静水压法人工诱导牙鲆(♀)×圆斑星鲽(♂)杂交三倍体的探索

开展了牙鲆(Paralichthys olivaceus)(♀)和圆斑星鲽(Verasper variegatus)(♂)杂交,通过静水压抑制受精卵第二极体的释放来诱导杂交三倍体,设计单因素分析实验,筛选出当前试验条件下的最佳诱导条件。结果表明:静水压法可成功诱导出杂交三倍体,诱导率主要受到受精后处理起始时刻、处理压强和压强处理时间3个因素的影响。静水压法的最佳诱导条件为:海水温度(15.0±0.2)℃,受精后3 min起,以70 MPa压力处理6 min。此时相对孵化率为(24.06±1.10)%,利用倍性分析仪对其进行倍性鉴定,三倍体率为(26.67±6.67)%。染色体分析表明,三倍体胚胎的染色体数目为71条,对照组二倍体胚胎的染色体数目为47条。还发现有少量染色体数目为24条的单倍体胚胎。研究结果为鲆鲽鱼类异源多倍体的培育提供了参考。     

ISSR 标记在牙鲆(Paralichthys olivaceus)与石鲽(Kareius bicoloratus)种间杂交一代的分离方式分析

利用ISSR标记对牙鲆♀与石鲽♂单对杂交亲本及其子一代(全同胞家系)的分离方式进行了研究。结果表明,8个ISSR引物共扩增出181个标记,其中116个为多态性,占总数的64.09%;标记在F1代呈三种分离方式:符合孟德尔分离比例、偏离孟德尔分离比例和异常分离。符合孟德尔分离比例的情况包括:不分离(代表了亲本基因型的5种组合:AA×AA、AA×Aa、Aa×AA、AA×aa、aa×AA);1︰1分离(代表了亲本基因型的2种组合:Aa×aa、aa×Aa);3︰1分离(代表了亲本基因型的1种组合:Aa×Aa)。偏分离的标记包括:亲本中呈多态而在子代中偏离1︰1分离的标记和亲本均有而在子代中偏离3︰1分离的标记。异常分离的标记包括:F1代出现双亲均不具备的标记和双亲或单亲有而子代却无的标记。3种分离位点出现的频率和数量分别为:82.87%、150,11.05%、20,6.08%、11;双亲共有标记中85.33%的不发生分离,单亲特有标记中28.57%—35.85%发生正常分离,该研究结果可为进一步利用该群体构建牙鲆和石鲽遗传连锁图谱奠定良好的工作基础并提供一定的理论依据。     

RAPD对圆斑星鲽和条斑星鲽养殖群体的遗传多样性研究

应用RAPD分子标记技术对圆斑星鲽(Verasper variegatus)和条斑星鲽(Verasper moseri)的养殖群体进行群体遗传多样性分析.每个群体各取鱼30尾,并从78条随机引物中筛选出20条用于群体遗传学研究.两个群体共扩增出218条DNA片段,大多数片段大小为250～1500 bp,其中圆斑星鲽185条,条斑星鲽183条.多态片段比例分别为56.76%和64.48%,Nei的多样性指数和Shannon的信息指数分别为0.232 2和0.278 1、0.339 1和0.398 9.这两种星鲽养殖群体间的遗传相似性系数和遗传距离分别为0.672 0和0.397 5.     

圆斑星鲽连续性鳃细胞系的建立

为建立圆斑星鲽(Verasper variegatus)鳃细胞系,本文采用胰蛋白酶消化法启动了圆斑星鲽鳃组织的体外培养,并通过对培养液配方和培养条件的优化成功地进行了圆斑星鲽鳃细胞的原代培养和继代培养。结果显示,圆斑星鲽鳃细胞的最适培养液为含有20%胎牛血清(FBS)的DMEM/F-12培养液,培养液最适pH值为7.2,最适培养温度为22℃;通过向20%FBS-DMEM/F-12培养液(pH=7.2)中添加N-乙酰葡萄糖盐酸盐、羧甲基壳寡糖、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及I型胰岛素样生长因子(IGF-I),在22℃成功启动了圆斑星鲽鳃细胞的原代培养,细胞的贴壁、生长和分裂状态良好,为典型的成纤维样细胞形态,30 d即可形成汇合的细胞单层;经连续继代培养后,已成功建立了连续性圆斑星鲽鳃细胞系,现已继代培养至第76代;该细胞系细胞经液氮冻存复苏后仍保持其原有的成纤维样细胞形态,其贴壁生长状态和增殖速度也与冻存前无差异;生长特性鉴定结果显示,第60代圆斑星鲽鳃细胞系细胞的群体倍增时间为43.6 h,表明细胞的生长分裂依然十分旺盛。染色体分析结果显示,圆斑星鲽鳃细胞系细胞虽然出现了染色体的非整倍性,但其特征性染色体数目仍为46条,并具有其典型的二倍体核型特征(46 t),表明所建立的细胞系确为圆斑星鲽鳃细胞系。该细胞系的建立对于病毒与宿主相互作用机理的研究及病毒疫苗的开发具有重要的理论和应用价值。     

