海水网箱养殖鱼类弧菌病病原菌快速诊检方法的初步研究

根据细菌分类原理和《伯杰氏系统细菌学手册》的生化鉴定特征，找出最能区别弧菌属Vibrio各种的主要特征15项，制成弧菌属常见种的快速简易生化鉴定系统。对待定鱼类病原菌进行快速鉴定，获得满意结果。     

养殖大黄鱼(Pseudosciaena crocea)3种致病弧菌的分子鉴定及其系统发育学分析

从患病养殖大黄鱼分离到3株病原菌H040823-1、H050704-1、H050815-1,经常规生理生化鉴定均属于弧菌属的种类,API20E快速鉴定菌株H040823-1为副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyti-cus),菌株H050815-1为溶藻弧菌(V.alginolyticus),菌株H050704-1不在API20E鉴定谱内。为了进一步确定其分类地位,测定了3株病原菌的16S rRNA和HSP60(heat shock protein,HSP60)基因部分序列。16S RNA基因系统进化分析表明,3株病原菌与副溶血弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌亲缘关系较近,相互之间同源性均大于96.9%,差异不明显。HSP60基因序列分析表明,菌株H040823-1、H050704-1、H050815-1的HSP60基因序列分别与V.parahaemolyticus(AF230951)、V.harveyi(EU036994)、V.alginolyticus(DQ664545)的同源性最高,分别为96.7%、99.8%和98.0%,而与其他弧菌HSP60基因的同源性均低于91.9%,3株病原菌相互之间同源性低于92.3%,差异显著。HSP60基因构建的系统进化树表明,H040823-1、H050704-1、H050815-1分别与V.parahaemolyticus、V.harveyi、V.alginolyticus聚类。综合以上结果,菌株H040823-1、H050704-1、H050815-1可分别鉴定为副溶血弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌。结果表明,HSP60基因比16S rRNA基因更适合用于海水鱼类致病性弧菌种间的分类研究。     

分子鉴定方法研究大亚湾水体弧菌种类变化

借助分子鉴定方法监测大亚湾水体中弧菌Vibrio种类季节性动态的变化规律.通过增菌培养、菌株分离,在224份海水中共分离出弧菌368株,并用分子生物学辅助生化鉴定方法鉴定弧菌菌株.结果表明,在大亚湾海域水体中鉴定的弧菌种类有溶藻弧菌Vibrio alginolyticus、副溶血弧菌V.parahaemolyticus、哈氏弧菌V.harveyi和创伤弧菌V.vuinificus,没有检测到霍乱弧菌V.cholerae、拟态弧菌V.mimicus、河流弧菌V.fluvialis和霍利斯弧菌V.hollisae.溶藻弧菌和副溶血弧菌为优势菌群,分别占弧菌总数的27.99%和21.74%.     

海水养殖鱼类鳗弧菌(Vibrio anguillarum)临床分离株的血清型和抗生素耐药谱

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是常见的海水鱼类病原菌,有23种血清型,其中O1—O3为主要的致病血清型。我国海水养殖鱼类鳗弧菌的血清型种类尚未明确。本研究对实验室分离和收集自海水养殖鱼类的31株鳗弧菌临床菌株进行了生理生化、16S r RNA基因序列、血清分型、抗生素敏感性的分析,旨在系统了解存在于我国海水养殖环境的鳗弧菌血清学型及耐药特征。首先用API ID32E生化反应鉴定系统对鳗弧菌进行生理生化鉴定,结果未能将待测菌株鉴定到种的水平;然后测定鳗弧菌的16S r RNA基因序列并构建系统发育树,结果显示所有分离株聚为一簇,与鳗弧菌有最近的亲缘关系(相似性99%—100%),据此可将临床菌株鉴定为鳗弧菌。以鳗弧菌O1—O5血清型标准菌株为O抗原制备兔抗血清,采用玻片凝集反应对鳗弧菌菌株进行血清学分析,结果显示属于O1、O2、O3、O5血清型菌株分别有16、5、3、1株,表明我国海水鱼类养殖存在3种血清型的致病性鳗弧菌,O1为主要流行的血清型。用ATB药敏检测系统检测鳗弧菌对28种抗生素的敏感性,结果显示菌株对7种抗生素(林可霉素、夫西地酸、甲硝唑、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、苯唑西林、青霉素)的耐药率为100%,对3种抗生素(红霉素、原始霉素、泰洛星)的耐药率为94.4%(34株),有83%以上的菌株(30株)对12种以上的抗生素产生耐药,表明我国海水鱼类养殖鳗弧菌普遍存在多重耐药性。研究结果为进一步揭示鳗弧菌的流行病学规律和防控弧菌病奠定了良好的基础。     

