海洋产油真菌的简便初筛

选取分离自大洋、深海的28株酵母和143株霉菌,采用在培养基中添加尼罗红比较表观荧光强度的方法来筛选出酵母2株和霉菌7株,但菌体呈红色的酵母（17株）及菌丝为黑色的霉菌（28株）不适用于此法;通过单位DD鲫荧光强度的高低筛选出1株菌落为微红色的酵母,产油性能好于用第一种方法挑选出的2株酵母,且菌体颜色对结果并无影响,但只适合筛选酵母．通过上述2种方法筛选出高油脂菌株,大多来源于深海．     

雷州半岛近岸海域海洋红酵母的分离鉴定

从雷州半岛近岸海域采集海洋生物、海水、海泥等样品,共计317份。将样品处理后先富集培养,再用红酵母琼脂培养基及麦芽汁琼脂培养基进行分离培养,之后对分离菌株通过菌体形态、培养特性及生理生化试验结果进行初步鉴定。根据红酵母的初步鉴定结果,选取有代表性的菌株作26s r DNA D1/D2区域序列测定,构建系统发育树,进行多样性分析。结果表明,从317份样品中分离鉴定出71株海洋红酵母;其中,有代表性的36株红酵母归属于5个种和2个疑似新种。36株红酵母包括胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)22株、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)6株、红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)3株、斯鲁菲亚红酵母(Rhodotorula slooffiae)2株、浅红红酵母1株(Rhodotorula pallida)和疑似红酵母新种2株(Rhodotorula sp,c ZDJ2和Rhodotorula sp.ZTC2)。雷州半岛近岸海域的海洋红酵母优势种为胶红酵母,种群的多样性不够丰富。     

三大洋深海沉积物样品可培养真菌多样性研究

深海真菌是深海微生物的重要组成之一,在深海环境生态系统中起着非常重要的作用,但目前人们对于深海沉积物中的真菌群落多样性关注较少.本研究对来自东太平洋、南大西洋和西南印度洋(三大洋)的15个沉积物样品进行真菌的分离培养,共获得175株真菌,包括93株酵母菌和82株丝状真菌.基于形态学观察和ITS序列的系统发育分析显示,93株酵母分别属于红冬孢酵母属(Rhodosporidium)和胶红酵母属(Rhodotorula)的两个种[海洋红酵母(Rhodosporidium paludigenum)和胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)].82株丝状真菌分别属于曲霉属(Aspergillus)、枝孢属(Cladosporium)、青霉属(Penicillium)、链格孢属(Alternaria)、镰刀菌(Fusarium)、支顶孢属(Acremonium)、茎点霉属(Phoma)、麦轴梗霉属(Tritirachium)、毛壳菌属(Chaetomium)、外瓶霉属(Exophiala)、侧齿霉属(Engyodontium)、肉片齿菌属(Sistotrema)、裂褶菌属(Schizophyllum)、腥掷抱菌属(Tilletiopsis)和Hormonema.其中曲霉属为丝状真菌中的优势属,占总菌株的47.6%.上述研究结果表明大洋深海沉积物中存在着较为丰富的真菌资源,有助于加深我们对于不同大洋区域深海环境中真菌群落结构的认识.     

三疣梭子蟹肌肉乳化病的病原及其致病性研究

为进一步搞清养殖梭子蟹肌肉乳化病的病原及其致病机理,找到有效的防治方法,2002-2004年在浙江省宁波、舟山等地养殖场,从濒死的梭子蟹体内分离出1205-11和1205-21两株菌。通过菌体形态、培养特性和生理生化反应,鉴定这2株菌分别为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和葡萄牙假丝酵母(Candida lusitaniae)。人工感染试验证实,这2株菌是梭子蟹肌肉乳化病的病原菌,葡萄牙假丝酵母为继发性感染病原,蟹体外部的损伤及蟹之间相互残伤可能是传染的主要途径。     

