长江、黄河、辽河水系中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)野生和养殖群体遗传变异的微卫星分析*

我国中华绒螯蟹(以下简称河蟹)养殖主要集中在长江、黄河和辽河流域, 经过多年的人工养殖、跨流域引种和增殖放流等活动可能会对其遗传特性造成一定的影响,因此本研究利用29个微卫星标记对3个水系的野生和养殖群体进行了遗传特征分析。结果表明：(1) 29个SSR标记共检测到943个等位基因,各位点等位基因数在11-52之间, 平均为32.52个; 各位点的平均观测和期望杂合度分别为0.723和0.876,仅5个位点处于Hardy-Weinberg平衡中;各位点平均多态信息含量(PIC)为0.864,其中28个为高多态性位点(PIC>0.5)。(2) 6个群体均表现出较高的遗传杂合度水平(H_O=0.702-0.744);香农信息指数(I,介于2.566-2.661)显示6群体的遗传多样性水平依次为：长江野生>长江养殖>黄河野生>辽河养殖>黄河养殖>辽河野生。(3)方差分析(AMOVA)结果显示,来源于种群内个体间和个体内部的变异分别为14.02%和85.88%,群体遗传分化指数F_ST仅为0.0008-0.0050,群体间的遗传分化处于较低水平(F_ST<0.05);基于Nei’s遗传距离的UPGMA聚类结果显示,长江野生群体单独聚为一支, 其余5群体共同聚为大一支, 其中长江养殖群体、黄河野生群体与黄河养殖群体聚为一小支,辽河野生群体和养殖群体聚为另一小支。(4) 瓶颈效应分析显示,所有群体近期均经历过有效种群的降低。群体遗传结构分析显示显示,6种群内个体的遗传组成混杂,不能根据其遗传结构划分出最佳理论群体数。综上所述,三水系野生和养殖群体均具有较高的遗传多样性,长江和黄河野生群体的遗传多样性略高于养殖群体;三水系河蟹野生群体的遗传分化与地理距离具有一定的相关性,长江养殖群体、黄河野生及养殖群体间的遗传分化较小可能与其跨流域引种及养殖群体逃逸造成其种质混杂有关。     

荧光标记微卫星分析人工饲养中华绒螯蟹的遗传多样性

分析中华绒螯蟹的遗传多样性,采集来自无锡、苏州和上海人工养殖样品102个,运用毛细管电泳检测荧光标记（FAM或HEX）的10个中华绒螯蟹微卫星DNA位点。在所有的3个群体中,单一位点等位基因数从15～42个,平均值为22．9;多态信息含量（PIC）和有效等位基因数（E）分别高达0．826和7．699。结果表明10个位点均为高度多态位点,中华绒螯蟹人工养殖群体具有较高的遗传多样性。欧氏遗传距离、遗传相似性和群体各亚群体内固定系数（Fst）平均值分别为0．439,0．825和0．099,结果显示不同的人工养殖群体之间也存在较大的遗传多样性。除上海群体在同步突变模式（SMM）下,近期不会有瓶颈（P=0．35）;所有群体在SMM和无限等位基因模式（IAM）下均有显著或极显著的瓶颈（P〈0．01或0．05）,结果说明科学的品种保护计划的迫切性。本研究首次选择遗传标记微卫星DNA评估中华绒螯蟹的遗传多样性,并采用高精度的毛细管电泳检测技术,将对中华绒螯蟹的品种保护和合理利国提倡科学依据。     

