基于SAMPL的一种微卫星筛选方法在中国明对虾中的尝试

微卫星的发展主要受限于微卫星及其旁侧特异引物区的分离,在中国明对虾(Fenner-openaeus chinensis)中建立了选择性扩增多态微卫星位点(SAMPL,selective amplified mic-rosatellite polymorphic loci)技术体系,并初步尝试了基于SAMPL的一种微卫星筛选方法。通过5′端锚定引物引入微卫星序列,对传统SAMPL技术加以改进并以期富集简单重复序列。从测序胶上随机选择5条SAMPL条带(分别命名为S11,S13,S14,S22,S24)克隆测序,大小分别为161,157,147,152,298。其中S11,S13,S14,S22四个片段两端引物分别为AFLP选择性引物和SAMPL引物,S13和S22含微卫星序列重复,S24两端引物均为传统的AFLP引物,在此片断中有一(AG)39重复。     

中国对虾微卫星DNA的筛选

于2000年2月以中国科学院海洋研究所水族楼暂养的中国虾对材料，采用常规方法从尾部肌肉中提取DNA，构建小片段部分基因组文章，采用人工设计合成的（CT）7，（AT）7重复征段作引物，利用RCR法对中国对虾小片段部分基因组文库进行筛,一实验首冼 对中国对虾中获得31个微卫星序列，分别分析于18个阳性重组克隆中，其中perfect共23个，占74％，imperfect2个，占7％，compound perfect1个，占3％，compound imperfect5个，占16％，结果还表明，在中国对虾基因组DNA中，（CT）n,(AT)n)形式的微卫星序列的含量非常丰富。     

中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)基因组微卫星特征分析

对中国对虾基因组随机测序，获得了总长度约为641000个碱基的基因组DNA序列，从中找到1362个重复序列。其中，两碱基重复类型的重复数目最多(985个)，占重复序列总数目的72．32％；其次是三碱基(149个)和四碱基(102个)，分别占重复序列总数目的10．94％和7．49％。另外，六碱基重复34个，单碱基重复50个，五碱基重复5个，分别占重复序列总数目的2．50％、3．67％、0．37％。在单碱基重复类型中，重复拷贝类别为A的重复数目最多；两碱基重复类型中，AT重复数目最多，其次是AC和AG；三碱基重复类型中以AAT重复拷贝类别最多．其次是AAG和ATC；四碱基重复类型中，AGAT重复数目最多；五碱基重复类型只发现了AGAGA、GAGGC、TCTYC和TTTCT四种重复拷贝类别；六碱基重复中以ATTATC重复数目最多。其中一些序列已经提交GeneBank注册，注册号为AY545898-AY545913。中国对虾基因组二碱基重复类型中以不完全(Imperfect)形式的微卫星序列为主，其中GC重复拷贝类别的重复数目很少。利用8对微卫星引物对60个个体遗传多样性分析，共获得了60个等位基因，因此认为微卫星技术在中国对虾基因组研究中具有较好的应用前景。     

中国对虾家系幼体对氨氮和pH值的耐受性比较

采用人工授精技术建立中国对虾家系,对建立的20个家系幼体通过急性毒性试验进行抗氨氮和pH值性状的比较.结果表明:不同试验时间中国对虾家系对氨氮和pH值的耐受性差异极显著(P<0.01)和显著(P<0.05),24,48和72 h对氨氮耐受性的平均半数致死值分别为62.15,30.31和15.60 mg/L,对pH值耐受性的平均半数致死值分别为9.99,9.41和9.12.以平均LD50值为评价指标,综合24,48和72 h各家系对氨氮和pH的耐受性,最终筛选出对氨氮耐受性最强的家系8个,对pH值耐受性最强的家系10个,对氨氮和pH值耐受性均较强的家系7个,为构建中国对虾抗逆基础群体,开展中国对虾抗逆新品系的选育工作提供了基础.     

中国对虾家系建立及不同家系生长发育的初步研究

在中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)家系建立过程中,我们采用定向交配对子代进行选育的方法.采用4种中国对虾人工授精方法,即整个精荚移植、精荚切块移植、输精管移植和精液移植,共进行了155例雌虾的人工授精实验,有108尾雌虾成功产卵并孵化出仔虾,成功率为69.7%,建立了101个全同胞家系和29个半同胞家系.在受精卵孵化、育苗的基础上,同时进行了不同家系幼体生长情况的研究,结果表明受精率、孵化率、存活率以及初期生长在4个实验组间都没有显著性差异.另外对其他家系之间的比较也得出同样的结果,说明不同家系在早期的生长中,没有表现出显著性差异.而在养成阶段,方差分析结果表明家系间在生长上表现出差异极其显著.     

