马氏珠母贝珍珠囊发育的组织和组织化学研究

按照常规技术进行马氏珠母贝插核育珠,在手术后第1、3、7、15、20、30和60天解剖剪取珍珠囊,利用H E染色等组织化学方法研究马氏珠母贝珍珠囊形成过程中的组织学和组织化学变化。结果表明:珍珠囊表皮细胞来自于移植细胞小片的表皮细胞;在水温27℃条件下,插核后1~3 d来自育珠贝的游走细胞逐渐将细胞小片包围;插核后7~15 d,珠核表面密集来自育珠贝的游走细胞;插核后15～20 d,细胞小片外表皮细胞增殖形成珍珠囊,珍珠囊表皮细胞和细胞核均呈扁平状;插核后20～30 d,扁平状珍珠囊表皮细胞逐渐转变为高柱型,并分泌形成透明的壳皮层物质;在插核后第60天,已形成具有分泌珍珠质功能的扁平状珍珠囊表皮细胞,细胞核呈椭圆形或近圆形。     

Janus激酶3抑制剂对马氏珠母贝珍珠囊发育和免疫相关基因表达的影响

【目的】研究JAK3抑制剂对珍珠囊发育及移植免疫反应的影响。【方法】以马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)为材料,植核前用JAK3抑制剂处理细胞小片和珠核,植核后18 d和30 d取珍珠囊,用石蜡切片技术和H.E.染色法(Hematoxylin-eosin Staining)观察JAK3抑制剂对珍珠囊发育的影响,利用荧光定量技术检测植核后不同时间(6、12、24 h和3、6、12、18、30 d)免疫相关基因NF-kappaB(Nuclear factor kappa B)、IkappaK(I-kappaB kinase)和炎性诱导因子IL-17(Interleukin 17)的表达变化。【结果】植核后18 d和30 d,与对照组相比,JAK3抑制剂对珍珠囊的发育没有显著影响(P> 0.05)。荧光定量结果显示,植核后6 h和12 h,JAK3抑制剂可以显著性抑制IL-17的表达,植核后6、3、6、12 d,JAK3抑制剂可以显著性抑制NF-kappaB的表达,植核后3、6 d,JAK3抑制剂可以显著性抑制IkappaK的表达(P <0.05)。【结论】JAK3抑制剂对马氏珠母贝免疫基因表达有明显的抑制作用,可以有效调控珍珠贝植核后的移植免疫,而对珍珠囊发育的影响不明显。     

马氏珠母贝生长性状与珍珠质量和珍珠层厚度的相关分析

以马氏珠母贝快速生长选系F3为材料,以常规技术插核操作并进行海区养殖,育珠期结束,测量育珠母贝的壳长、壳高、壳宽、总质量与壳质量共5个生长性状指标,以及商品珍珠质量与珍珠层厚度,分析育珠贝生长性状指标与珍珠层厚度及珍珠质量的相关性。结果表明:马氏珠母贝的生长性状与珍珠层厚度及珍珠质量均存在极显著相关性(p值<0.01);壳长、壳高、壳宽、总质量、壳质量与珍珠层厚度的相关系数分别为0.481、0.412、0.418、0.457、0.456;壳长、壳高、壳宽、总质量、壳质量与珍珠质量的相关系数分别为0.467、0.468、0.380、0.556、0.644。通过改良马氏珠母贝养殖群体的生长性状能够有效提高珍珠的质量。     

琥珀酰化修饰对马氏珠母贝植核免疫的影响

【目的】研究蛋白质琥珀酰化修饰在马氏珠母贝（Pinctada fucata martensii）植核后免疫应答中的作用,为阐明珍珠贝植核反应的分子调控机制提供理论依据。【方法】通过对马氏珠母贝注射琥珀酸钠模拟提高琥珀酰化修饰水平,检测马氏珠母贝植核后鳃组织总蛋白琥珀酰化程度、免疫相关基因表达、抗氧化相关酶酶活以及珍珠贝的存活率和留核率。【结果与结论】注射琥珀酸钠后,鳃组织琥珀酰化修饰水平在12 h和72 h显著上升;使用实时荧光定量PCR检测胁迫应激相关基因的时序表达,胁迫应激相关因子SOD和Caspase2在6 h表达量显著上调,NF-κB和IRAK1在48 h表达量显著上调,TRAF3和IκK的表达量在96 h显著上调（P <0.05）,表明琥珀酰化修饰水平提高后受体贝机体细胞免疫增强;抗氧化相关酶、过氧化物酶和谷胱甘肽活性都在96 h出现显著上调（P <0.05）,表明受体贝体液免疫增强。与对照组[磷酸盐缓冲溶液（PBS）+植核]和植核组相比,实验组（琥珀酸钠+植核）中珍珠贝的存活率在7 d和45 d存在显著差异,在60 d留核率显著上升（P <0.05）。结果...     

