青岛文昌鱼肌球蛋白重链基因片段的重组表达

将青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)肌球蛋白重链基因片段亚克隆到pET-30a质粒,构建出重组表达载体并转化入大肠杆菌Escherichia coli BL21中.经SDS-PAGE和Western杂交检测表明,在IPTG诱导下含有重组载体的菌株可表达分子质量约30 ku的融合蛋白.诱导条件优化实验结果显示,该菌株经0.2 mmol/L IPTG诱导1 h就可大量表达此蛋白.可溶性实验确认该重组蛋白是可溶性蛋白.本研究为文昌鱼肌球蛋白重链特异性抗体的制备奠定了基础.     

团头鲂(Megalobrama amblycephala)两种热休克蛋白 70(HSP70s)的原核表达、纯化及鉴定

采用PCR方法扩增团头鲂组成型HSC70和诱导型HSP70基因完整的编码区片段,并分别克隆到原核表达载体pET-22b(+)中,然后转化大肠杆菌BL21(DE3),用1mmol/L IPTG在不同温度及时间下进行诱导表达。采用Ni-NTA His Bind Resins亲和层析和DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱层析对目的蛋白进行纯化,并进行SDS-PAGE和Western-blotting分析。结果表明,成功构建了团头鲂两种重组表达质粒pET-22b(+)/Ma-HSC70和pET-22b(+)/Ma-HSP70,表达融合蛋白的相对分子量均约为72kDa,并能与兔抗人HSP70多抗进行特异性结合,这两种HSP70s融合蛋白经纯化后的纯度均达到95%以上。本实验选择融合蛋白Ma-HSC70在25℃和Ma-HSP70在30℃下分别诱导7h作为可溶性表达的最佳条件。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)生长激素体外重组表达及活性分析

根据半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)生长激素(GH)基因的c DNA全长序列设计引物克隆得到其全长552个碱基成熟肽序列。利用RT-PCR方法将扩增片段克隆到原核表达载体p ET-28a上,实现了GH成熟肽在大肠杆菌BL21(DE3)中的融合表达。融合蛋白分子量为26 k Da,在IPTG诱导4h时目的蛋白表达量最高,占细菌总蛋白的41.5%,主要以包涵体形式存在。Western-blotting分析表明GH融合蛋白可特异性地被6×His抗体识别。诱导表达后的菌液沉淀经纯化和复性后,获得大小为26 k Da的纯化GH融合蛋白。以ELISA方法检测纯化后的GH融合蛋白显示其具有免疫学活性。本研究为认识半滑舌鳎生长轴的调控机制提供了基础资料。     

鳗弧菌膜绑定溶胞壁质转糖酶MltD的表达纯化及生物信息学分析

本研究将新发现的鳗弧菌毒力相关基因mltD(膜绑定溶胞壁质转糖酶基因)克隆于表达载体pET-32a(+),在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并以镍琼脂糖亲和层析柱纯化表达的融合蛋白;经SDS-PAGE分析,纯化的融合蛋白为单一条带,分子量约为70.2 kDa,与理论预测值相符。生物信息学分析表明,鳗弧菌MltD由523个氨基酸组成,与其他弧菌的MltD氨基酸序列有较高的相似性;二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主;功能区包括N端的信号肽区域、1个糖基转移酶结构域和C端的3个溶解酶结构域;蛋白的N端具有一段脂蛋白信号肽,信号肽外的其他部分为非细胞质蛋白。鳗弧菌MltD蛋白为亲水性;不稳定系数为27.40,属于稳定性蛋白;整个蛋白分子共有24个可能的抗原决定簇,具有较强的抗原性。推断MltD蛋白为1种外周膜脂蛋白,在弧菌中相对保守,抗原性强,可应用于抗弧菌病疫苗的开发研制。     