长江水系中华绒螯蟹野生和养殖群体选育子一代养殖性能和性腺发育的比较

以长江水系大规格中华绒螯蟹野生群体和养殖群体为选育基础群,以降低一龄性早熟率、提前或延后二龄成熟期和提高成蟹规格为主要选育目标,进行中华绒螯蟹良种培育,综合比较野生和养殖群体选育子一代(野选G1,养选G1)的养殖性能和性腺发育情况,结果显示:(1)扣蟹养殖阶段,野选和养选G1的早熟率分别比对照组降低36.89%和15.25%,养选G1早熟率略高于野选G1(P0.05);野选G1在9—11月平均体重略低于养选G1和对照组,且8—9月野选G1的增重率和特定生长率显著低于对照组;野选和养选G1的正常扣蟹产量显著高于对照组,且两选育群体G1早熟蟹的产量显著低于对照组(P0.05);(2)成蟹养殖阶段,野选G1的生殖蜕壳时间和性腺发育略晚于对照组,养选G1的生殖蜕壳时间和性腺发育略早于对照组;(3)三群体中华绒螯蟹在成蟹养殖阶段的早期(3—6月)生长速度接近,6—8月野选G1雄体的增重率和特定生长率明显低于其它两组,8—9月则明显高于其它两群体雄体;野选G1雌体的生长速度仅在6—7月明显低于其它两组,7—9月则反之;(4)野选G1的平均产量显著高于对照组,两选育群体最终成蟹平均规格均高于对照组,仅野选G1雌体成蟹体重显著大于对照组(P0.05);无论雌体还是雄体,野选和养选G1成蟹平均体重均比对照组大10%以上;两选育群体雄体和雌体的大规格成蟹(雄蟹≥175g,雌蟹≥125g)比例均高于对照组,但差异不显著(P0.05)。综上,野选G1具有一龄扣蟹早熟率低、二龄成蟹规格大和性腺成熟时间略有推迟等特点,养选G1具有扣蟹养殖阶段饲料系数低、性腺发育时间提前和成蟹规格大等特点,两群体G1均具有进一步选育的潜力。     

南北水系中华绒螯蟹形态差异分析

为探讨南北水系中华绒螯蟹形态差异及物种有效性问题,采用形态学测量的方法,每只蟹选择56个测量点,测量南北水系蟹各60只的54个形态性状.主成分分析显示,南北样本可以分成两个相互独立的群体.t检验显示,54个所测量形态变量中有25个南北差异极其显著(P<0.01),5个差异显著(0.01相似文献   

控温控光培育长江系中华绒螯蟹“早豆蟹”的研究

在早春利用水泥池塑料大棚,采取控温控光,充气,移植是、控制水质及合理投饵等强化培育技术,将长江水长中华绒螯蟹大眼幼体培育成“早豆蟹”、使蟹苗当年养成商品蟹,改革河蟹两年养成的传统生产模式。经过两年的研究,在１２８７．２ｍ＾２试验池哄培育出“早豆蟹”１８３万只,平均每平方米７００多只。成活率达６０％,投入产 为１：２．５,经济效益显著。     

皱纹盘鲍野生与养殖群体微卫星标记遗传变异研究

采用7个微卫星标记对辽宁大连、山东烟台、荣城、崂山和胶南5个皱纹盘鲍养殖群体,以及山东长岛、荣城、日本岩手、韩国仁川4个皱纹盘鲍野生群体进行了群体遗传多样性与遗传分化的研究.结果表明,从等位基因数与杂合度上分析,养殖群体(N=8.0～9.4,He=0.754～0.787)遗传多样性显著低于野生群体(N=11.3～15.0,He=0.821～0.866);等位基因频率分布揭示出野生群体中一些稀有等位基因在养殖群体中有所丢失;亲鲍选用数量少与性别比例不均衡可能是产生养殖群体中遗传多样性显著减少的原因.通过对等位基因频率比较分析,5个养殖群体之间以及养殖群体与野生群体之间观察到显著差异的Fst与Rst值,野生群体之间日本群体Fst与Rst值与其他3个野生群体差异显著,群体间存在遗传分化;养殖群体间遗传距离与地理距离不相关,可能是皱纹盘鲍育苗过程中亲鲍和苗种频繁交流所造成的结果;日本群体与其他3个野生群体间存在显著遗传分化与皱纹盘鲍短暂的浮游期与有限的扩散能力有关.     

