基胍诱变结合喹禾灵筛选,可筛选出生长速度快、蛋白含量高等性状优良的钝顶节旋藻藻株,在工业生产中有实用意义。     

雨生红球藻虾青素合成关键酶的原核表达及纯化

雨生红球藻是天然虾青素的重要来源,在胁迫条件下积累虾青素含量能达到细胞干重的5%。八氢番茄红素合成酶(PSY)、β-胡萝卜素酮化酶(CRTW)和β-胡萝卜素羟化酶(CRTZ)是雨生红球藻虾青素合成的关键酶,本研究分别以雨生红球藻的DNA和cDNA为模板,克隆了这三个基因,并构建不同的原核表达载体pET-24a-crtw,pET-24a-crtz,pET-24a-psy。转化大肠杆菌Rosetta感受态,经IPTG诱导后,SDS-PAGE和western blotting结果显示三种重组蛋白都能够正常表达,利用6×His标签对重组蛋白进行纯化能得到相对单一的条带,相对于纯化前目的条带明显加深。ELISA检测重组菌株E.coli RZ,E.coli RW,E.coli RP中的酶活性分别为3.0,10.5,10.0 IU/L,纯化后酶活性显著提高,分别为125.5,124.7,118.0 IU/L。本研究获得了这三种酶的活性重组蛋白,为其功能分析和抗体制备奠定了基础。     

不同激素配伍对雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)细胞生长和虾青素累积的调节作用、藻株差异及应用

利用生长素(NAA、3-IBA)和细胞分裂素(6-BA、kt)两类植物激素,对比研究了其不同配伍对4株雨生红球藻H0、H2、H3和H4细胞生长以及虾青素累积的调节作用.结果表明,尽管在不同株系之间存在一定的差异,但激素明显促进该藻细胞生长和虾青素累积,而对细胞大小没有产生明显影响.激素对红球藻细胞数量的增加主要是靠加快游动细胞阶段无性繁殖过程来实现的:而激素对虾青素含量的提高却是通过增加细胞数量和细胞内虾青素积累的协同作用结果,其中以细胞数量的增加为主.在激素单因素实验中,3-IBA对H0细胞生长增加效果最好,对H2、H3细胞生长增加效果较好的是kt,对H4细胞生长增加效果最明显的是NAA.与空白对照组相比,上述激素处理后细胞生长速度分别提高了1.95、1.54、4.25和1.78倍.经过激素多因素实验,H0、H2、H3和H4藻株的细胞生长增加效果分别是空白组的1.44、2.62、2.52、1.07倍,而虾青素含量分别为空白组的1.09、1.61、1.37、2-35倍.根据4株藻株的实验结果以及综合考虑各激素的市场价格,建议在规模化生产中,采用1.75mg/NAA和4mg/L 3-IBA以提高红球藻的培养效果.     

雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)破壁方法对虾青素提取率的影响

采用匀浆法、冻融温差法、超声波法、直接研磨法和低温研磨法等5种破壁方法,研究了雨生红球藻提取虾青素时破壁方法对虾青素提取率的影响。结果表明,对雨生红球藻进行破壁是必要的。其中匀浆法、冻融温差法、超声波法、直接研磨法和低温研磨法等的最佳破壁条件为:匀浆法破壁时间22min,水为介质;冻融温差法破壁温度为-70℃,时间为12h,冻融2次,水为介质;超声功率400W,每次超声时间5s,共超声25min;直接研磨法研磨时间1min;加液氮低温研磨法破壁2次,每次时间0·5min;虾青素的提取率依次为0·76%、0·93%、1·03%、1·51%和3·21%。匀浆法和超声波法破壁由于要使用溶剂或介质,对后续的虾青素提取和分离会有影响,而直接研磨法在破壁过程中产生高温,降低了虾青素的生理活性,所以它们都不是雨生红球藻破壁的最佳方法。加液氮低温研磨法在破壁过程中不添加化学试剂,不产生污染,能最大限度地保留虾青素的生理活性,是所选方法中最好的一种。     