雅浦海沟深海沉积物可培养真菌多样性及其反硝化能力研究

自雅浦海沟4个站位的12个沉积物样品中分离得到38株真菌菌株,基于形态观察和ITS序列信息对所得菌株进行分类鉴定,发现它们分别属于青霉属(Penicillium,17株)、曲霉属(Aspergillus,7株)、篮状菌属(Talaromyces,1株)、枝孢属(Cladosporium,6株)、赭霉属(Ochroconis,1株)、Meyerozyma属(1株)、梅拉菌属(Meira,1株)、Cystobasidium属(2株)、Wallemia属(1株)和红酵母属(Rhodotorula,1株)等10个属.其中青霉属、曲霉属和枝孢属菌株为优势菌株,分别占分离菌株总数的44.7%、18.4%和15.8%;而Wallemia属(节担菌纲)菌株是首次从深海环境中分离到.利用PCR技术在分离的深海真菌菌株中检测nir K和P450nor两种反硝化关键酶基因,结果显示nir K基因可在黄曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、杂色曲霉(Aspergillus versicolor)、枝孢菌(Cladosporium sp.)、枝状枝孢(Cladosporium cladosporioides)和产黄青霉(Penicillium chrysogenum)等6种真菌菌株中检测到,而P450nor基因仅在黄曲霉菌株中检测到.同时还通过富集培养方法从上述沉积物样品中分离获得两株反硝化枝孢菌.结果表明,雅浦海沟深海沉积物环境中存在着丰富的真菌资源,它们在深海环境氮循环中起着一定作用,这将增强人们对深海环境可培养真菌多样性及其生态作用的认识.     

100株深海真菌次生代谢产物的生物活性初步研究

利用中国＂大洋一号＂第20航次采集的深海沉积物样品进行了真菌分离鉴定,获得110株深海真菌,这些菌分属于15个属.其中曲霉和青霉最多,共为55株,占50%,且重复较多,只分布于10个种.利用CCK8法及琼脂扩散法对其中的100株深海真菌进行了抗肿瘤及抗菌活性检测,发现深海真菌具有良好的生物活性,细胞毒阳性率占49%,26%的菌株具有明显抗大肠杆菌效果、23%明显抗枯草、5%抗白假丝酵母、21%抗金黄色葡萄球菌.生物活性与培养基成分及筛选用肿瘤细胞株类型相关.对具有生物活性的20株深海真菌发酵粗提物进行了HPLC指纹图谱初步分析,发现其HPLC指纹图谱与培养基成分相关.该研究为后期分离鉴定深海真菌产生的生物活性化合物奠定了良好基础.     

深海沉积物中龙须菜降解菌群的筛选与鉴定及多样性分析

以龙须菜为唯一的营养源对深海沉积物进行富集和筛选,获得一个可降解龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)、紫菜(Porphyra umbilicalis)和海带(Laminaria japonica)产生还原性寡糖的菌群.通过16S rRNA序列及16S rRNA-RFLP分析对该菌群中的细菌多样性进行了研究.结果表明,降解菌群中的细菌组成主要为弧菌属(Vibrio,8株)、火色杆菌属(Flammeovirga,7株)和希瓦氏菌属(Shewanella,5株),其中希瓦氏菌属和火色杆菌属的细菌在菌群中的丰度较高.采用龙须菜为唯一营养源的筛选培养基对菌群中的细菌进行分离,获得4株具有琼胶酶活力的细菌,包括2株火色杆菌属和2株希瓦氏菌属细菌.培养和未培养的结果均表明火色杆菌和希瓦氏菌这2个属为所研究的深海沉积物主要的龙须菜降解菌.对原始降解菌群和所分离的关键菌株进行了龙须菜酶解产糖能力的比较,结果发现菌群中的弧菌属菌株虽然自身没有酶解龙须菜的能力,但可能可以协助关键菌株,提高菌群对龙须菜的降解效率.因此本研究中所获得的菌群和菌株有望在琼胶寡糖的绿色生产中得到广泛应用.     

高压技术在深海沉积物兼性嗜压菌的筛选和鉴定中的应用

通过自行改进的高压培养罐及高压设备,对深海沉积物进行可培养微生物的筛选,获得6株具有较强耐受压力的细菌.16SrDNA的测序结果表明这些细菌分别属于6个不同的菌属.压力生长试验的结果表明这6株细菌在40MPa的条件下仍然具有较强的生长能力,属于兼性嗜压菌.对不同压力下生长的细菌做显微镜检,结果显示,除了一株芽孢杆菌在40MPa下的菌体形态发生了明显的变化外,其它5株细菌在压力条件下的菌体的分裂均没有受到明显的影响.     