重组别藻蓝蛋白(rAPC)的纯化与鉴定

报道了重组大肠杆菌表达的别藻蓝蛋白的下游生产工艺研究,并对产物进行了分析鉴定。工程菌株P1先在NBSBioFlo3000型5L自动发酵罐进行高密度发酵,融合蛋白获得了高效表达,且主要在细胞内以可溶形式存在。纯化前先将获得的菌体超声破碎,然后经硫酸铵沉淀、疏水层析和离子交换层析三步纯化,接着对纯化的重组别藻蓝蛋白(rAPC)进行SDS-PAGE、PAGE、Westernblot等电点分析。证明已获得纯度为96.4%的rAPC,其等电点为6.0,并且具有与天然APC相似的抗原性。     

大黄鱼(Pseudosciaena crocea)热激蛋白的基因克隆、原核表达及抗血清的制备

应用trizol裂解法提取象山港网箱养殖大黄鱼肝脏总RNA,采用RTPCR获得大黄鱼cDNA;通过设计特异引物进行PCR扩增,将PCR产物转化到质粒并直接测序,得到1.7kb的目的基因;同时将此目的基因连接到表达质粒pSBET中,在大肠杆菌BL21中进行诱导表达以及表达产物的分析。克隆基因的表达产物经SDSPAGE分析表明,HSP基因的蛋白分子量为60kDa左右,与阅读框的编码大小一致;表达蛋白经纯化后免疫小鼠制备抗血清。Westernblotting检测结果表明,制备的抗血清与HSP蛋白起较强的特异性反应。HSP基因的系统进化分析表明,大黄鱼与非洲爪蟾最为接近,从侧面印证了脊椎动物中两栖纲动物与鱼纲动物的亲源关系。通过大黄鱼HSP基因的提取和分析,可为以后制备出核酸探针、筛选和克隆出一批具有优良性状的基因、构建基因文库等研究工作奠定基础。     

一种新的海洋微藻病毒丝氨酸蛋白酶基因的克隆表达及其活性分析

从海洋球石藻Emiliania huxleyi病毒EhV99B1的基因组中克隆了丝氨酸蛋白酶(Sp)基因(GenBank登录号:KC161207),对该基因的开放阅读框(ORF)进行系统的生物信息学分析,并在大肠杆菌中融合表达,通过亲和层析法获得了纯化的重组Sp。结果表明:EhV99B1-Sp基因的ORF为1 110bp,编码368个氨基酸,蛋白相对分子质量为39.5kDa;该基因片段与GenBank中EhV86-Sp的同源性很高,核苷酸及其对应的氨基酸序列同源性分别为95%和97%,而与其他物种Sp序列的同源性仅为28%~32%,说明其可能是丝氨酸蛋白酶家族中的一个新成员;预测的二级结构特征显示EhV99B1-Sp的蛋白结构域中具有典型的LTAGHC(组氨酸活性位点区域)和AICNGDSGGPLF(丝氨酸活性位点区域)两个丝氨酸蛋白酶催化活性位点的氨基酸基序,是一个两次跨膜蛋白;将该基因在大肠杆菌中进行低温诱导表达,得到分子量为60kDa的重组蛋白,经鲤鱼肌肉丝氨酸蛋白酶(MBSP)抗体检测证实为Sp,且重组蛋白在大肠杆菌细胞中具有明显的生物学活性。本研究结果为进一步探讨EhV99B1-Sp在病毒与宿主相互作用过程中的调节作用及其功能与应用奠定基础。     