MS-222麻醉圆斑星鲽成鱼效果研究

不同水温(15℃、20℃和25℃)下、不同质量浓度的MS-222对圆斑星鲽成鱼的麻醉效果不同。根据鱼体在最终麻醉状态和复苏过程中的行为特征,分别把麻醉和复苏过程分为6个和4个时期。15℃、20℃和25℃时MS-222麻醉圆斑星鲽成鱼的有效质量浓度分别为180~300 mg/L、160~280 mg/L和150~230 mg/L。实验结果表明:高水温条件下成鱼进入麻醉状态所需麻醉剂浓度较低;15℃、20℃和25℃温度下在各自的有效质量浓度(180~300 mg/L1、60~280 mg/L和150~230 mg/L)范围内,浓度越高鱼体达到A4期的麻醉时间越短,但复苏时间无明显差异。随着水温的升高,同等麻醉浓度的麻醉剂对圆斑星鲽的麻醉效果逐渐增强。MS-222麻醉圆斑星鲽的效果好,鱼体入麻时间短、复苏快,安全边界宽,是一种理想的鱼用麻醉剂。     

圆斑星鲽(Verasper variegatus)wtl基因的克隆与表达分析

圆斑星鲽（Verasper variegatus）雌鱼生长快,成熟雌鱼个体大小是雄鱼的2倍以上,开展性别相关基因的功能研究,对于探究圆斑星鲽性别决定机制,建立单性培育技术具有重要意义。本研究获得了wt1a及wt1b两个同源基因,wt1a基因全长为3263bp,预测开放阅读框（ORF）长为1245bp,编码415个氨基酸,5''-UTR和3''-UTR分别长372bp和1640bp;wt1b基因全长为2312bp,预测开放阅读框（ORF）长为1281bp,编码427个氨基酸,5''-UTR和3''-UTR分别长369bp和659bp。wt1a基因编码氨基酸分子量为46.2kDa,理论等电点为9.24,无跨膜结构及信号肽,在ORF末端有4个锌指结构,编码KTS三肽;wt1b基因编码氨基酸分子量为46.95kDa,理论等电点为8.99,无跨膜结构及信号肽,在ORF末端有4个锌指结构,并且编码KTS三肽。基因表达结果表明：wt1a和wt1b基因主要在圆斑星鲽性腺中表达,精巢的表达高于卵巢,肾脏的表达量显著高于其他组织,推测wt1a基因和wt1b基因在性腺和肾脏发育过程及功能方面均发挥重要作用;在早期发育阶段,wt1a基因在原肠期之前微弱表达,从原肠早期开始逐渐上升至神经胚期表达量达到最高,之后逐渐下降,直至孵化阶段,推测wt1a基因在圆斑星鲽原始生殖细胞分化过程及性腺发育中发挥重要作用。     

外源激素对二龄圆斑星鲽卵巢发育诱导效果的初步研究

为了认识2龄雌性圆斑星鲽的生殖特性和生殖潜力,采用注射外源激素诱导方法,研究了外源激素鲑鱼促性腺激素释放激素(GnRH)、促黄体素释放激素类似物(LHRH)诱导2龄雌鱼卵巢发育的效果.结果表明:两种外源激素以GnRH对卵母细胞成熟的诱导效果为好,经外源激素诱导后,有约30％实验鱼的卵巢部位可见相对明显的隆起,组织切片观察显示,实验鱼卵母细胞可达到5时相早期,但未能发生水合作用而成熟,表明2龄圆斑星鲽对外源激素的诱导应答效应较弱;外源激素诱导后,血浆中性类固醇激素(雌二醇和睾酮)的表达水平显示显著升高,96 h后表达水平下降恢复至正常水平;同时发现,激素诱导实验鱼的肝细胞直径增加,表明外源激素诱导可能部分启动了卵母细胞发育成熟所需卵黄蛋白物质的发生和转化过程.未能获得亲鱼产卵,可能是由于2龄人工亲鱼内分泌成熟调控系统对外源激素的响应机制未完全建立所导致.研究结果为认识人工养殖条件下圆斑星鲽的生殖特性及生殖潜力评价提供了理论支持和技术依据.     