用mRNA差异显示技术分析中华绒螯蟹早期发育的基因表达

用中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis)未受精卵、受精卵、二细胞胚、囊胚、原物胚为材料，提取总RNA，分别用Oligod T12GA、GC、AC3种锚定引物合成以上5种材料的cDNA第一链，然后以此cDNA为模板用30种随机引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳分析。得出了5个早期发育的特异表达片段。结果表明，未受精卵、受精卵、二细胞胚之间的差异不大，都表面为母型调控，囊胚期有新mRNA的转录，开始进入合子型调控。     

日本绒螯蟹放流群体的遗传变异

利用水平电泳方法研究日本绒鳌蟹放流群体（新县的三面川和岛根县的高津川的遗传变异。计检测了15种同工酶,22个位点。两河川日本绒螫蟹的多态座位比例及平均杂合度）利力0．273和0．020,0．227和0．022,与其他种群基本一致。另外,两群体其他相近两自从群体的根井遗传距离为0．001。结果表明：到目前为止,尚未见到放流群体的遗传变异的明显减少。     

氯化钾诱导中华绒螯蟹三倍体参数的优化

基于受精卵早期发育形态学的观察,对利用氯化钾诱导中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)三倍体的条件进行了优化.实验结果表明:中华绒螯蟹受精卵在产出后经历了变圆、体积膨大及卵黄团物质位置移动的过程;在15℃下,中华绒螯蟹受精卵在产出后40 min左右释放第一极体,80 min左右孵化膜形成并举起,5 h左右第二极体释放;氯化钾诱导中华绒螯蟹三倍体的优化参数为:产卵后1.5～2.0 h,用6 g/L的氯化钾处理4 h;孵化膜形成并举起可以作为中华绒螯蟹三倍体诱导开始点的形态学标记,其最高诱导率可以达到100%.实验结果为实现中华绒螯蟹三倍体苗种的批量生产提供了参考和依据.     

中华绒螯蟹幼体中肠的超微结构

于1986,1987两年的3—6月,在浙江平湖水产试验场和华东师大培育池,采集中华绒螯蟹,利用透射电子显微镜观察其五期溞状幼体和一期大眼幼体。结果表明,Z_1和Z_2中肠上皮细胞呈椭圆形,Z_3以后逐渐转呈柱状;细胞游离面密生微绒毛,毛的基部具微纤丝。早期幼体阶段的中肠上皮细胞中,还另有囊状细胞和有分泌颗粒的细胞;上皮细胞中具线粒体、高尔基复合体、内质网、溶酶体等其它胞器。根据这些细胞的结构,可见中肠具营养物质的吸收和渗透调节的功能。除上皮细胞外,肠壁还有基膜、纵肌层和环肌层。     

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)延伸因子EF-2基因全长cDNA克隆及表达

采用RT-PCR和RACE方法克隆了中华绒螯蟹延伸因子EF-2全长cDNA,序列分析表明EF-2全长2752bp,编码846个氨基酸。经BLASTX分析表明,EF-2核苷酸序列与镶边拟蠢蟹EF-2序列的同源性最高,其相似性为88%;所编码的氨基酸序列与甲壳动物EF-2的氨基酸序列相似性都在90%以上。聚类分析显示,中华绒螯蟹EF-2的氨基酸序列与镶边拟蠢蟹EF-2聚为一支,并与其它甲壳动物聚为一体。荧光定量PCR结果显示,EF-2在正常成熟中华绒螯蟹肌肉中表达量最高,精巢、肝胰腺中有少量表达,心脏、卵巢、胃、肠、鳃中有微量表达。检测了不同发育状态的幼蟹、早熟蟹和正常成熟蟹EF-2在肝胰腺、鳃以及肌肉中的相对表达情况;同时也检测了在不同pH处理下幼蟹EF-2在肝胰腺和鳃中随时间变化的相对表达情况,结果显示pH胁迫对幼蟹EF-2表达有一定的诱导效果。     