牙鲆芳香化酶Cyp19a多克隆抗体制备及其应用

芳香化酶Cyp19a在鱼类性别决定和性别分化中起关键作用,通过调控体内雌、雄激素的转化来影响鱼类性别表型形成。为深入研究Cyp19a在牙鲆(Paralichthys olivaceus)性腺分化和发育过程中的表达规律及作用机制,本文从牙鲆cDNA中克隆获得1557bp的cyp19a基因编码序列,并成功构建了原核重组表达质粒。经体外重组与纯化获得较高纯度的重组Cyp19a蛋白;以此作为抗原免疫兔子,制备多克隆抗体。用间接酶联免疫吸附剂测定(ELISA)技术检测抗血清效价,评估其免疫原性。结果表明免疫结束后得到的抗体血清效价超过了1∶50000,且纯化后抗体具有较好活性。Western Blot(WB)检测结果表明Cyp19a兔多抗可以特异性识别牙鲆重组Cyp19a蛋白和内源性Cyp19a蛋白。蛋白水平的雌雄性腺差异表达分析显示,牙鲆Cyp19a蛋白在卵巢中高表达,在精巢中微量表达。利用Foxl2和Dmrt1重组蛋白处理牙鲆性腺分化期幼鱼可分别显著上调和下调Cyp19a的表达(P<0.05)。综上所述,本研究成功制备了牙鲆Cyp19a多克隆抗体并进行了应用,为深入研究牙鲆等鱼类性别分化机制提供有力工具。     

鳜(Siniperca chuatsi)生长激素基因克隆和原核表达

采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从鳜脑垂体总RNA中扩增生长激素(GH)成熟肽基因,将成熟生长激素的cDNA定向克隆到表达载体pET-32a(+),并转入大肠杆菌BL21(DE3)中。结果表明,鳜生长激素(GH)基因含开放阅读框(ORF)615个核苷酸,编码204个氨基酸,蛋白分子量为23kDa,等电点为7.07,其中酸性氨基酸占10.78%,碱性氨基酸占12.74%,疏水氨基酸为占44.12%,极性氨基酸占32.35%。在IPTG终浓度1.0mmol/L、温度37℃和培养时间4h的最佳诱导表达条件下,鳜生长激素基因(GH)在大肠杆菌中获得高效表达,重组菌体裂解物经SDS-PAGE可检测到分子量约为43kDa的鳜生长激素与硫氧还蛋白(Thioredoxni,Trx)融合蛋白,其表达量约占菌体总蛋白58%。Western印迹分析也证实含6×His标签的重组融合蛋白能够很好地与抗6×His单抗发生反应。本研究为下一步鳜生长激素基因(GH)的生物学功能及应用奠定了基础。     

牙鲆多聚免疫球蛋白受体基因的克隆、表达及鉴定

采用PCR扩增、构建重组高效表达载体的方法,进行了牙鲆多聚免疫球蛋白受体(pIgR)基因的克隆、原核表达研究,并利用SDS-PAGE、western-blot及ELISA方法对纯化的重组蛋白特性进行了分析。结果表明,PCR扩增出pIgR开放阅读框(ORF)基因全长为1005 bp,所构建的pET-32(a)-pIgR重组质粒经PCR和双酶切鉴定含有ORF全长基因。SDS-PAGE结果表明,表达的目的蛋白相对分子质量为58 kDa,与理论预期值一致,IPTG诱导6h后表达量趋于稳定,经亲和层析纯化得到高纯度的重组蛋白。Western-blot结果表明,重组pIgR能够与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性反应;ELISA结果表明重组pIgR能够与牙鲆IgM发生特异性结合。本研究获得了纯化的重组pIgR,证明其具有IgM结合活性,为下一步研究牙鲆pIgR的转运机制及在黏膜免疫防御中的作用机理提供了分子基础。     

对虾白斑综合症病毒核衣壳蛋白WSV308的鉴定

结合SDS—PAGE电泳和质谱分析，发现了一分子量为51kDa的蛋白，它是对虾白斑综合症病毒基因ORFwsv308的表达产物．将wsv308克隆到pET—His表达载体，以E．coliBL2l为宿主菌，成功表达并纯化目的蛋白后制备抗体。Western blot实验中蛋白特异抗体只与完整的病毒和核衣壳裂解蛋白中的WSV308反应，而不和膜蛋白反应，证明wsv308所编码的蛋白在完整病毒颗粒上定位于核衣壳．免疫电镜定位中金颗粒只特异地标记在核衣壳表面上，不存在于完整病毒表面上．     