马氏珠母贝免疫活性肽的纯化与鉴定

为制备马氏珠母贝免疫活性肽,以马氏珠母贝全脏器为原料,利用体外模拟消化的方法对其进行酶解,然后通过超滤系统收集分子量小于3 ku的酶解液。采用细胞培养方法,以体外免疫活性为指标,利用Sephadex G-25凝胶柱层析、Capto Q强阴离子交换色谱等对马氏珠母贝酶解液进行分离纯化与筛选,获得2个具有免疫活性的肽段,利用电喷雾静电场离子阱串联质谱分别对2个活性肽序列进行测定。结果表明:一个肽的相对分子质量为245.0,肽序列为Ala-Arg/Pro-Met;另一个别肽的相对分子质量为274.0,肽序列为Val-Arg。在浓度0.3 mg/m L时,2种肽能显著促进脾淋巴细胞的增殖与提高巨噬细胞的吞噬能力,表明这2种肽均具有较好的免疫活性。     

光合细菌在马氏珠母贝育苗中的应用

研究了光合细菌（下简称ＰＳＢ）作为饵料添加剂在马氏珠母贝育苗中的饵料效果。结果表明：（１）单独投喂ＰＳＢ,幼虫能生长发育并附着变态形成稚贝,但其长速,稚贝总育成率均低于单独投喂单胞藻的对照组;（２）用ＰＳＢ与单胞藻混合投喂,幼虫的长速,稚贝总育成率均高于对照组;（３）添加ＰＳＢ后,在眼点幼虫附着前不换水,幼虫的长速和眼点形成率均高于换水;但在眼点幼虫进入附着期仍不换水,则稚贝生长速度,总有成率均低     

马氏珠母贝育苗方法的多因素试验

用正交试验的方法观察影响马氏珠母贝育苗效果的七个因素：ＥＤＴＡ（Ａ）、水处理（Ｂ）、换水（Ｃ）、充气（Ｄ）、光照（Ｅ）、抗菌素（Ｆ）、倒池（Ｇ）。结果表明：影响成活率的显著因素为Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ；影响贝苗生长的显著因素为Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ。加入ＥＤＴＡ、利用砂滤海水、每天换水、微弱充气、较暗的光照、使用抗菌素和定期倒池为浮游幼虫期较优的育苗方法。     

马氏珠母贝激光育苗的生物学机理

对马氏珠母贝激光育苗的机理进行研究，结果表明：激光能加强精子活力，提高精液品质；影响卵子的通透性；抑制水中的细菌生长，使受精卵发育成健壮的胚胎、幼虫、幼苗。     

马氏珠母贝外海深水区养殖的初步研究

采用延绳式,浮筏式,立桩式在外海深水区进行马氏珠母贝「Ｐｉｎｃｔａｄａ ｍｑａｒｔｅｎｓｉｉ（Ｄｕｎｋｅｒ）」人工养殖试验,结果表明：经１１个月的养殖,其成活率分别为延绳式５６．３％,浮筏式３２．８％,立桩式２０．８％,而 期在 水区养殖时,其成活率分别为浮筏式２８．８％,立桩式１８．５％。     

氨氮胁迫对马氏珠母贝免疫活性的影响

在实验室条件下探讨氨氮胁迫对马氏珠母贝(Pinctada martensii)血细胞密度、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、溶菌酶(LSZ)、酸性磷酸酶(ACP)活性的影响。结果表明:1)不同浓度氨氮(1.25~40 mg/L)胁迫3 d后,马氏珠母贝血细胞密度随氨氮浓度的增加呈下降趋势,当氨氮浓度超过5 mg/L时血细胞密度较对照组明显下降,差异极显著(P<0.01);2)血清SOD活性随实验氨氮浓度(1.25~40 mg/L)的增加而明显下降,在较低氨氮浓度(1.25~5 mg/L)时,SOD活性高于对照组,氨氮浓度超过10 mg/L时,SOD活性低于对照组,各实验组SOD活性与对照组均存在极显著差异(P<0.01);3)当氨氮浓度为1.25~20 mg/L时,马氏珠母贝血清CAT活性随氨氮浓度的增加而升高,除氨氮1.25 mg/L组外,其余各实验组血清CAT活性较对照组极显著升高(P<0.01),当氨氮浓度为30~40 mg/L时,血清CAT活性呈急剧下降趋势,且低于对照组(P<0.01);4)马氏珠母贝血清LSZ活性随实验氨氮浓度的增加而降低,当氨氮浓度为10 mg/L以下时,血清LSZ活性高于对照组,当氨氮浓度为20 mg/L以上时,血清LSZ活性较对照组极显著降低(P<0.01);5)氨氮浓度为1.25~10 mg/L时,马氏珠母贝血清ACP活性随氨氮浓度的增加而升高,且高于对照组(P<0.01),当氨氮浓度超高20 mg/L时,马氏珠母贝血清ACP活性随氨氮浓度的增加急剧降低,且低于对照组(P<0.01)。     