单环刺螠(Urechis unicinctus)微卫星标记开发及5个地理种群遗传结构分析

采用高通量测序法从单环刺螠基因组中开发微卫星标记,并通过一个秦皇岛单环刺螠野生群体对其进行多态性评价,利用获得的多态性引物对秦皇岛、烟台、潍坊、青岛、大连5个不同海区的野生单环刺螠群体进行了遗传多样性及遗传结构分析。结果表明:本实验设计的50个微卫星标记能稳定扩增的有38个,其中22个微卫星位点在5个群体中均表现为高多态性,等位基因数(Na)介于24—44之间,多态信息含量(PIC)介于0.921—0.967之间。5个群体总的平均有效等位基因数(N_e)范围为6.629—8.850,平均观测杂合度(Ho)和平均期望杂合度(He)范围分别为0.790—0.912、0.851—0.896,大连群体的杂合度最大(H_e=0.8962),潍坊群体的最小(H_e=0.8510),其中有12个微卫星位点在不同群体中出现显著偏离Hardy-Weinberg平衡的现象。平均遗传分化指数(FST)表明,群体分化水平处于中等分化水平(FST值为0.0880—0.1136);聚类分析显示烟台群体先与青岛群体聚为一支,再与秦皇岛群体聚类,然后跟潍坊群体聚为一支,大连群体单独聚为一支;遗传距离模式(IBD)显示单环刺螠群体的地理距离与遗传距离间不存在显著的线性关系。本研究开发的22对微卫星标记可以用于单环刺螠遗传结构分析研究,为下一步单环刺螠种质资源保护和人工繁育提供参考依据。     

大通湖中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)自然生产潜力估算模型探讨

人放天养的中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)质量好、个体大、耐运输、肉质鲜美,是优质高档蟹的代表,但产量严重不足。建立一套湖泊中华绒螯蟹自然生产潜力估算的模型来估算湖泊中华绒螯蟹自然生产潜力,确定放养量,以达到湖泊中华绒螯蟹稳产已迫在眉睫。本文根据近20年来作者对湖泊中华绒螯蟹放养的经验,结合灰估理论,提出蟹自然生产潜力:W=[B1K1C1/R1+B2K2C2/R2]·(B1+B2)2/B12+B2和蟹种放养量:W0=P0[B1K1C1/R1+B2K2C2/R2]·U/P估算模型,并与生产实践进行求证。其结果与生产实践存在较好的一致性。其估算结果可作为指导湖泊中华绒螯蟹生产的依据。     

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)肠道和肝胰腺5-羟色胺(5-HT)和5-羟色胺受体2(5-HTR2)的定位研究

肠道和肝胰腺是中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)重要的消化器官,本文运用组织学技术测量了中肠和后肠长度,并对肠道长与体长进行相关性分析。应用免疫组化技术对5-HT和5-HT受体2进行组织定位和计数。结果表明:(1)中华绒螯蟹的肠道长与体长接近,两者之间呈极显著正相关(P0.01)。后肠长度约为中肠的2倍;(2)5-HT和5-HT受体2在中肠和后肠中的组织定位和数量相似,均分布于黏膜上皮细胞间和肌层与外膜交界处,亦见于后肠的固有膜和黏膜下层与肌层交界处,在肠球外膜中也有大量分布;(3)5-HT和5-HT受体2阳性物质在肝胰腺的四种细胞的胞核中均有分布,在F细胞的胞质中也有分布。5-HT和5-HT受体2在中华绒螯蟹肠道和肝胰腺组织中的分布规律一致,表明中华绒螯蟹消化道5-HT发挥生理功能可能与5-HT受体2有关。此外,5-HT和5-HT受体2在后肠近肌细胞分布的特点可能与肠道收缩有关。后肠在中华绒螯蟹消化生理中的作用应引起重视。     

