有机磷农药对海洋动物乙酰胆碱酯酶(AChE)的毒性效应研究进展

近几十年来，农业和海水养殖业所使用的有机磷农药(OPs)造成沿岸海水的严重污染，威胁到海洋动物的生存。有机磷农药的海洋生态毒理学研究已经成为海洋环境科学中的热门领域之一。作为动物神经传导过程中的关键酶，乙酰胆碱酯酶(AChE)能够被有机磷农药专一性抑制，因此，有机磷农药对海洋动物AChE的影响受到更多的关注。本文以近年来该领域的研究成果为基础，综述了有机磷农药对海洋动物乙酰胆碱酯酶的毒性效应。     

海鱼AChE监测海水有机磷农药的可行性研究

有机磷农药(OPs)对乙酰胆碱酯酶(AChE EC 3.1.1.7)具有专一性抑制作用,因此AChE常作为淡水和土壤OPs污染的特异性标识物(biomarker).本文在海水背景下,通过测定两种有机磷农药(马拉硫磷和甲基对硫磷)对海洋鱼类-鲈鱼[Lateolabrax japonicus(cuvier)]脑组织AChE的抑制效应,分析了海鱼AChE监测海水OPs的可行性.结果显示,抑制时间为20min时,抑制程度达到相对稳定;在低浓度OPs抑制下,纯酶液比粗酶液表现出更好的敏感性,对马拉硫磷和甲基对硫磷的灵敏度分别达到0.28μg*L-1和0.2μg*L-1;在一定浓度范围内,AChE活力对OPs具有显著的线性响应.研究表明,利用鲈鱼AChE指示和监测海水OPs的微污染是完全可行的.     

大泷六线鱼(Hexagrammos otakii)荧光AFLP分析体系的建立及优化

以大泷六线鱼为材料,通过对DNA提取质量和浓度、EcoR Ⅰ/MseⅠ酶切反应时间、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度以及选择性扩增中预扩增产物稀释倍数等关键因素进行研究,建立并优化了大泷六线鱼荧光AFLP分子标记反应体系.用优化的反应体系,筛选到10对适合大泷六线鱼的引物,为今后利用AFLP标记技术进行大泷六线鱼...     

青岛近海欧氏六线鱼(Hexagrammos otakii J & S)年龄和生长的研究

利用耳石作为欧氏六线鱼年龄鉴定材料,结果表明耳石上的轮纹每年形成一次,即年轮。主要形成期是10月至翌年2月。提出耳石径与体长的关系式、体长和体重的关系式。指出相对增长率和生长指标反映了生长各阶段的特点。并给出生长参数。     

栉孔扇贝(Chlamys farreri)中抗氧化肽的分离纯化及性质研究

以栉孔扇贝内脏团为原料,对其中抗氧化肽的制备、纯化及性质进行了研究。首先采用硫酸铵沉淀、DEAE-Sephadex A-50阴离子交换层析的方法,进行了扇贝提取蛋白的制备,其次采用海洋蛋白酶YS-80水解、SephadexG-25凝胶层析的方法,进行扇贝抗氧化肽的制备,获得多肽粗品(海洋肽,PCF),并进一步采用CM Sepharose阳离子交换层析和反相高效液相色谱的方法,对扇贝抗氧化肽进行了纯化,结果得到组分PCF-3A,反相高效液相显示为单一峰。采用茚三酮反应、Sephadex G-15凝胶层析和AccQ.Tag氨基酸分析柱,进行了PCF-3A的理化性质研究。结果表明,茚三酮反应呈阳性;分子量约为794D;由7种氨基酸组成,分别为天冬氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、赖氨酸和脯氨酸。采用邻苯三酚自氧化体系和Fenton反应体系对PCF-3A的抗氧化活性进行了研究,发现该肽可有效清除羟自由基和超氧阴离子,半抑制浓度(IC50)分别为0.39mg/ml和2.85mg/ml,具有明显的抗氧化、抗衰老作用。     