马氏珠母贝贝壳基质蛋白基因Pm-PNU7的克隆和功能研究

【目的】研究马氏珠母贝(Pinctada martensii)贝壳基质蛋白(Shell Matrix Proteins, SMPs)基因(Pm-PNU7)表达与功能。【方法】利用马氏珠母贝基因组和蛋白质组信息分析和RACE技术克隆获得壳基质蛋白新基因Pm-PNU7全长序列,通过原位杂交对其进行定位,RNA干扰检测其对贝壳形成的影响。【结果】Pm-PNU7的cDNA全长为797 bp,编码145个氨基酸,具有特殊的"KGG"重复序列和富含天冬氨酸(Asp)序列"DDDDDDHDD"。qRT-PCR分析表明,Pm-PNU7基因在外套膜边缘区和套膜区显著高表达(P<0.05);ISH检测显示,Pm-PNU7主要定位于边缘区外褶外侧和内侧上皮细胞、中褶内侧上皮细胞以及套膜区外侧上皮细胞。RNA干扰后,Pm-PNU7在外套膜边缘区和套膜区的表达量均显著下调,贝壳棱柱层和珍珠层微观结构均出现不同程度的紊乱。【结论】Pm-PNU7参与了贝壳棱柱层和珍珠层的形成。     

珠母贝糖胺聚糖胶囊制备与检测

以马氏珠母贝糖胺聚糖粗品为主要功能成分,以β-环糊精为辅料,制成珠母贝糖胺聚糖胶囊,并进行检测。结果表明:该胶囊中水分、总糖、糖胺聚糖(GAG)和粗蛋白质量分数分别为8.85%、85.23%、3.00%和3.60%;胶囊的装量差异与崩解时限均符合质量标准;胶囊制剂中细菌总数小于1000 g-1,大肠杆菌MPN小于30 g-1,霉菌和酵母菌总数小于25 g-1,符合《保健食品通用卫生要求》规定;致病菌均未检出。     

马氏珠母贝早期生长性状的遗传参数估计

以马氏珠母贝选育系F6代为亲本,采用巢式设计方法和人工解剖授精技术,依照1雄配3雌的原则,建立了8个父系半同胞家系和24个母系全同胞家系,在第8、21、35和50天测定了每个母系全同胞个体的壳长和壳高,以全同胞组内相关分析法估计马氏珠母贝早期生长性状的遗传参数。结果表明,母系半同胞个体具有较大的变异程度,存在着较大的母性效应,父系半同胞组内相关分析法估算的狭义遗传力是马氏珠母贝遗传力的估计值。8-50日龄壳长狭义遗传力估计值为0.11~1.14,壳高狭义遗传力估计值为0.12~1.04,其中利用父系半同胞组内相关法估计壳长的遗传力依次为0.17、0.19、0.12、0.11,壳高的遗传力依次为0.20、0.23、0.13、0.12,属于中等遗传力。马氏珠母贝早期生长性状的遗传相关和表型相关表现为一定的正相关,相关系数的范围分别为0.528~0.746和0.747~0.921。在早期生长阶段以壳长或壳高为参数进行选择育种时,具有较大的遗传改良潜力。     

马氏珠母贝幼虫假单胞菌病的初步研究

马氏珠母贝人工育苗过程中幼虫经常发生一种严重的病害。发病幼虫症状如下：消化盲囊颜色由正常的均匀的黄绿色变成不均匀的茶褐色或无色;胃中的食物长时间不能消化并变成茶褐色;幼虫趋光性差,活力弱,不能集群,不久即大量下沉死亡。对发病幼虫进行了细菌的分离和纯化,得到3株纯化的菌株,对“D”型幼虫的人工感染试验证实：9401和9402两株菌株是致病菌,通过对细菌进行群体及个体形态观察、生化实验,鉴定9401和9402两株菌株均属假单胞菌（Pseudomonas）。对这2株菌株进行了药物敏感试验、药物预防试验,结果表明,2株菌株对氯霉素、痢特灵、氟哌酸敏感,2×10－6氯霉素可达到预防的目的。     