基于脂肪酸生物标记法探讨中国沿海六群体绒螯蟹(Eriocheir sensu stricto)的种群遗传

水产动物肌肉中的脂肪酸组成可用于评价其种群遗传。本研究通过测定和比较辽河(LH)、黄河(HH)、长江(YZ)、瓯江(OJ)、闽江(MJ)和南流江(NLJ)水系野生绒螯蟹(Eriocheir sensu stricto)肌肉中的脂肪酸组成,进一步分析了6群体间的遗传多样性和亲缘关系。结果显示:(1)在6水系群体中检测出26种脂肪酸,其中C20:5n3、C18:1n9、C22:6n3、C16:0、C20:4n6、C18:2n6和C18:0为主要种类,其总和占总脂肪酸的74%以上;(2)逐步判别分析法筛选出8种判别贡献较大的脂肪酸,分别是C17:0、C18:0、C20:0、C22:1n9、C18:3n3、C18:3n6、C20:2n6和C22:5n3,据此分别建立判别方程,综合判别准确率为98.33%;(3)聚类分析显示:OJ与MJ群体的欧氏距离最小, HH与YZ群体的欧氏距离比OJ与MJ群体的要大,NLJ群体与其他5个群体的欧氏距离相对最大;(4)6群体间脂肪酸含量的变异系数在2.99%—30.00%之间,遗传多样性指数变化幅度在3.2732—3.3204之间。综上,基于脂肪酸生物标记法表明6水系绒螯蟹群体遗传多样性指数均较高,脂肪酸可以有效鉴别6水系野生绒螯蟹种群,整体上南流江群体和其余5群体间相距最远;本研究结果可为绒螯蟹种质资源评价和开发利用等提供基础资料。     

长牡蛎(Crassostrea gigas)野生与选育群体的微卫星遗传多样性分析

为了评估长牡蛎(Crassostrea gigas) 2个壳长性状(掌心形)快速生长选育群体(LY2-K4、LY2-K7)、1个壳高性状(速生型)快速生长选育群体(LY2-K11)和6个野生群体(QHD、LS、HD、ZH、WD、KTD)的遗传多样性和遗传结构, 用21对多态性丰富的微卫星引物对9个长牡蛎群体的269个个体进行了遗传分析。结果显示: 21个微卫星位点共检测出了460个等位基因(N_a),平均等位基因数为21.905; 21个微卫星位点的多态信息含量(PIC)均大于0.5, 具有高度遗传多态性; 选育群体LY2-K11的遗传多样性最低(N_a=13, I=2.128,H_e=0.831, PIC=0.825), 野生群体KTD的遗传多样性最高(N_a=29,I=3.112, H_e=0.941, PIC=0. 938); 189个群体位点组合有66%偏离哈代-温伯格平衡, 表明这些群体存在一定程度的杂合子缺失; 9个群体间的遗传分化指数(F_st)为0.012~0.064, 处于较低的遗传分化水平; AMOVA分析显示遗传变异主要来自于个体内; PCoA分析结果与UPGMA聚类树一致, LY2-K11群体单独聚为一类, QHD和HD群体聚为一类, 其他6个群体聚为一类。综上所述, 长牡蛎3个选育群体和6个野生群体遗传多样性均较高, 遗传分化水平较低; 选育群体LY2-K11多样性略有下降, 选育过程中应保证亲本的数量及质量, 防止因近交衰退造成遗传多样性降低, 苗种抗逆性变差。该结果将为长牡蛎新品种的选育和野生种质资源的保护提供科学指导。     

钙激活钾通道在中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis) 血淋巴细胞免疫中的作用研究

采用膜片钳技术解析了中华绒螯蟹血淋巴细胞表达的大电导钙激活钾通道(BKca),研究了中华绒螯蟹BKca对血淋巴细胞吞噬和杀菌作用的影响,并探讨了其机制.结果表明,当Ca2+浓度在0.3-3.0μmol/L范围时,中华绒螯蟹血淋巴细胞表达的钙激活钾通道的开放表现出明显的钙依赖活性;培养液中游离Ca2+的添加显著增强了血淋巴细胞的杀菌能力和呼吸爆发活性,但对其吞噬率和吞噬指数的影响不显著;在6mmol/L[Ca2+]浓度条件下,加入不同浓度的Kca阻断剂四乙胺(Tetraethylammonium,TEA)后,血淋巴细胞的杀菌能力和呼吸爆发活性均显著降低,但其吞噬率和吞噬指数并未受到影响.这提示钙激活钾通道可能通过间接调节细胞内的钙离子浓度而在血淋巴细胞杀菌过程中发挥重要作用.     