产新琼四糖的海洋微泡菌属AG1热稳定性β-琼胶酶的过量表达与鉴定

从微泡菌属AG1（Microbulbifer sp. AG1）克隆得到1302 bp大小的琼胶酶基因,该基因编码产物为一个成熟蛋白（413个氨基酸残基）外加一个信号肽（20个残基）。将不含信号肽片段的琼胶酶在E. coli BL21 （DE3）中进行了异源表达和纯化。使用琼脂糖作为底物,该重组琼胶酶的最适反应温度和pH分别为60℃和7.5。该重组酶表现出优良的热稳定性,在50℃和60℃下处理1 h,重组琼胶酶仍能分别保持67%和19%的残余酶活力。除了SDS,重组琼胶酶对于其他测试的抑制剂、去垢剂和尿素变性剂有着较好的抗性。利用薄层色谱和以对硝基苯-α/β-D-吡喃半乳糖苷为底物的酶活力分析结果表明,该重组琼胶酶为β型琼胶酶,它水解琼脂糖的主要终产物为新琼四糖,而且不同聚合度的酶解产物具有抗氧化活性。     

湛江硇洲岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri)的食性研究

于2006年4~7月在湛江硇洲岛海域采集文昌鱼,进行春夏季节不同性别、不同体长组等的胃含物观察分析。结果表明,湛江硇洲岛文昌鱼消化道残留食物成分以泥沙碎屑为主,可辨生物成分有34种,大部分为底栖硅藻,占58.8%,也有少量甲藻、瓣鳃类幼虫、底栖桡足类幼虫和原生动物等。春夏季节的文昌鱼的摄食喜好不尽相同,饵料生物的出现率随着季节的变化有所变化。不同性别文昌鱼的摄食喜好比较相近。文昌鱼到了性腺成熟后才开始进食动物性食物。研究结果表明,文昌鱼摄食藻类、微生物等而自身转化为其他动物的较高营养层次食物,在海洋食物网中具有一定的重要作用。     

文昌鱼幼体体腔、血管发育的初步研究

本文研究了24,48h文昌鱼幼体体腔、血管的发育状况,旨在为研究文昌鱼体腔细胞、粒细胞的起源和分化提供依据。1　材料和方法1.1　实验材料青岛文昌鱼(BranchiostomabelcheriTsingtauense)24,48h幼体。1.2　方法文昌鱼幼体经2.5%戊二醛(0.1mol/L二甲砷酸钠配制,pH7.3)固定1h,1%锇酸固定1h,然后经系列酒精脱水,Epon812包埋。半薄切片(2μm)经碱性美蓝-品红染色[1],光镜观察、照相。半薄切片定位的样品经超薄切片,醋酸双氧铀、柠檬酸铅染色,JEM-100cx电镜观察、照相。2　结果2.1　光镜观察结果青岛文昌鱼卵子在室温条件下自受精后50～60min…     

Protective immunity of orange-spotted grouper(Epinephelus coioids) against a nervous necrosis virus isolated from China,and determination of the complete sequences of the virus

1 IntroductionNervous necrosis virus( NNV) is one of theworldwide pathogens in cultured species and breed-ing from the late 1980s (Bovo et al.,1999; Tan etal., 2001; Breuil et al., 2001; Munday et al.,2002; Lin et al., 2001). The virus is isometric andnon…     

水温对文昌鱼生殖活动的影响及其内分泌机制

采用慢性实验方法,研究在不同水温条件下饲养性腺发生前的文昌鱼(Branchiostoma belcheri)对其性腺分化和发育的影响。另外,在繁殖季节研究在低温16℃、中温22℃和高温28℃下饲养性成熟的文昌鱼对其产卵和排精的影响。同时,采用免疫组织化学方法对几种生殖相关激素在不同发育期文昌鱼的生殖调控轴(脑-哈氏窝-性腺)中的分布进行免疫识别,并用磁酶免定量测定方法检测睾酮和17 β-雌二醇在文昌鱼性腺中的含量,以分析和探讨水温影响文昌鱼生殖活动的内分泌机制。结果表明:低温有利于文昌鱼性腺向雌性分化,雌雄比例为4.2:1,中温和高温组则不受影响,雌雄数量大致相等。高水温则有利于文昌鱼的精巢发育和生精活动。28℃海水适于文昌鱼的产卵和排精。根据免疫组织化学和磁酶免定量测定的结果分析提示,温度影响文昌鱼性别分化和发育以及繁殖活动的内分泌机制是:首先水温经皮肤或哈氏窝化学感受器,刺激神经系统(脑泡)释放GnRH。然后GnRH促进哈氏窝分泌LH,从而可能刺激性腺产生和分泌性类固醇激素,始动文昌鱼性腺的发育至成熟及其生殖活动。此外,脑中芳香化酶可能介导文昌鱼性别分化。     

