养殖大黄鱼(Pseudosciaena crocea)3种致病弧菌的分子鉴定及其系统发育学分析

从患病养殖大黄鱼分离到3株病原菌H040823-1、H050704-1、H050815-1,经常规生理生化鉴定均属于弧菌属的种类,API20E快速鉴定菌株H040823-1为副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyti-cus),菌株H050815-1为溶藻弧菌(V.alginolyticus),菌株H050704-1不在API20E鉴定谱内。为了进一步确定其分类地位,测定了3株病原菌的16S rRNA和HSP60(heat shock protein,HSP60)基因部分序列。16S RNA基因系统进化分析表明,3株病原菌与副溶血弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌亲缘关系较近,相互之间同源性均大于96.9%,差异不明显。HSP60基因序列分析表明,菌株H040823-1、H050704-1、H050815-1的HSP60基因序列分别与V.parahaemolyticus(AF230951)、V.harveyi(EU036994)、V.alginolyticus(DQ664545)的同源性最高,分别为96.7%、99.8%和98.0%,而与其他弧菌HSP60基因的同源性均低于91.9%,3株病原菌相互之间同源性低于92.3%,差异显著。HSP60基因构建的系统进化树表明,H040823-1、H050704-1、H050815-1分别与V.parahaemolyticus、V.harveyi、V.alginolyticus聚类。综合以上结果,菌株H040823-1、H050704-1、H050815-1可分别鉴定为副溶血弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌。结果表明,HSP60基因比16S rRNA基因更适合用于海水鱼类致病性弧菌种间的分类研究。     

大黄鱼溶藻弧菌LPS的间接ELISA检测

用酚 水法从20dm3溶藻弧菌培养液中分离得到脂多糖(LPS)97.6mg,以0.5mg cm3的LPS溶液通过耳缘静脉注射免疫实验兔,经过3次加强注射后从颈动脉放血制备抗血清.该抗血清的效价为1∶2560,对副溶血弧菌等10株细菌的交叉反应效价都较低.用免疫吸附过滤法去除血清中的非特异性成分.用吸附后的抗血清进行溶藻弧菌间接ELISA检测,其检测限为97×104个 cm3.以ELISA进行大黄鱼体内溶藻弧菌检测.结果表明:用LPS抗血清可以较为灵敏地检测大黄鱼体内的溶藻弧菌,该方法不仅可以用于诊断大黄鱼的溶藻弧菌病,也可以检测无病症带菌大黄鱼.     

大黄鱼病原菌──溶藻弧菌的ELISA快速检测研究

以灭活溶藻弧菌（0.05%甲醛，30℃,8h）制成菌苗，注射免疫实验兔获得抗血清。该抗血清经吸附后与副溶血弧菌、河流弧菌等10株对照菌株无交叉反应，用该抗血清进行溶藻水中溶藻弧菌浓度均低于最低检测限、外观健康大黄鱼肝脏中溶藻弧菌的阳性检出率为20%、患病大黄鱼的阳性检出率为80%，表明ELISA法不仅可以用于诊断大黄鱼的溶藻弧菌病，也可能检测无病症带菌大黄鱼。     

三种致病弧菌感染对大黄鱼非特异性免疫功能的影响

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolytic-us)是引起大黄鱼(Pseudosciaena crocea)溃疡病的3种主要致病菌.将试验大黄鱼随机分成4组,分别腹腔注射哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和灭菌生理盐水,在感染后的不同时间采样,通过白细胞数量、白细胞分类计数、NBT阳性细胞数量以及溶菌酶活力的变化趋势来探讨3种致病弧菌感染对大黄鱼非特异性免疫功能的影响.结果表明,大黄鱼各项血液指标的变化主要发生在感染后的1～7 d.在人工感染的初期,各实验组大黄鱼外周血的白细胞数量、NBT阳性细胞数量呈现先增加后降低的趋势,淋巴细胞、嗜中性粒细胞百分比显著降低(p<0.05),单核细胞百分比显著提高(p<0.05);随着时间的延长,白细胞数量开始下降;淋巴细胞、嗜中性粒细胞百分比有所上升,7 d以后各类血细胞数量变化不显著.其中哈氏弧菌感染组在白细胞数量、NBT阳性细胞数量等多个指标上的变化最为明显.血清中溶菌酶活性显著高于脾组织,鱼体受感染后两者溶菌酶活性均较对照组有显著提高,不同致病菌与大黄鱼非特异性免疫功能之间呈现一定的时效差异.研究认为反映鱼体受感染后从应激反应发生至非特异性免疫功能的发挥主要发生在病原菌感染前期,不同致病菌与大黄鱼非特异性免疫功能之间呈现一定的时效差异.     