富硒海洋球石藻(Emiliania huxleyi)的培养及其硒蛋白的初步分离纯化

在不同浓度亚硒酸钠(Na2SeO3)条件下培养海洋球石藻,分析其生长和富集硒情况,并采用(NH4)2SO4分级盐析、DEAE-Sepharose离子交换柱层析和SephacrylS-200凝胶过滤层析方法,对球石藻硒蛋白进行了初步分离纯化。结果表明,在本实验条件下,不添加外源硒的f/2培养基本底硒浓度(约3.2nmol/L)为海洋球石藻最佳生长和富硒的硒浓度,其细胞内硒含量可达到6475?g/g干重。离子交换和凝胶层析分离的含硒蛋白结合的最高硒含量分别达到392.3ng/mg和663.5ng/mg蛋白。SDS-PAGE纯度鉴定显示,在分子量分别约为41.3kDa和30.1kDa处各有单一电泳条带。结果提示,海洋球石藻能在环境硒浓度极低的条件下大量吸收硒并将大部分无机硒转化为硒蛋白。富硒能力较强的海洋球石藻有望作为一种新的有机硒资源,对开发含硒安全性食品具有很大的应用潜力。     

仿刺参(Apostichopus japonicus)和海地瓜(Acaudina leucoprocta)体壁多肽的响应面法酶解和N末端测序

为充分开发利用海参资源,优化海参体壁酶解工艺,鉴定海参多肽,本文以水解度为指标,设计了3因素(时间、温度和加酶量)3水平的响应面实验,得到海参水解的最优条件是:仿刺参(Apostichopus japonicus)体壁在加酶量1.97%、温度55.7°C、水解136.8min的条件下,水解度为83.39%;海地瓜(Acaudina leucoprocta)体壁在加酶量1.70%、温度55.4°C、水解115.6min的条件下,水解度为63.68%。之后通过使用超滤膜、反相高效液相色谱(RP-HPLC)、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)技术和蛋白测序仪等分析手段从水解产物中分离鉴定出4种多肽。其中,经N端序列鉴定出仿刺参多肽S1、S2氨基酸残基序列分别为Gly-Pro-Val-Gly-Ala-Ser-Gly-Pro-Gln-Gly-ProGln-Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Ser-Ala-Leu和Trp-Pro-Pro-Gly-Asn-Ser-Gly-Ile-Gln-Gly。海地瓜多肽A1和A2氨基酸残基序列分别为Gly-Ala-Asn-Gly-Asn和Trp-Leu-Pro-Gly-Asp-Thr-Gly-Pro-Gln-GlyVal-Thr-Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Ala-Gly。     

鱿鱼(Squid)肝脏蛋白酶解物中ACE活性抑制肽的分离纯化及活性分析

为提高鱿鱼加工下脚料的利用率,以秘鲁鱿鱼肝脏为研究对象,采用生物酶解技术和凝胶蛋白分离技术等对其进行研究。研究结果表明:鱿鱼肝脏蛋白酶解液经过超滤处理后(分子质量为20k Da),用Sephadex G-100初步分离,得到五个组分,对分离的组分进行研究,结果表明降血压活性能力最强的是组分二,测定其半抑制浓度(IC50)为1.8mg/m L。对组分二进行活性条件分析,结构表明其ACE抑制活性在温度0—100°C、p H 1—12之间基本没有变化。最后用DEAE阴离子交换柱和Sephadex LH-20对组分二继续分离纯化,得到组分六和组分七,测定其半抑制浓度(IC50)分别达到1.52 mg/m L和2.16 mg/m L。本研究可为利用鱿鱼加工下脚料开发降血压活性肽产品提供理论基础。     