文昌鱼胚胎整装荧光原位杂交技术的建立

文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)是进化发育生物学研究的重要模式生物,文昌鱼胚胎整装荧光原位杂交(WFISH,whole-mounted fluorescent in situ hybridization)技术将有助于鉴定文昌鱼胚胎发育过程中具有重要调控作用的功能基因。报告了文昌鱼胚胎整装荧光原位杂交技术,用以快速灵敏分析特定基因在文昌鱼胚胎发育过程中的时空表达图式。用体外转录合成的地高辛标记文昌鱼FGFR基因的反义RNA探针,检测到FGFR在文昌鱼原肠胚中表达于发生内陷的中内胚层细胞中,而预定发育为外胚层的细胞不表达FGFR。     

白斑综合症病毒基因组同源重复区结合蛋白WSSV021的鉴定

利用噬菌体展示技术,发现wssv021是与病毒基因组同源重复区中一个包含高度保守结构域的小重复片断DNA结合的蛋白质的编码基因,可能参与病毒复制或调控.时相转录分析发现,wssv021属于病毒感染的早期基因.将wssv021基因克隆到pQE-30表达载体,在E.coliXL1-Blue中进行融合表达.凝胶阻滞分析显示,体外表达的（His）6-WSSV021蛋白可以和同源重复区中小重复片断DNA特异性相互作用.     

重组七鳃鳗PHB2蛋白的原核表达及纯化

为了研究PHB2蛋白的生物学活性及后续抗体的制备,作者以前期构建的p MD18-T-Lm-PHB2质粒为模板,PCR扩增Lm-PHB2基因全长CDS区,PCR产物经Hind III和Eco R I双酶切后连接至表达载体p ET-32a,构建重组质粒p ET-32a-Lm-PHB2。将鉴定正确的重组质粒转化入大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta Blue,经IPTG诱导表达后,表达产物通过SDS-PAGE和Western blotting进行检测,利用镍柱亲和层析纯化得到纯度较高的目的蛋白r Lm-PHB2。结果表明,经PCR、双酶切和测序鉴定,所构建的重组质粒p ET-32a-Lm-PHB2序列正确,表达产物存在于裂解菌液的上清和沉淀中,经SDS-PAGE和Western blotting证实在约47 ku处有目的蛋白r Lm-PHB2的表达条带。本研究构建了重组七鳃鳗(Lampetra japonica)PHB2蛋白的原核表达载体,并大量表达和纯化目的蛋白,为该蛋白后续的抗体制备及生物活性研究奠定了基础。     

厦门文昌鱼人工繁殖和幼虫发育及其变态的研究

用组织学和胚胎学方法对厦门国家级自然保护区文昌鱼的生殖季节、胚胎发育和幼虫培育进行详细研究,结果表明,自然保护区文昌鱼生殖季节可分为两个繁殖时期,从6月初开始至7月初为繁殖高峰期,8和9月为繁殖小产期.观察人工繁殖得出,文昌鱼(Branchiostoma belcheri)产卵时间在傍晚19:00前后,可以观察到雌、雄文昌鱼的产卵和排精行为:雄性文昌鱼先离开沙,并跃出水面快速游动和排精,接着雌鱼也跃出水面,所有的卵通过破裂的性腺壁进入到围鳃腔并通过围鳃孔到水中受精,受精率在98.5%以上,还观察了文昌鱼幼虫发育并变态为幼鱼(长度为1.05～13.5mm)的全过程.