溶藻弧菌对大黄鱼表皮黏液的黏附特性研究

采用3H-TdR同位素示踪方法研究了溶藻弧菌对大黄鱼表皮黏液的黏附机制.试验结果表明溶藻弧菌经营养饥饿、热处理、抗体处理、蛋白酶及高碘酸处理后黏附作用明显下降;在8种碳水化合物的干扰下溶藻弧菌的黏附作用会有一定程度的变化,其中葡萄糖、果糖、甘露糖能明显促进溶藻弧菌的黏附作用;溶藻弧菌对大黄鱼表皮黏液中较大分子量的物质有较强的亲和力.这些结果表明溶藻弧菌对大黄鱼表皮黏液存在特异性黏附作用,这种黏附与细菌活力、其表面的蛋白类、糖类等物质以及黏液的化学组成都有密切关系.     

海水网箱养殖大黄鱼弧菌病的病原菌

从网箱养殖患病的大黄鱼（Ｐｓｅｕｄｏｓｃｉａｅｎａ ｃｒｏｃｅａ）肝、肾、脾等组织分离两株病原菌,进行纯化培养、人工感染、药敏试验及菌种鉴定等研究,根据形态及生理生化特征,致病菌定为溶藻弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）。药敏实验的结果表明,氯霉素、庆大霉素、妥布霉素和复方新诺明等对致病菌有较强的抑制作用。     

大黄鱼病原菌——溶藻弧菌的EuSA快速检测研究

以灭活溶藻弧菌(0.05%甲醛,30℃,8h)制成菌苗,注射免疫实验兔获得抗血清.该抗血清经吸附后与副溶血弧菌、河流弧菌等10株对照菌株无交叉反应.用该抗血清进行溶藻弧菌ELISA检测,其最低检测极限为97000cfu/ml.将该方法应用于养殖现场,检测结果为海水中溶藻弧菌浓度均低于最低检测限、外观健康大黄鱼肝脏中溶藻弧菌的阳性检出率为20%、患病大黄鱼的阳性检出率为80%,表明ELISA法不仅可以用于诊断大黄鱼的溶藻弧菌病,也可以检测无病症带菌大黄鱼.     

养殖大黄鱼副溶血弧菌的酶联免疫吸附法研究

本文建立了网箱养殖大黄鱼病原菌--副溶血弧菌酶联免疫吸附法,也即间接ELISA快速检测方法.用0.5×10-3(V/V)甲醛、30℃作用8h灭活病原菌制成菌苗.用该菌苗免疫新西兰兔获得特异性抗血清,以辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG为标记第二抗体,对副溶血弧菌进行间接ELISA快速检测,其最低检测极限为5×104CFU/cm3.现埸检测养殖水体中没有副溶血弧菌检出,患病大黄鱼肝脏副溶血弧菌的检出率为70%,外观健康大黄鱼肝脏副溶血弧菌的检出率为20%.现埸检测结果表明间接ELISA检测法不仅可以用于患病大黄鱼病原菌的快速检测,而且能够检测出无病症带菌大黄鱼.     

大黄鱼病原弧菌拮抗菌筛选

用平板涂布法从集美海边分离到381株细菌,用平板划线法或点种法检验这些海洋细菌对两株病原弧菌(副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的拮抗作用。从中挑选2株对海水养殖动物病原弧菌有较好拮抗作用的细菌,编号为GX75和GZ46。对拮抗菌(GX75和GZ46进行了抗菌谱测定,结果表明,GX75对9株指示菌中的副溶血弧菌、河流弧菌和坎普氏弧菌有较好的拮抗作用,GZ46对副溶血弧菌、溶藻弧菌和坎普氏弧菌有较好的桔抗作用。在营养肉汤中,测定了GX75和GZ46的抗菌作用,表明(GX75和GZ46对副溶血弧菌拮抗作用很明显。     

大黄鱼病原弧菌耐药质粒转移研究

用混合培养法进行耐药质粒从大肠杆菌 (Escherichiacoli)向病原弧菌转移研究 ,结果表明 ,耐药质粒 pBR322和 pBR325可以从大肠杆菌向病原弧菌转移。在混合培养30min后 ,部分弧菌获得耐药质粒 ,质粒的转化率随着培养时间的延长而增大 ;混合培养24h后 ,转化率分别提高至4.62×10-6～1.18×10-5。耐药质粒 pBR322和 pBR325在2株病原弧菌细胞内能较为稳定地遗传 ,在培养初期 (0～1h) ,均未出现质粒丢失 ,随着培养时间的延长 ,有少量细胞因丢失耐药质粒而表现出对药物的敏感性 ;培养72h后 ,质粒 pBR322和 pBR325在副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)中的丢失率分别为10 %和9% ,溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)中2种质粒的丢失率分别为22%和19 %。细菌的药敏试验表明不同菌株在获得耐药质粒后对特定药物的抗性大大增强 ,但不同菌株的耐药水平有所不同 ,说明耐药质粒在不同菌株中的表达水平有所不同。     