中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)人工选育群体不同世代的微卫星分析

采用微卫星DNA技术对中国对虾人工选育快速生长基础群体和4个连续世代共计100个个体进行了遗传分析。对8个基因位点进行了扩增，共得到71个等位基因。每个位点的等位基因数从6到16不等，其大小在159--600bp之间，P，C(Polymorphism Information Content)值为0．6628—0．9051，基因型数为17—67。5个世代群体的平均杂合度分别为0．7188、0．5687、0．6188、0．6438、0．66937。从F-检验的数据来看，配对比较Fst值表明5个世代群体间的遗传分化程度较弱。Fi值的计算结果表明，有5个群体位点杂合度处于过剩状态，但对整个群体而言，5个世代群体均表现为一定程度的杂合子缺失。通过计算每个位点的等位基因数(nα)、有效等位基因数(αe)、基因型数目(G)、最高频率等位基因的频率(F)，以及基于基因型的P值，比较了5个群体的遗传变化。另外，5个世代群体间的相似性系数以及彼此间的遗传距离，体现出人工选育群体间的遗传分化程度较低，说明5个世代群体间的遗传分化程度较低，还有较大的选育潜力，可以继续保持遗传响应。     

中国明对虾核糖体ITS1序列分析及其在对虾科系统分析中的应用

对采自不同群体的5个中国明对虾个体的核糖体RNA转录单元内间隔区1(ITS1)序列特点进行分析,并利用GeneBank数据库中已有的对虾科(Penaeidae)ITS1同源序列对对虾科虾类进行系统分析,探讨ITS1序列在对虾科系统及演化中的应用.结果表明,中国明对虾ITS1序列在个体间和个体内都表现出长度多态性,序列长度范围为637～652 bp,这种长度多态性主要是由于微卫星DNA简单重复序列的重复次数不同所造成.在中国明对虾ITS1序列中发现8个微卫星位点,根据目前已知的12种对虾的ITS1序列,发现某些微卫星位点只存于1种对虾中,如(CAGC)_(2-4)只存在于中国明对虾中,(CGGA)_(4-9)只存在于斑节对虾中,(GCGA)_4只存在于短沟对虾中.利用ITS1序列对12种对虾进行的系统分析表明,12种对虾分为4个类群,同种的不同个体,同属的不同种各自聚支,与形态分类比较吻合.对虾科属间遗传距离范围为0.313～0.977,平均值为0.633,远高于用线粒体基因片段得出的属间的遗传距离,支持将原对虾属的6个亚属提升为属的观点.     

中国明对虾Imd免疫信号通路相关基因克隆及表达分析

Imd免疫信号通路在无脊椎动物抗革兰氏阴性菌方面起到十分重要的作用。在已知中国明对虾Imd通路下游核转录因子Relish基因全长的情况下,利用同源克隆方法获得了Imd通路上游基因Imd的cDNA序列,命名为FcImd,该基因全长783bp,5’非编码区45bp,3’非编码区255bp,开放阅读框483bp,编码160个氨基酸,包括一个位于C端的死亡结构域。同源性分析表明,FcImd基因氨基酸序列与其他甲壳动物的氨基酸序列高度保守,与凡纳滨对虾和日本囊对虾的同源性分别为99%和88%。于鳗弧菌感染后的1,3,6,12,24,48,96,144h记录实验组和对照组的累积死亡率,并分别取血淋巴用于检测中国明对虾Imd及Relish基因在不同时间点的表达量变化情况。结果显示:鳗弧菌感染后,实验组Imd和Relish表达量均显著高于对照组(P0.05),其中Imd表达量呈先升高后降低趋势,Relish表达量在1h时达到最高,然后呈逐渐降低趋势。中国明对虾感染鳗弧菌后Imd和Relish基因呈不同步上调表达,说明Imd和Relish基因的表达与弧菌刺激密切相关,提示Imd和Relish基因参与了对虾抗菌反应的Imd信号转导通路。     