3 株深海细菌的生理及分子生物学鉴定

从西菲律宾海底4954 m深的沉积物中分离到一批深海细菌,对其中编号为B2、B5、B6的3株细菌进行了生理、光学显微镜和扫描电镜观察,并且进行了分子水平鉴定。菌落呈圆球形,光滑,3株菌均带有颜色, B6菌呈乳白色, B2和 B5菌分别呈现鲜艳的橙色和红色。扫描电镜观察表明 B2和B6呈杆状,但B6菌外面覆有鞘膜, B5菌呈球状。生理实验表明,3株菌温度生长范围在37℃以下,最适生长温度分别为20、28、28℃,属于耐冷菌范畴。pH耐受范围为6~14,最适pH分别为8、8、12。3株细菌16S rRNA基因序列同源性分析表明,它们分属于芽孢杆菌(Bacillus)、节杆菌(Arthrobacter)、蛋白菌(Acinetobacter)3个不同的菌属。     

发光细菌法检测水产品中氯霉素体系的建立

从青岛近海分离的多株发光细菌中筛选出1株对氯霉素敏感的鳆发光杆菌Photobacterium leiognathi YL,接种单菌落快速培养,制备出适宜检测的菌悬液,添加不同浓度的氯霉素溶液,研究氯霉素浓度与细菌发光强度抑制率之间的关系.通过控制菌体起始发光强度、菌液与氯霉素作用时间,建立发光细菌检测水产品中氯霉素体系.结果表明,当菌体的起始发光强度控制在(2.0～4.0)×105、菌液与氯霉素的最佳作用时间为30 min时,氯霉素浓度与细菌发光强度抑制率呈良好的线性关系.该方法的线性范围为0.1～1.0 ng/mL,相关系数R2为0.989,该体系对氯霉素的检测灵敏度可以达到0.1 ng/mL,可以作为水产品中痕量氯霉素残留的1种快速、灵敏的检测方法.在水产品的氯霉素加标回收试验中,鱼肉中添加浓度为0.1～1.0 ng/g时,回收率在40.34%～114.26%之间.     

南海4种珊瑚附生可培养真菌多样性分析

本研究利用从南海采集的4种珊瑚分离附生真菌,并通过菌株的分类鉴定及系统发育分析获得珊瑚附生可培养真菌的多样性信息.选用酵母麦芽糖琼脂培养基(YM)、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、马丁氏培养基(Martin)、察氏琼脂培养基(CDA)和孟加拉红培养基(RBM)等5种培养基,采用平板涂布法培养分离附生真菌,基于ITS-rRNA基因序列对真菌菌株进行鉴定和系统发育分析.从4种珊瑚上共分离获得10个属的120株真菌,分别是:青霉属(Penicillum)56株、曲霉属(Aspergillus)25株、枝顶孢属(Acremonium)2株、枝孢属(Cladosporium)5株、毕赤酵母属(Meyerozyma)14株、隔孢伏革属(Peniophora)2株、拟茎点霉属(Phomopsis)1株、裂褶菌属(Schizophyllum)1株、梗孢酵母属(Sterigmatomyces)13株、篮状菌属(Talaromyces)1株.通过对不同珊瑚品种分离获得的附生真菌的比较,发现小叶鹿角珊瑚(Acropora microphthalma)和花鹿角珊瑚(Acropora floride)上分离到的菌株多样性最高,包含6属10种.进一步的分析发现不同珊瑚样品上真菌种类分布有较大差异,隔孢伏革属和裂褶菌属真菌均分离自小叶鹿角珊瑚,梗孢酵母属和篮状菌属均分离自角孔珊瑚(Goniopora sp.),扁脑珊瑚(Platygyra sp.)上则分离到拟茎点霉属.同时还发现不同培养基分离真菌的能力不同,YM培养基分离的菌株最多,CDA培养基分离真菌的多样性最多.以上的研究结果表明,南海珊瑚上存在大量且丰富的真菌资源,可以为后续生物活性物质的开发利用提供良好的菌种资源.     