马氏珠母贝外海深水区养殖的初步研究

采用延绳式、浮筏式、立桩式在外海深水区进行马氏珠母贝［Ｐｉｎｃｔａｄａ ｍ ａｒｔｅｎｓｉｉ （Ｄｕｎｋｅｒ）］人工养殖试验,结果表明：经 １１ 个月的养殖,其成活率分别为延绳式 ５６．３％ ,浮筏式 ３２．８％ ,立桩式２０．８％ ,而同期在港湾浅水区养殖时,其成活率分别为浮筏式 ２８．８％ ,立桩式 １８．５％ 。而且外海深水区养殖马氏珠母贝生长快,个体大,体质强,病害少,附着物少。此外,外海深水区延绳式养殖设施抗风浪能力强,是开发利用外海深水区的一种良好方式     

κ-卡拉胶对马氏珠母贝肌肉水溶性蛋白稳定性的影响

【目的】探究Kappa-卡拉胶对马氏珠母贝肌肉水溶性蛋白稳定性的影响,为进一步开发利用马氏珠母贝肉以及改善水产肌肉蛋白加工特性提供数据参考。【方法】以马氏珠母贝肌肉水溶性蛋白(WSP)为研究对象,采用浊度法、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析不同pH值条件下,热处理前后kappa-卡拉胶对WSP稳定性的影响,同时利用凝胶过滤层析对WSP进行了初步的分离及分子质量分布分析。【结果】热处理前后,在酸性条件下(pH<4.0)添加了kappa-卡拉胶的胶体蛋白混合体系(K-WSP)透光率均下降;热处理前,pH4.0～5.0范围内,与WSP对照,K-WSP混合体系透光率上升,而pH> 5.0条件下,kappa-卡拉胶对WSP体系透光率无显著性影响;热处理后,pH 4.0～7.5范围内,与WSP对照,K-WSP混合体系透光率上升,而pH>8.0条件下,kappa-卡拉胶对WSP体系透光率无显著性影响。SDS-PAGE结果显示:热处理前,酸性pH条件下与未添加WSP相比较,K-WSP在35 ku附近条带较多。热处理后,WSP和K-WSP的大分子蛋白组分(200、116 ku)均基本发生了热变性。WSP分离纯化曲线显示出两个组分,分子质量分别分布于200～35 ku和35～14.4 ku。【结论】pH值4.0～5.0条件下,kappa-卡拉胶对WSP的热稳定性有一定促进作用。     

马氏珠母贝选系F_2早期选择反应和现实遗传力估计

对马氏珠母贝基础群体进行持续选择建立选系F2,比较了选系F2与对照群体早期生长差别,并估计了选择反应和现实遗传力。结果表明,在第8、14、21和35天,选系F2的平均壳长显著大于对照群体(P<0.05)。在第8、14、21和35天,选择反应和现实遗传力变化范围分别为0.63～0.89和0.36～0.51。本研究表明利用群体选择可以明显改良马氏珠母贝养殖群体的生长性状。     

Kinetic study of alkaline protease 894 for the hydrolysis of the pearl oyster Pinctada martensii

A new enzyme (alkaline protease 894) obtained from the marine extremophile Flavobacterium yellowsea (YS-80-122) has exhibited strong substrate-binding and catalytic activity, even at low temperature, but the characteristics of the hydrolysis with this enzyme are still unclear. The pearl oyster Pinctada martensii was used in this study as the raw material to illustrate the kinetic properties of protease 894. After investigating the intrinsic relationship between the degree of hydrolysis and several factors, including initial reaction pH, temperature, substrate concentration, enzyme concentration, and hydrolysis time, the kinetics model was established. This study showed that the optimal conditions for the enzymatic hydrolysis were an initial reaction pH of 5.0, temperature of 30°C, substrate concentration of 10% (w/v), enzyme concentration of 2 500 U/g, and hydrolysis time of 160 min. The kinetic characteristics of the protease for the hydrolysis of P. martensii were obtained. The inactivation constant was found to be 15.16/min, and the average relative error between the derived kinetics model and the actual measurement was only 3.04%, which indicated a high degree of fitness. Therefore, this study provides a basis for the investigation of the concrete kinetic characteristics of the new protease, which has potential applications in the food industry.