中国明对虾摄食后的特殊动力作用

采用耗氧量推算和能量收支推算方法,计算了中国明对虾的呼吸能量消耗,并计算了中国明对虾摄食配合饵料后的表观特殊动力作用（SDA）.体重范围为1.814～18.552g的中国明对虾摄食配合饵料后,24h内摄食1g 干饵料、1g蛋白质、1kJ能量所产生的SDA分别为7.492kJ、16.454kJ和0.383kJ,而体重范围为2.998～19.012g的中国明对虾在28d内利用能量收支方程计算的相应结果为8.570～11.153kJ、20.131～26.197kJ和0.446～0.580kJ.平均体重为1.53g的中国明对虾摄食鱼肉（FF）、虾肉（SF）、蛤肉（CF）、沙蚕（PW）、配合饲料（FD）和混合饲料（MD）后所产生的表观SDA占摄食能的比例分别为0.660,0.679,0.656,0.523,0.592,0.641,对不同饵料的SDA比例与转化效率的相关分析表明：饵料的转化效率与SDA比例负相关,即SDA比例越高的饵料分配到生长的能量比例越少.另外还对能量收支方法在SDA研究中的应用进行了探讨.     

Pedigree tracing of Fenneropenaeus chinensis by microsatellite DNA markers genotyping

1 IntroductionThe microsatellite DNA markers, which werealso called simple sequence repeats (SSR), are oneof the DNA markers developed in the late 1980s.The microsatellite DNA markers have several advan-tages over other molecular markers. For example,(1) …     

中国对虾6种组织cDNA文库的构建

以中国对虾血液、眼柄、卵巢、雌虾头胸部、雄虾头胸部和三倍体对虾头胸部组织为材料,采用异硫氰酸胍-酸酚法提取总RNA;用磁珠法纯化mRNA;用Uni ZAP cDNA合成试剂盒合成双链cDNA并进行修饰,将cDNA定向连接在UniZAP载体上;经Gigapack Gold Package包装试剂盒包装成为噬菌体颗粒,转染宿主XL1 Blue MRF’菌株细胞,形成初级文库.初级文库经转染进一步扩增,形成稳定的cDNA文库.6个文库的库容在0.2×106~1.3×106之间,重组率都超过90%.从各文库随机取出6~10个清晰的噬菌斑进行PCR扩增,用琼脂糖凝胶电泳检测,其插入片段长度为500~2500bp.由初步功能基因克隆获得阳性结果.多项指标表明,所构建的对虾cDNA文库质量较高,为进一步筛选目的基因、EST测序和制作基因芯片提供了有效的工具.     

Establishment of microsatellite-based triplex PCR for parentage analysis of Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis

Through exploring the microsatellite primers from the random genome sequences of Chinese shrimp (Fenneropenaeus chinensis), some microsatellite primers were obtained with rich polymorphic genetic information, and a triplex PCR was established using three primers (RS1101, RS0683 and H081 primers). By adjusting the final concentration of Mg2 , dNTP and primers, and using a touch-town PCR program, the optimum amplification parameters of PCR system were obtained, which could successfully amplify the three primers in a PCR reaction. In the denatured PAGE gel, the amplified DNA fragments of three primers RS1101, RS0683 and H081 could be easily identified each other. For the triplex PCR system, the PPE (probabilities of paternity exclusion) is 0.967 9, and the DP (discrimination power) is 0.999 327. Using the triplex PCR to test ten individuals of a parentage and their parents, an individual was excluded from the parentage in all of the three microsatellite loci, which might be mixed into the parentage for some unknown reason such as factitious misplay. The triplex PCR will be of great practical value in identifying the parentages of F. chinensis.     

氟苯尼考3种不同给药方式在中国明对虾体内的药代动力学研究

用高效液相色谱法研究静注、肌注和口服氟苯尼考在中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis)体内的药代动力学特征,所得数据用MCP-KP程序分析。结果表明,3种给药方式的血药经时过程均符合二室开放模型,符合一级吸收二项指数方程,血窦注射、肌肉注射、口服药饵的时间对药物质量浓度的理论方程分别是:C血注=16.38e-2.58t 0.32e-0.1t,C肌注=18.7e-2.57t 0.26e-0.12t,C药饵=15.08e–1.49t 0.65e-0.09t–15.74e–10.38t。主要药物代谢动力学参数分别是:吸收半衰期(t(1/2)α)为0.269,0.270和0.465h,消除半衰期(t(1/2)β)为6.921,6.494和7.903h,表观分布容积(Vβ)为1.287,1.293和2.421L/kg,总体清除率(Cs)为0.129,0.138和0.213L/(h·kg),药时曲线下总面积(Au,c)为0.755,0.681和0.666L/(h·kg)。肌肉注射和口服给药的生物利用度(F)分别是90.20%和97.58%。     