两组不同饲料对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)卵巢发育及卵黄发生的激素调控

甲壳动物的卵巢发育及卵黄发生受到体内各种内分泌激素的调控。本文研究了两组不同饲料—脂类营养平衡组(A组,含有磷脂和HUFA)和不平衡组(B组,缺乏磷脂和HUFA)对中华绒螯蟹卵巢发育及卵黄发生的激素调控,运用放射免疫法和放射化学法分别测定了处于不同卵黄发生期的中华绒螯蟹的肝胰腺、卵巢、血淋巴中孕酮(PG)、雌二醇(E2)的含量及中华绒螯蟹大颚器(MO)合成与分泌甲基法尼酯(MF)的速率。结果表明:1)中华绒螯蟹体内三种组织(肝胰腺、卵巢和血淋巴)中均存在PG和E2,PG可能为E2的前体;2)早熟蟹的MO合成MF速率远远大于正常发育的幼蟹,MF的大量合成与分泌是促使早熟蟹产生的主要内分泌因素;3)B组饲料(含猪油)喂养的河蟹其MO合成MF的速率均高于A组饲料(含鱼油),且B组饲料的早熟蟹转化PG速度比B组饲料的早熟蟹快;4)PG和E2的脂类结合部位能结合外源性卵黄蛋白原(Vg),通过血淋巴的运输被卵泡细胞胞吞,最终与卵母细胞内的内源性Vg结合,共同形成卵黄体;5)多不饱和脂肪酸(如EPA和DHA)可能会抑制类固醇激素的产生。研究表明,MF是中华绒螯蟹的促性腺激素,具有促使PG合成和E2转化的作用,它们共同诱导河蟹卵巢发育及卵黄发生。     

许氏平鲉(Sebastes schlegeli)微卫星标记开发及野生、养殖群体遗传多样性分析

对许氏平鲉进行简化基因组测序,设计微卫星引物200对,可稳定扩增的引物190对,占95%。利用一个荣成野生群体对24个多态性较高的微卫星标记进行了评价,每个位点的等位基因数(Na)为2—21个,观测杂合度(Ho)为0.0417—0.9167,期望杂合度(He)为0.0278—0.9722,多态信息含量(PIC)为0.1948—0.9496,结果显示有20个微卫星位点为中高度多态。利用这些引物对荣成野生群体和烟台养殖群体的遗传多样性进行了比较分析,野生和养殖群体的平均等位基因数(Na)分别为8.5000、6.9583,有效等位基因数(Ne)的均值分别为4.5484、3.6365,期望杂合度(He)均值分别为0.6421、0.5840,多态信息含量均值(PIC)分别为0.6088、0.5490,平均香农-威纳指数均值为1.4605、1.2834,但F检验发现无显著差异,发现两个群体的遗传多样性都处于高度多态水平,但养殖群体遗传多样性水平低于野生群体。本研究结果说明许氏平鲉的人工繁育中,通过使用较大数量的亲本进行繁育可有效防止选育群体的遗传多样性降低,但人工定向选育对选育群体的遗传多样性也产生了一定的影响。Bonferroni校正后在两个群体中各有4个位点偏离Hardy-Weinberg平衡。本研究开发的微卫星标记为许氏平鲉遗传图谱构建、分子标记辅助育种等提供了更多标记选择,对野生和养殖群体遗传多样性分析为下一步的遗传育种提供参考。