日本对虾(Penaeus japonicus)病原需钠弧菌(Vibrio natriegens)表型与分子特征及LAMP检测方法的建立

采用常规表观生物学特性及16S rRNA、gyrB及rpoA基因同源性检索与系统发育学分析等方法,对分离自江苏连云港某育苗场的大批死亡日本对虾蚤状幼体的优势生长菌进行了综合鉴定。结果表明,其形态和生理生化特征与弧菌属的需钠弧菌相近;16S rRNA、gyrB及rpoA基因同源性检索也均与需钠弧菌相似性最高,分别为98%、89%和95%,且三种基因的NJ系统发育树也均与需钠弧菌聚为一个分支;分离菌的致病性试验表明其半数致死量LD50为1.8×106CFU/ml。综合分离菌的致病性、形态与生理生化特征及基因同源性与系统发育分析结果,认为引起日本对虾蚤状幼体大批死亡的病原为需钠弧菌。基于gyrB基因序列设计1套LAMP特异性引物,建立了需钠弧菌的快速特异性检测方法,可用于由需钠弧菌引起的水产动物疾病的诊断及分子流行病学的调查研究。     

养殖近江牡蛎致病弧菌的分离与鉴定

从广东省疫区患病近江牡蛎Crassostrea ariakensis消化盲囊及血液中分离纯化出10株细菌,人工注射感染实验发现其中3株细菌注射组死亡率显著高于对照组.3株细菌均为革兰氏阴性,短杆状,能运动.常规生理生化和Biolog 细菌鉴定系统测试结果表明,菌株A3G-2与溶藻弧菌Vibrio alginolyticus亲缘关系最近,菌株A2G-5B与解蛋白弧菌V. proteolyticus亲缘关系最近,菌株B1X-1与鲨鱼弧菌V. carchariae亲缘关系最近.为了进一步确定它们的分类学地位,分别测定了3株弧菌的16S rDNA序列,分析相关细菌相应序列的同源性,并构建系统进化树.结果表明, 菌株A3G-2与溶藻弧菌亲缘关系最近,菌株A2G-5B与解蛋白弧菌亲缘关系最近,菌株B1X-1与鲨鱼弧菌亲缘关系最近.因此菌株A3G-2、A2G-5B 和B1X-1分别被鉴定为溶藻弧菌、解蛋白弧菌和鲨鱼弧菌.组织病理观察发现患病牡蛎主要受损器官是消化盲囊,表现为腺泡管内壁吸收细胞崩解脱落,管腔扩大,进而管壁解体,消化盲囊出现大面积受损.     

基于MALDI-TOF MS快速鉴定弧菌的数据库的扩展和应用

近年来由海洋细菌导致的感染越来越常见,弧菌是海洋细菌中最常见的细菌之一。目前,对弧菌缺乏快速有效的鉴定。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（Matrix-assisted laser desorption ionization–time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS）已成为快速鉴别细菌强有力的工具。然而,它的准确性取决于数据库中的菌株数量。本研究中,我们利用MALDI-TOF MS对弧菌数据库进行了扩展和应用。我们将74株弧菌纳入了新的数据库,构建了基于RpoB序列的进化树（邻接法和最大似然比法）,并针对扩展后数据库和扩展前数据库进行了聚类分析。我们利用30株弧菌,对扩展后数据库进行了评价,并进行了主成分分析。本研究中,我们创建了一个新的数据库,促进了弧菌的快速准确鉴定。MSP(main spectrum profile)和PCA（Principal Component Analysis）分析为追踪弧菌感染的来源和发生率提供了理论支持。此外,特征峰和差异峰的发现对弧菌的鉴定也有帮助。     