南大西洋热液区沉积物可培养细菌的多样性分析和产酶活性鉴定

为获得深海可培养微生物资源,利用2216E培养基,采用涂布平板法从南大西洋热液区沉积物中分离可培养细菌,并通过16S rRNA基因进行分类鉴定.同时测定各菌株产淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、木聚糖酶、褐藻酸酶和脂肪酶(三丁酸甘油酯和吐温80)的能力.分离共获得216株菌株,经16S rRNA基因序列比对,共获得71株不同的菌株.其中包括变形菌纲62株、放线菌纲3株、芽孢杆菌纲2株和拟杆菌纲4株,分布于27个属,41个种.酶活检测结果显示,具有淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶(底物为三丁酸甘油酯)和脂肪酶(底物为吐温80)的产酶细菌分别为18、14、25、32株,供测细菌中未检出产果胶酶、木聚糖酶和褐藻酸酶的菌株.这些菌株为进一步研究开发提供了深海微生物资源.     

热带太平洋活性微生物菌株的筛选和鉴定

从热带太平洋的生物、海水、沉积物样品中分离到细菌、酵母和霉菌共475株．选择8个指示菌并采用圆形纸片法对分离菌株的发酵液进行抗菌和抗肿瘤活性筛选，获得20个具有抗菌和／或抗肿瘤活性的微生物菌株．细菌、酵母和霉菌活性菌株的筛选得率都比较低，分别为5．4％、2．2％和3．4％，其原因可能与纸片的发酵液的添加量较少和菌株发酵条件的控制有关．同时采用分子生物学方法鉴定了活性菌株，除4株未有结果外，其余菌株分归为9个属，其中芽孢杆菌属7株、占活性菌株的35％，盐单胞菌属2株、占10％，其它菌属各1株、占5％．抑菌谱分析表明，大多数活性菌株对革兰氏阳性细菌具有抑制作用，而来源于鱼体的菌株抑菌谱较广，对细菌、真菌均有拮抗作用，另外还发现一株酵母（Rhodosporidium toruloides）可抑制金黄色葡萄球菌．作者提出“活性指示（activity index）”参数，对活性菌株的抗菌谱和活性强度进行综合评估，也表明源于鱼体的菌株的活性指示值较高．这4株芽孢杆菌尤其是DY-Y-11A1A菌株，具有潜在的后续开发价值．     

南大西洋深海沉积物中可培养放线菌的多样性

探究了南大西洋深海沉积物中可培养放线菌的多样性,筛选药源活性次级代谢产物产生菌,为后续资源开发奠定基础.采用3种预处理方法及8种选择性培养基对南大西洋3个深海沉积物样品中的放线菌菌株进行选择性分离鉴定;利用兼并引物扩增法,选取代表菌株进行聚酮合酶（PKSⅠ、PKSⅡ）基因和非核糖体多肽合成酶（NRPS）基因的检测;以4株细菌为指示菌检测代表菌株的抑菌活性.共分离得到132株放线菌纯菌株,分布于放线菌亚纲的6个目、13个科、19个属中,其中有5个属为较新或较稀有种属,有2株为潜在新种.34株化合物合成基因检测菌中PKSⅠ基因、PKSⅡ基因呈阳性的比率均为17.64%,NRPS基因呈阳性的则为52.94%.抗枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和抗副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的菌株分别有47.06%和7.82%.南大西洋深海沉积物中放线菌资源丰富,存在较多潜在新分类单元,筛选到的活性菌株可用于后续药源活性次级代谢产物的分离.     

印度洋深海热液区可培养细菌的分子鉴定与系统发育分析

采用MMJHS寡营养培养基从印度洋深海热液区沉积物和热液硫化物中分离获得16株细菌,通过16S rDNA序列比对和生理生化分析,对它们进行了鉴定并构建了系统发育树.结果表明,12株细菌属于γ-变型菌(γ-Gammaproteobacteria),其中6株属于盐单胞菌属(Halomonas),4株属于嗜冷杆菌属(Psychrobacter),2株属于食碱菌属(Alcanivorax);其余4株属于芽孢杆菌(Bacillus),其中1株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis).分离获得的16株细菌中,4株为革兰氏阳性细菌,12株为革兰氏阴性细菌;H2S反应、吲哚测定反应、M.R和V-P均呈阴性.本研究为深入认识和开发利用深海热液区微生物资源奠定了基础.     