雨生红球藻细胞转化、虾青素积累与光照强度的关系及不同品系间的差异性

于2004年利用3个品系的雨生红球藻(H0、H2和H3)和以去除营养物质的藻液为实验对象,探讨了光强对细胞转化和虾青素积累的影响。结果表明,光照强度对红球藻虾青素积累和细胞转化有显著影响,并在品系间存在一定差异性。其中:品系H0在光强≤25000lx时虾青素积累量随光强的增加而增加,光强在20000～35000lx时虾青素积累量处于较高水平,而光照强度>35000lx时,虾青素积累量随光强的升高而下降;H2品系在光强≤25000lx时虾青素积累量随光强的增加而增加,光强在25000lx左右时虾青素积累量较高,当光强≥35000lx时,虾青素积累大幅度下降;H3品系在≤35000lx时虾青素积累量随光强的升高而增加,20000~45000lx为虾青素积累较适宜的光强,高于45000lx时虾青素积累量则明显下降。进一步分析得出,弱光导致红球藻虾青素含量较低是光照强度不足、细胞内虾青素含量少的结果,而强光下虾青素含量下降则是细胞受到损伤、细胞数量减少导致的。对比研究发现:在较低光强下(20000~25000lx)H2单个细胞内虾青素积累量略低于H0,但其积累虾青素总量却最高,这是由于此时H2不动细胞增长速率比其它品系高造成的,不过适宜H2积累虾青素的光照范围最窄,它对高光强的耐受性也最差;而H3在较低光强下虾青素积累总量及单个细胞内的积累速率均最低,但是它的适宜光照范围最宽,即对高光强的耐受性最强,在较大的光强波动范围内都可以保证较高的安全转化量,这就使得它在较高的光强下虽然单个细胞积累虾青素的速率仍然最低,积累总量反而显著高于其它两个品系。     

利用光生物反应器培养雨生红球藻的研究初探

用光生物反应器与光照培养箱两种培养容器培养雨生红球藻(Haematococcus pluvialis),对雨生红球藻在两种容器培养过程中细胞生长、pH值、溶解氧(DO)及虾青素积累情况进行比较,同时比较不同接种密度对光生物反应器培养效果的影响。实验表明,光生物反应器中藻细胞的调整期较短,接种1 d后即进入指数生长阶段,在胁迫阶段则仅需4 d即达到虾青素含量的峰值;将pH值控制在偏碱性条件下(7.75±0.10)有利于藻细胞更好生长;营养培养阶段DO相对饱和度上升至80%,而在胁迫阶段则迅速降低,最低值小于6%;较高的接种密度(2.3×104个/mL)具有较短的营养培养周期(7 d),且因接种密度变化对胁迫周期长短无明显影响(均为4 d),选用较高的接种密度可望降低工业生产成本。     

亚硝基肌(NTG)对雨生红球藻的诱变效应

用浓度分别为0，0．5，1，1．5，2，2．5，3，3．5g／L的亚硝基胍(NTG)处理雨生红球藻(Haematococcus Pluvialis)，处理后的藻细胞分别置于100mL三角烧瓶培养，3d后用细胞计数测定抑制率。结果表明，NTG浓度为2．5g／L时生长K值最大，为0．389；藻液的细胞干质量最大．为0．711g／L；虾青素含量也最多，为1．86975 mg／L，之后随着浓度的增加反而下降。     

雨生红球藻β-胡萝卜素酮化酶基因在莱茵衣藻叶绿体中的表达

雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)的β-胡萝卜素酮化酶是虾青素生物合成途径中关键酶之一,本研究通过基因枪法将克隆出的β-胡萝卜素酮化酶基因(bkt),转入莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的叶绿体中,经过含100mg/L壮观霉素固体培养基筛选得到转化子。通过PCR和基因组酶切Southern杂交分析,证明bkt基因通过同源重组定点整合到转化子的叶绿体基因组中。进一步通过RT-PCR和RT-PCR Southern杂交分析,表明bkt在衣藻转化子中得到表达。     

α-酮戊二酸及其钠盐对雨生红球藻生长和虾青素积累的促进作用

雨生红球藻是已知虾青素(astaxanthin, AST)含量最高的生物,是理想的细胞制备工厂。尽管研究表明添加α-酮戊二酸(OG,α-oxoglutarate)能有效促进混养条件下雨生红球藻AST积累,但在自养条件下是否也有类似效果不清楚。研究以自养雨生红球藻为对象,在正常(CK)、高光(HL)、缺氮(DN)和高光-缺氮双重逆境(HL-DN)下从细胞生长和AST积累两方面评估OG及其钠盐(OG-2Na)的促进作用。结果显示,添加OG或OG-2Na显著缓解HL、DN和HL-DN胁迫对细胞生长的抑制作用,培养至6 d的生物量分别为0.58、0.53和0.38 g/L,约是未添加组的2.0倍。添加OG或OG-2Na显著促进AST积累。培养至6 d,在HL、DN和HL-DN下, AST含量分别达到13.62、19.51和28.29 mg/g,是未添加组的2.39、1.16和1.35倍。同时在胁迫条件下,添加OG或OG-2Na有效提高单位细胞中AST含量。针对OG和OG-2Na添加,最大单位细胞AST含量分别出现在HL和HL-DN条件下,达到53.72和60.58 pg/cell,是对照的3....