养殖近江牡蛎致病弧茵的分离与鉴定

从广东省疫区患病近江牡蛎Crassostrea ariakensis消化盲囊及血液中分离纯化出10株细菌,人工注射感染实验发现其中3株细菌注射组死亡率显著高于对照组。3株细菌均为革兰氏阴性,短杆状,能运动。常规生理生化和Biolog细菌鉴定系统测试结果表明,菌株A3G-2与溶藻弧菌Vibrio alginolyticus亲缘关系最近,菌株A2G-5B与解蛋白弧菌V．proteolyticus亲缘关系最近,菌株B1X-1与鲨鱼弧菌V．carchariae亲缘关系最近。为了进一步确定它们的分类学地位,分别测定了3株弧菌的16S rDNA序列,分析相关细菌相应序列的同源性,并构建系统进化树。结果表明,菌株A3G-2与溶藻弧菌亲缘关系最近,菌株A2G-5B与解蛋白弧菌亲缘关系最近,菌株B1X-1与鲨鱼弧菌亲缘关系最近。因此菌株A3G-2、A2G-5B和BIX-1分别被鉴定为溶藻弧菌、解蛋白弧菌和鲨鱼弧菌。组织病理观察发现患病牡蛎主要受损器官是消化盲囊,表现为腺泡管内壁吸收细胞崩解脱落,管腔扩大,进而管壁解体,消化盲囊出现大面积受损。     

中国对虾幼体致病菌哈维氏弧菌的分离及其生物学特性研究

于1996年4—5月,在青岛丰城地区一些对虾育苗场发生大规模爆发性传染病,主要感染中国对虾幼体,尤其是蚤状幼体。死亡率高达80％以上。从自然发病及人工感染患病濒死中国对虾幼体中分离出38株细菌,研究其形态特征,生理、生化特性及对中国对虾幼体的致病性。结果表明,38株分离物均为革兰氏阴性杆菌,菌体为杆状或短杆状,极生单鞭毛运动,不发光,氧化酶呈阳性,发酵葡萄糖产酸,TCBS平板上生长,菌落呈黄色或绿色,对弧菌抑制剂0／129（150g／ml）敏感,此均为弧菌属的典型特征,属于弧菌。其中26株细菌被归为同一类群,参照伯杰氏细菌学鉴定手册（1994年,第9版）鉴定表明,该菌同哈维氏弧菌（Vibrioharveyi）最为接近;另外,Biolog系统鉴定表明也为哈维氏弧菌,因此定名为哈维氏弧菌。利用浸泡感染法以2．5×103—2.5×107cfu／ml浓度的细菌感染不同发育时期（无节幼体期、蚤状期、糠虾期和仔虾期）的中国对虾幼体。结果表明,该病原菌主要感染中国对虾幼体的无节幼体晚期、蚤状期和糠虾早期并导致其大量死亡,而在仔虾期感染死亡率较低,并且2．5×104cfu／ml以上浓度的病原菌即可导致蚤状幼体严重感染死亡,由此可见,所分离的致病菌对中国对虾蚤状期幼体具有较强的致病力。人工感染试验结果     

工厂化养殖杂色鲍致病菌副溶血弧菌的分离鉴定及其生理特性

从广东汕尾地区工厂化养殖的患病和死亡的杂色鲍(Haliotis diversicolor)及养殖海水中分离到3株优势菌,经回归感染试验,证实所分离的细菌为杂色鲍的致病菌。经形态、生理、生化等多项指标鉴定,该菌株为副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus),并经ATB微生物自动鉴定系统证实鉴定结果。在中国大陆,由副溶血弧菌使杂色鲍致病并大量死亡的事件,本文属首次报道。     