海洋放线菌对大黄鱼病原弧菌的拮抗作用和抗菌谱

在大黄鱼（Pseudosciaena crocea)病原弧菌的拮抗放线菌筛选和人工诱变基础上，选择出对溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus)和副溶血弧菌（V.paradaemolyticus)同时具有较强拮抗作用的4株放线菌，采用琼脂块法测定4株放线菌的抗菌谱，并检测4株放线菌分别在固体和液体培养液中的拮抗作用，结果表明：4株放线菌的抗菌谱均较窄，在固体和液体培养基中对2种病原弧菌都有较强的拮抗作用。     

溶藻弧菌脂多糖对大黄鱼的毒性与免疫保护性试验

用酚水法从20dm3大黄鱼的病原菌--溶藻弧菌菌液分离出脂多糖(LPS)溶液380cm3,冻干后得到LPS粉末97.6mg.在注射剂量为0.2cm3不同浓度LPS溶液对大黄鱼肌肉注射毒性试验中,LPS注射浓度为0.5 mg/cm3 时, 5d内能引起大黄鱼死亡;当LPS浓度提高到2 mg/cm3时,大黄鱼的死亡率达到100%.以剂量为0.2 cm3、浓度为0.2 mg/cm3的LPS溶液对大黄鱼进行免疫注射,15d后用0.2cm3浓度为9×108 个/cm3的溶藻弧菌进行攻毒试验,40%的大黄鱼获得免疫保护.     

大黄鱼病原副溶血弧菌单克隆抗体制备及其应用

用甲醛灭活副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和溶藻弧菌(V.alginolyticus)制成免疫原免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,获得1株特异的针对副溶血弧菌的单克隆抗体,命名为D6F3H5。腹水及培养上清液抗体的ELISA效价分别为:1∶5 120和1∶1 280,该单克隆抗体与其它细菌没有明显的交叉反应。利用该单克隆抗体和兔抗副溶血弧菌多克隆抗体,建立了检测副溶血弧菌的双抗体夹心ELISA方法。该方法对副溶血弧菌的最小检出量为5×104个/mL。用双抗体夹心ELISA检测大黄鱼(Pseudosciaena crocea)样品,14尾患病大黄鱼中有11尾检出副溶血弧菌,而10尾健康大黄鱼都没有检出副溶血弧菌。由此可见,本试验制备的高特异性的抗副溶血弧菌单克隆抗体,可以用于患病大黄鱼副溶血弧菌的快速诊断。     

大黄鱼病原弧菌拮抗放线菌的筛选与人工诱变

从厦门集美海滩底泥分离得到38株放线菌，用琼脂块法测定它们对大黄鱼病原弧菌-溶藻弧菌和副溶血弧菌的拮抗效果，选择两株拮抗效果较好的放线菌进行诱变，测定诱变后各菌株的抗菌效果，并选择抗菌效果较好的菌株进行第二次诱变，如此反复诱变3次，共得到97株放线菌，结果表明；38株放线菌中的22株对两株病原菌有一定的拮抗作用；用紫外线照射可以获得少量对两株病原菌拮抗作用加强的菌株。     

Adhesion of pathogenic Vibrio alginolyticus to the gill mucus of Pseudosciaena crocea

Adhesion of Vibrio alginolyticus to the gill mucus of Pseudosciaena crocea has been investigated using [methyl—3H]thymidine as isotope tracer. The results showed that: the adhesive quantity of V. alginolyticus increased with bacterial concentrations and reached equilibrium after incubated for 180 min; the higher adhesive quantity was obtained at 15~30 ℃ and sourish conditions; adhesion of V. alginolyticus could not achieved without Na , and Ca2 played an auxiliary role in the bacterial adhesion; adhesion of V. alginolyticus was inhibited remarkably by starvation, heat treatment and periodic acid treatment; all of the eight kinds of carbohydrates investigated enhanced the adhesion of V. alginolyticus to the gill mucus of P. crocea, among them, glucose, mannose, fructose and maltose showed the specially enhanced adhesion. The results indicated that V. alginolyticus could adhere to the gill mucus of P. crocea facilely in seawater, and this bacterial adhesion was influenced by environmental factors and closely related to superficial carbohydrate structures and some heat-sensitive structures.     

病原性溶藻弧菌对大黄鱼鳃黏液黏附作用研究

采用3H-TdR同位素示踪方法研究了溶藻弧菌对大黄鱼鳃黏液黏附作用.结果表明,溶藻弧菌的黏附量随着菌浓度的增加而升高并在180 min后达到饱和;在温度15~30℃、pH偏酸条件下黏附作用较强,Na+是溶藻弧菌黏附作用必需的,Ca2+起着辅助作用;溶藻弧菌经营养饥饿、热处理及高碘酸处理后黏附作用有明显下降;8种碳水化合物都有不同程度的促进溶藻弧菌的黏附作用,其中葡萄糖、甘露糖、果糖及麦芽糖有明显促进作用.研究结果表明:海水中的溶藻弧菌可很好地黏附于大黄鱼鳃黏液,其黏附作用受环境因子影响,并且与溶藻弧菌的表面碳水化合物、热敏结构等有着密切关系.