基于UF、GFC及RP-HPLC的长牡蛎(Crassostrea gigas)蛋白抗衰老小分子活性肽(Zel'ner)的纯化及结构解析

牡蛎肉质鲜美,营养丰富,具有很高的食用价值。本研究以舟山长牡蛎(Crassostreagigas)为研究对象,以DPPH自由基清除率为测试指标,通过UF、GFC及RP-HPLC等技术,对牡蛎蛋白酶解液进行分离纯化,获得牡蛎蛋白小分子肽样品,并对其氨基酸组成进行营养性评价。研究结果表明:浓度为30%—100%的硫酸铵处理酶解液的分离效果明显优于低于浓度为30%硫酸铵的分离效果,其DPPH自由基清除率达到52.43%;纯化后得到两种牡蛎蛋白小分子肽分别标记为组分a(Mw1kDa)和组分b(1kDaMw3kDa);组分a中牡蛎蛋白小分子肽分子量分布主要为1995.2Da、1258.9Da、1023.3Da、398.1Da;对牡蛎蛋白小分子肽组分a进行检测,发现其中氨基酸种类及含量丰富,其中必需氨基酸(EAA)含量为18.863%,总氨基酸含量(TAA)为43.3748%,必需氨基酸占总氨基酸43.49%,必需氨基酸与非必需氨基酸(NEAA)的比例为76.95%,风味氨基酸(FAA)含量为18.9147%,占总氨基酸含量的43.61%。综上可见,牡蛎蛋白小分子肽具有极高的营养价值和市场经济效益,此研究为牡蛎蛋白抗衰老小分子活性肽(Zel'ner)的开发提供了新的思路和方向。     

南方鲇(Silurus meridionalis)豚鼠气单胞菌溶血素的分离、纯化与致病性研究

采用硫酸铵盐析、DEAE-Sephadex A50凝胶层析法对豚鼠气单胞菌的溶血素进行分离、纯化,获得分子量为32.2kDa的单一多肽溶血素,测定溶血价为25。将该溶血素倍比稀释后梯度接种南方鲇,研究其对南方鲇的致病性和组织病理损伤情况。结果表明:豚鼠气单胞菌溶血素具有较强的毒力,对南方鲇的半数致死剂量(LD50)为0.29mg蛋白/kg体重;病鱼表现为体表褪色,腹部膨大,肝、脾、肾肿大,肝、脾淤血、出血明显;胃肠道内充有大量粘液,黏膜充血、出血;组织病理学表现为骨骼肌水肿、变性,肝细胞变性、坏死,血窦扩张淤血,肾小管上皮细胞变性、坏死,脾脏淋巴细胞减少,胃肠道黏膜上皮变性、坏死,脱落。     

大泷六线鱼精巢发育的周年变化研究

为完善六线鱼的人工繁殖理论,采用石蜡切片,HE组织染色方法研究了性成熟野生大泷六线鱼的精巢结构和精巢发育的周年变化过程。结果表明,大泷六线鱼精巢为典型的小叶型结构,精小叶间有间质细胞（Leydigs cell）,小叶内有支持细胞（Sertolis cell）及精小囊结构,其精巢的周年发育历程可分为：重复发育Ⅲ期,精子形成Ⅳ期,精子成熟Ⅴ期和退化吸收Ⅵ期。8月下旬开始生精活动的启动,生殖季节为11月至翌年1月份,2～4月份为退化吸收期,5～7月份为重复发育Ⅲ期。     

大泷六线鱼仔鱼饥饿试验及不可逆点的研究

摘要：利用人工孵化得到的大泷六线鱼（Hexagrammos otakii Jordan et Starks）初孵仔鱼,在水温16±0.5℃,盐度31条件下,研究了饥饿对大泷六线鱼前期仔鱼生长的影响,并确定仔鱼的初次摄食饥饿不可逆点（PNR）。结果表明,仔鱼3日龄开口摄食,卵黄于7日龄消耗完毕,油球于8日龄消耗完毕,混合营养期为5-6天,饥饿对仔鱼卵黄吸收速度影响显著（P＜0.05）,对油球的吸收在仔鱼开口前影响不显著（P＞0.05）,仔鱼开口后影响显著（P＜0.05）。摄食仔鱼生长呈线性增加,饥饿仔鱼生长呈现先升高后降低的趋势。仔鱼饥饿不可逆点出现在8日龄和9日龄之间。     