苗期中国对虾幼体异养细菌区系及其变化与病害发生的关系

研究了2个育苗场不同发育期的中国对虾(Penaeus chinensis)幼体的异养菌和弧菌种群变化的动态过程。以典型特征法、BIOLOGGN法和数值分类法对菌株进行鉴定。结果表明，对虾幼体样品中所分离的细菌，大多是革兰氏阴性杆菌。鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas)、气单胞菌属(Aeromonas)和弧菌属(Vibrio)。弧菌属主要为溶藻弧菌(Vibrioal-ginozyticus)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)。在对虾幼体发育早期，假单胞菌(Pseudomonas)和气单胞菌(Aeromonas)占优势，随着对虾幼体的发育，弧菌(Vibrio)渐成为优势，其中溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)优势明显。二者的消长与苗期病害的发生相关，溶藻弧菌总是在虾幼体健康时出现或成为优势，而哈维氏弧菌成为优势时，苗期病害容易发生。     

发光细菌一新种──青海弧菌

于１９８５年８月从青海湖产的青海裸鲁体表分离到７０株发光细菌，通过表型特性分析，超氧化物岐化酶的凝胶双向扩散试验，以及Ｇ＋Ｃ摩尔百分比测定进行鉴定分类。结果表明，７０株发光细菌在表型特性，免疫学特性等方面彼此高度相似，但与已知的各种发光细菌有显著差异。鉴定为弧菌属的一个新种，定名为青海弧菌Ｖｉｂｒｉｏｑｉｎｇｈａｉｅｎｓｉｓｓｐ．ｎｏｖ．。典型菌株保存于华东师范大学生物系。     

用16S rRNA基因的内切酶图谱快速鉴别几种对虾病原菌

坎普氏弧菌是青岛海洋大学生物系微生物实验室于１９８９－１９９０年自对虾养殖场中国对虾红腿病心脏及血淋巴中分离并鉴定的菌株，副溶血菌和溶藻胶弧菌两菌株于１９９４年９月得自中国科学院微生物研究所，为建立快速、准确的中国对虾病原菌的诊断技术，根据几种细菌的１６ＳｒＲＮＡ基因的序列，设计并合成该基因的多聚酶反应的引物ＰＬ１和ＰＬ２。并用该对引物分别从坎普氏弧菌、副溶血弧菌和溶藻胶弧菌的ＤＮＡ要品中扩增出分     

乳酸菌胞外产物对副溶血弧菌抑制作用的研究

对副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）有抑制作用的3株乳酸菌，分别命名为A-1，A-2，A3，并对其胞外产物的抑制作用进行了研究。结果表明．3株乳酸菌胞外产物对副溶血弧菌有较强抑制作用，抑菌圈直径分别可达18．6，20．3，19．5mm；抑菌物质对热处理不敏感：在60，80℃抑菌活性基本不变，在121℃处理20rain条件下抑菌效果分别是原液的67％，83％，74％，蛋白酶K处理对其活性有较大影响，抑菌成分可能是细菌素。进一步研究了细菌素抑菌活性与乳酸菌培养时间的关系。根据形态特征和常规生理生化反应进行鉴定，A-1，A-2鉴定为嗜热链球菌，A3鉴定为嗜酸乳杆菌。     

一种新的中国对虾弧菌病原菌──产气弧菌

于１９９３年８月，从山东省昌邑县下营镇患败血病的中国对虾血淋巴内分离到多株细菌，其中２株人工感染证实为病原菌；经５０多项形态，生理，生化特性测试鉴定为产气弧菌Ｖｉｂｉｏｇａｚｏｇｅｎｅｓ。其主要特性为：革兰氏阴性，弧状，极生单鞭毛，产生红色素，氧化酶呈阳性，精氨酸双水解酶，赖氨酸脱羧酶，鸟氨酸脱羧酶均为阴性，淀粉酶，明胶酶为阳性，硝酸盐还原阴性，利用木糖，水杨苷，山梨醇发酵葡萄糖产气，利用柠檬酸盐     