海洋酵母菌胞外酶及其基因的最新研究进展

综述海洋酵母菌所产多种胞外酶的生产、纯酶性质及基因克隆工作的最新研究进展.从实验室建立的500多株海洋酵母菌种资源库中筛选出了数十株可以产生多种不同活性胞外酶的海洋酵母菌,它们分别属于耶鲁维亚酵母菌(Yarrowia)、类酵母(Aureobasidium)、毕赤氏酵母菌(Pichia)、梅奇酵母菌(Metschnikowia)和隐球酵母菌(Cryptococcus)等不同种属.所产生的胞外酶主要包括纤维素酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶、淀粉酶(包括生淀粉酶)、菊糖酶、脂酶、植酸酶和嗜杀因子等.深入进行了各种胞外酶的生产,纯化及纯酶的性质研究,并对部分菌株的胞外酶基因进行了克隆、测序和表达,这些研究有助于对海洋酵母胞外酶的理论研究和生产应用价值的了解和对于海洋酵母菌资源、生理和遗传的进一步深入研究.     

2株海马肠道益生菌的筛选与初步鉴定

从正常养殖的健康线纹海马(Hippocampus erectus)肠道中分离纯化到52株细菌,通过溶血性实验对肠道菌群进行初筛,结果发现52株肠道细菌均不产生溶血素,不具有潜在的致病性.以纸片扩散法在胞外蛋白酶选择培养基上对菌株产蛋白酶的能力进行测试,筛选出2种能够分泌胞外蛋白酶的菌株.动物安全性实验证实2株实验菌对海马无明显的毒害作用.海马生长参数测定实验显示投喂菌株的实验组体长、体重的日平均增长率均高于不投喂菌株的对照组,证明所筛选菌株具有一定的生长促进作用,有望对其进行海马养殖微生物制剂的开发.随后测定了2株细菌的16S rRNA基因序列,分析相应细菌序列的同源性,构建系统发育树,结合菌株生理生化特性及其表型特征,分别将Hm7与Hm28鉴定为Bacillus horikoshii和Pseudoalteromonas carrageenovora.     

深圳福田红树林生态中放线菌的筛选及其抗菌活性测定

从深圳福田红树林根际于不同季节采集的3份土样和2份水样中分离得到95株放线菌,94%的放线菌为链霉菌科。测定95株放线菌发酵液对病菌的抗菌活性,82%的放线菌发酵液有不同程度的抗菌作用,对革兰氏阳性细菌(G )的抗菌作用最强。测定其中6株放线菌发酵液对细菌、霉菌和酵母的抗菌活性,各具有不同的抗菌谱:s33,s48和s68具有广谱的抗菌活性;s10和s87只能抑制细菌;s67b不能抑制革兰氏阴性细菌(G-)。s10发酵液的最小抑菌浓度<0.125μL/mL。     

海洋霉菌抗真菌作用的研究Ⅰ.具广谱抗菌活性的海洋霉菌M182的分离

从南海海泥中分离出一株霉菌（编号为Ｍ１８２）,经初步鉴定为青霉（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｓｐ．）。该年所产生的广谱抗生素,对细菌、酵母及丝状真菌均有抑制作用。     

南海深海氮循环微生物的原位培养与多样性分析

借助自主研发的深海水体原位定植培养系统,在南海3 300 m的深海水体中进行了氮循环微生物的原位培养.通过向富集仓中投加缓释肥(铵盐、硝酸盐和尿素)进行了为期17个月的原位富集.结合高通量测序技术和分离培养的方法,对深海原位富集物及实验室二次富集物进行了微生物多样性分析. 16S rRNA基因高通量测序结果表明,在南海原位富集样品中,细菌以变形菌门丰度最高,富集仓内脱脂棉附着介质和仓内水样中的最优势属分别为希瓦氏菌属(Shewanella)和科韦尔氏菌属(Colwellia);古菌以奇古菌门为主,其中氨氧化古菌(AOA)所占比例很高.通过平板培养分离到17株细菌,主要包括盐单胞菌属(Halomonas)、海杆菌属(Marinobacter)和亚硫酸盐杆菌属(Sulfitobacter)等.通过不同起始氮源(氨氮、硝酸盐、亚硝酸盐)和培养温度(28℃和10℃),对原位富集样品进行实验室二次富集,获得了5个富集菌群.分析发现,它们均具有较好的脱氮效果,可以产生N_2O或N_2;这些菌群均以盐单胞菌属占绝对优势,其次为海源菌属(Idiomarina)或海杆菌属,其中盐单胞菌和海源菌成功获得分离.单菌功能验证表明,分离获得的盐单胞菌具有好氧反硝化能力,其在原位环境下反硝化活性尚有待确认.