海州湾及邻近海域大泷六线鱼的生长、死亡和最适开捕体长研究

根据2011年海州湾及邻近海域的底拖网调查资料,对大泷六线鱼(Hexagrammos otakii)的群体结构、体长-体重关系、生长、死亡和资源利用状况进行初步研究。结果表明:大泷六线鱼渔获群体体长范围为44~292mm,优势体长组为54~74mm,平均体长为88mm;体重范围为0.35~574.3g,优势体重组为10g,平均体重为17.94g;体长-体重关系为W=4.23×10-6 L3.31(R2=0.978 6,n=1 514)。应用FiSATⅡ软件中的ELEFANⅠ方法估算的von Bertalanffy生长方程参数L∞、K和t0分别为328mm、0.36a-1和-0.43a;应用FiSAT软件中变换体长渔获曲线法求得总死亡系数Z为2.06,自然死亡系数M和捕捞死亡系数F分别为0.62和1.44,开发率E为0.70。Beverton-Holt单位补充量渔获量模型分析表明,在现行捕捞死亡系数F=1.44、YW/R取最大值时对应的开捕年龄为1.83a。现阶段大泷六线鱼资源已处于过度开发状态,考虑拐点年龄、临界年龄、繁殖和经济效益等综合因素,建议将海州湾大泷六线鱼最适开捕规格定为体长191mm。     

菲律宾蛤仔碱性磷酸酶的分离纯化及部分性质研究

经Tris-HCl缓冲液浸提、硫酸铵分级沉淀盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析等步骤,从菲律宾蛤仔内脏团中分离得到碱性磷酸酶,SDS-PAGE显示为单一条带,提纯倍数为14.42,比活力达到131.08U/mg。酶学性质研究表明:该酶亚基分子量约44kD,最适反应温度为45℃,最适pH值为9.0,米氏常数Km为0.098mmol/L,最大反应速度Vmax为1.01μmol/(mL·min)。Ca2+、Mg2+对酶活力表现出显著的激活作用。     

固定化鲅鱼乙酰胆碱酯酶的制备及部分性质测定

酶的固定化是酶传感器制备过程中重要的1个环节.研究采用直接共价法固定鲅鱼乙酰胆碱酯酶（AChE）.制备方法为：0.1g CNBr活化的Sepharose 4B凝胶用1mmol/L的HCl充分溶胀后,与活力为10U的AChE溶液混合,于4℃下150r/min振荡8h.所制备的固定化酶活力回收率较高（96%）,对pH值和温度变化的适应能力均优于非固定化酶;在3个月保存期内,前者的活力损失13%,而后者的活力则下降89%.这说明固定过程能够大大提高AChE的抗逆性和保持酶活力的稳定,有利于酶传感器的制备.     

枝管藻多糖对久效磷暴露水体中鱼类保护作用的研究

以金鱼(Carassius auratus)体内超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活力、乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesteras，AChE)活力变化为指标，观察了枝管藻多糖对久效磷暴露的水体中鱼类生理功能的影响。结果表明：用枝管藻多糖灌胃鲫鱼15d，枝管藻多糖能显著降低久效磷对鱼类体内SOD活力的诱导和有效阻止久效磷对鱼类中枢神经系统AChE活性的抑制，具有拮抗久效磷农药对鱼类毒害的作用。     

温度和盐度变化对大泷六线鱼幼鱼存活与生长的影响?

研究了温度和盐度变化对大泷六线鱼幼鱼存活与生长的影响。结果表明,温度和盐度变化对大泷六线鱼幼鱼存活与生长的影响显著（p<0.05）,5月龄幼鱼存活与生长适宜水温为14～23 ℃,最适水温为17～23 ℃,在20 ℃时生长率达到峰值,为20.89 mg/d。5月龄幼鱼存活与生长适宜盐度为15～40,最适盐度为25～35,在盐度30时生长率达到最大值17.1 mg/d。     

基于FIA和光学原理的酶传感器检测海水甲基对硫磷

将乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AChE)传感器与流动注射系统(flow injection analysis system,FIA)相结合,通过光学方法测定固定化酶受农药抑制后的残余活性,对海水中微量甲基对硫磷进行定量分析。该系统的适宜工作条件为:温度30℃;固定化酶的用量0.05 U;载液流速0.45 mL/min;进样时间20 min;底物(碘化硫代乙酰胆碱)溶液浓度0.100 mol/L,注射量100μL。在0.1~100μg/L之间,农药浓度的对数值与固定化酶活性的抑制率之间具有良好的线性关系(r=0.995 3)。利用该系统检测含甲基对硫磷分别为0.8μg/L和5.0μg/L的模拟海水样品,获得了较好的准确度和精密度,平均相对误差和变异系数均小于10%。