脱脂南极磷虾粉对圆斑星鲽幼鱼体组成和消化性能的影响

为探讨脱脂南极磷虾(Euphausia superba)粉对圆斑星鲽(Verasper variegatus)幼鱼体组成和消化性能的影响。作者以鱼粉和脱脂磷虾粉为蛋白源、鱼油为脂肪源,用脱脂磷虾粉蛋白替代0%、10%、20%、30%、40%、50%和100%的鱼粉蛋白,设计7种等蛋白(50%)、等脂肪(8%)的实验饲料(分别表示为F0、F10、F20、F30、F40、F50和F100)。每组设3个重复,每个重复20尾鱼,初始体质量为(68.13±0.20)g,经过8周的饲养实验。结果表明:F100组的肝体比和脏体比显著低于其他各组(P0.05),F20~F30组的肥满度显著高于F40组(P0.05);F100组全鱼的水分和灰分显著高于其他各组(P0.05),F10组和F100组全鱼的粗蛋白显著高于其他各组(P0.05),F30组和F50组全鱼的粗脂肪显著高于其他各组(P0.05),F100组全鱼的粗脂肪显著低于其他各组(P0.05)。F10、F20和F50组肌肉的水分显著高于F100组(P0.05),F20组和F30组肌肉的粗脂肪显著高于其他各组(P0.05),各替代组肌肉的粗蛋白、灰分无组间差异(P0.05);胃蛋白酶活性组间无差异(P0.05),F0和F20的胃脂肪酶活性显著低于F30组(P0.05),F30组的胃淀粉酶活性显著高于其他各组(P0.05),F30和F100组的肠脂肪酶活性显著低于其他各组(P0.05),F0组的肠淀粉酶活性显著高于其他各组(P0.05);脱脂南极磷虾粉替代组的皱襞高度呈现先升高后降低的趋势,F30组的皱襞高度显著高于其他组(P0.05),替代组和对照组的黏膜厚度和绒毛长度没有显著性差异(P0.05)。综合来看,脱脂南极磷虾粉10%~50%的替代比例对圆斑星鲽幼鱼的形态指标、体组成、消化酶活性和肠道形态指标有较好的效果。     

鞍带石斑鱼(♀)×蓝身大斑石斑鱼(♂)杂交F1代变态发育和生长特征分析

为了深入研究鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus) (♀)×蓝身大斑石斑鱼(E. tukula) (♂)杂交F1代的变态发育及生长特征,本研究对杂交组和纯种鞍带石斑鱼胚胎发育时间、受精率、畸形率、孵化率和仔稚幼鱼生长性状(全长、体长、体高、肛前距）,以及杂交组卵黄囊和油球吸收过程,第二背鳍棘和腹鳍棘生长和收缩,口径和眼裂的变化等进行了详细的观察描述和统计分析。结果显示,在水温28℃条件下,杂交组和鞍带石斑鱼受精卵分别经21 h 24 min和21 h 32 min完成胚胎发育;杂交F1代受精率、畸形率和孵化率分别是89.09%±0.08%、35.16%±5.05%和62.59%±10.70%,与纯种鞍带石斑鱼无显著性差异。根据卵黄囊、第二背鳍棘、腹鳍棘、鳞片、体色等形态变化,将其胚后变态发育分为前期仔鱼(孵化后0～6 d)、后期仔鱼(孵化后7～34 d)、稚鱼期(孵化后35～46 d)和幼鱼期(孵化后47～86 d),前期仔鱼生长较缓慢,后期仔鱼到幼鱼期生长逐渐加快,86 d时杂交组和对照组体长分别达(60.80±0.50) mm和(51.80±0.47) mm,杂交组生长速度极显著高于对照组(P<0.01)。在胚胎发育时期卵黄囊消耗量为29.45%,油球消耗量为20.75%,卵黄囊在孵化后1 d消耗最快,达58.70%。油球在孵化后3 d消耗最快,达32.08%,孵化后第5 d仔鱼卵黄囊和油球基本吸收完毕。第二背鳍棘、腹鳍棘在孵化后29 d达到最长,分别是(8.15±0.02) mm和(5.80±0.10) mm,至47 d完全退化,变态发育完成。第一天仔鱼眼径为(0.16±0.01) mm,至86 d眼径增大22倍,第四天口裂长为（0.09±0.02） mm,至86 d增大99倍。结果表明,鞍带石斑鱼(♀)×蓝身大斑石斑鱼(♂)杂交F1代胚胎和仔稚幼鱼发育正常,而且杂交F1代与母本相比具有较显著的生长优势,本研究为两种石斑鱼杂交苗种培育、发育研究和品种改良提供了丰富的数据。     

SRAP标记在马氏珠母贝家系F1代中的分离

用SRAP(sequence-related amplified polymorphism,序列相关扩增多态性)标记首次对马氏珠母贝(Pinctada martensii)红壳家系的亲本及其子一代(F1)进行了遗传分析.7对引物共扩增出63个位点,多态位点比例为68.25%,其中正常位点59个(93.65%),异常位点4个(6.35%).59个正常位点中,20个位点在F1不分离,39个位点分离.卡方检验表明,39个分离位点中符合孟德尔分离规律的位点28个,占分离位点数的71.79%;偏孟德尔分离规律的位点11个,占分离位点数的28.21%.符合孟德尔分离规律的位点中按1:1分离的位点占25%,3:1分离的位点占75%,1:1分离位点所占比例较小,因此要利用马氏珠母贝家系F1进行SPAP遗传图谱的绘制应适当增加引物数量或改用杂交家系.