养殖对虾细菌性红体病的初步研究

从海南琼山患红体病的养殖南美白对虾(Penaeus vannamei)的肝胰脏和肌肉中分离出2株细菌，经纯化培养后的人工感染结果表明，该2株菌均为引起对虾红体病的细菌性病原菌；根据对这2株菌的形态及生理生化特征检测结果，确定这2株菌分别为溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)和副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)。药敏试验表明，氮霉素、链霉素和庆大霉素等7种抗生素对抑制这2种致病菌具有良好作用。     

两株琼胶酶高产细菌的筛选和鉴定

从海洋环境中筛选得到两株琼胶酶的高产菌株，通过形态观察和生理生化反应，确定它们属于弧菌属，通过BIOLOG细菌鉴定系统鉴定，并同弧菌属标准菌株分析比较，确定上方宝剑两株菌都是塔式弧菌（Vibrio tubiashii)，这两株菌在碳源利用方面存在差别。     

一株副溶血弧菌qdfsVp001的分离与鉴定

用弧菌选择从牙鲆饲育水中分离出1株细菌qdfsVp001,对该菌在培养基上的菌落形态、生理生化特性及其16SrDNA基因序列进行研究,结果表明该菌在TCBS平板上呈现大的蓝绿色菌落,在弧菌显色培养基上呈现紫色菌落,其生理生化特性具有副溶血弧菌的典型特征。16SrD-NA基因序列及系统发育树分析表明,该菌与弧菌的亲缘关系最近,其中尤与副溶血弧菌最为相似。结合qdfsVp001的形态、生理生化及16SrDNA基因序列分析结果,确定该菌株是1株副溶血弧菌。     

文蛤副溶血弧菌间接 ELISA检测技术的研究

从患病文蛤组织内分离出一株细菌,回归感染试验证明是文蛤的致病菌,经鉴定为副溶血弧菌,灭活后(56 ℃,1 h)制成菌苗,用该菌苗制备兔抗血清,以辣根过氧化酶标记的羊抗兔血清(HRP-IgG)为酶标二抗,对副溶血弧菌进行间接ELISA快速检测.结果表明:应用间接 ELISA 技术检测副溶血弧菌具有较高的灵敏度,其最低检测极限为 1 × 105 cfu / mL.患病文蛤内脏团中副溶血弧菌的检出率为 80 %,无病症带菌文蛤中的检出率为 15 %,海水中副溶血弧菌的浓度低于最低检测极限.表明间接 ELISA检测法不仅可以用于发病文蛤的快速检测,而且能够检测出无病症的带菌的文蛤,为有效预防副溶血弧菌病的暴发提供了检测手段.     

拟态弧菌全长toxR基因的克隆和序列分析

对克隆的拟态弧菌Vibrio mimicus的全长toxR基因及进行相关的序列分析.根据已发表的其他几种弧菌toxR基因两翼核苷酸序列,设计和合成上下游简并引物,以拟态弧菌1.1969标准株的基因组DNA为模板进行PCR扩增,将获得的1.3kb扩增片断进行克隆、鉴定和测序,并将该序列提交至GenBank (登录号为EF693743).首次获得拟态弧菌840bptoxR基因全长核苷酸序列.与其它弧菌的相应序列分析比对显示,该序列与霍乱弧菌Vibrio cholerae的toxR基因有87%-88%的相似性,与鳗弧菌Vibrio anguillarum的toxR基因有75%的相似性,与副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus的toxR基因有45%的相似性.该基因编码1个含有279个氨基酸残基的蛋白质,其分子量为31.13kDa,等电点为5.35,并含有一个典型的转录激活区和一个跨膜区.系统发育树分析表明,几种常见致病性弧菌的toxR基因序列存在较大分歧,拟态弧菌能较容易与进化相近的霍乱弧菌鉴别区分开来.toxR基因全长核苷酸序列的获得将为拟态弧菌的菌种鉴定增添新的分子靶标,有助于其结构和功能的研究及通过突变分析鉴定出新的受toxR基因调控的致病基因.