中国明对虾2个群体的杂交子一代早期分析

目前,对虾研究主要集中在基础遗传学和遗传改良的潜力研究等方面[1,2].不同的地理群体代表不同的遗传资源,尤其是对虾人工养殖迅速发展的情况下,对不同的群体生长发育性状特点进行评估是非常重要的.遗传改良的目标是提高对虾人工养殖群体的产量,这就需要育种计划不仅要建立在对虾自然群体相关性状差异的研究上,还需要进一步了解不同发育阶段主要经济性状的遗传特性.对虾幼体生长情况和存活率一直都是养殖者和科学工作者关注的问题.已经有研究证明美国大西洋牡蛎和港湾扇贝群体间在幼体生长发育和存活率方面存在遗传差异[3,4].杂种优势在生物界是一个普遍的现象.     

中国对虾交尾雌虾蜕皮及人工再交尾研究

为更好地利用交尾雌虾,采用温差刺激、药物刺激对养殖交尾雌虾和海捕交尾雌虾进行蜕皮实验,使交尾雌虾的精荚随蜕皮而脱落,然后对蜕皮对虾再次进行精荚移植,来建立特定杂交组合的中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)家系。实验结果表明,养殖交尾雌虾蜕皮实验中,在只有温差刺激的条件下,对虾蜕皮率为30%,且对虾成活率为100%,说明温差刺激在保持对虾较高存活率的情况下,可以促使中国对虾蜕皮;在温差刺激的基础上进行药物刺激,不同茶籽饼质量浓度梯度下对虾的蜕皮率存在显著差异,且随着药物浓度的增加,对虾蜕皮率也随之增加,3个茶籽饼质量浓度(30,60,90 g/m3)下的对虾蜕皮率分别为40%,60%,70%,茶籽饼质量浓度为0的对虾蜕皮率与60,90 g/m3质量浓度下的对虾蜕皮率存在显著差异(P0.05);从对虾的死亡情况看,当药物质量浓度达到90 g/m3时,对虾出现死亡,经x2检验表明,90 g/m3质量浓度与0～60 g/m3质量浓度下的对虾死亡率存在显著差异(P0.05)。在海捕交尾雌虾蜕皮实验中,对虾蜕皮率不高,只有在药物质量浓度为30,90 g/m3条件下才有对虾蜕皮,蜕皮率仅为20%,10%;每个药物浓度下均有对虾死亡,死亡率随着茶籽饼质量浓度升高而升高,不同药物浓度下的对虾死亡率存在显著差异。对蜕皮后雌虾进行精荚移植,共获得18个中国对虾家系,平均受精率和平均孵化率分别为51.2%,88.6%。本研究通过对交尾雌虾进行蜕皮后再交尾,获得了不同杂交组合的中国对虾家系,为进一步的中国对虾家系选育工作打下了基础。     

不同盐度波动幅度对中国明对虾稚虾蜕皮和生长的影响

研究了盐度波动幅度对中国明对虾稚虾(Fenneropenaeus chinensis)蜕皮和生长的影响.实验在水族箱内进行,实验对虾的初始体重为(0.553 2±0.000 1)g,投喂人工配合饲料.实验结果表明:(1)不同盐度波动幅度对中国明对虾稚虾的蜕皮周期有显著的影响(P<0.05),其中S10能明显抑制对虾的蜕皮,S2则能促进对虾的蜕皮,前者较后者蜕皮周期延长4.97 d;(2)不同盐度波动幅度对中国明对虾的特定生长率有显著影响(P<0.05),其中,S4和S7两组对虾的特定生长率最大,分别大于S0组28.11%和22.6%,并且与S0和其他处理组相比差异均达到显著水平(P<0.05);(3)不同盐度波动幅度对中国明对虾的摄食量有显著影响(P<0.05),S4和S7两组分别高于S0组15.96%和11.46%;(4)不同盐度波动幅度对中国明对虾的食物转化效率未产生显著的影响P>0.05,但S4和S7两组对虾的食物转化效率较高.     

Expression profiles of penaeidin from Fenneropenaeus chinensis in response to WSSV and vibrio infection by real-time PCR

Penaeidin from Chinese shrimp (Fenneropenaeus chinensis) has proved to be one of the most important antimicrobial peptides in the bodies of animals. The relative quantitative real-time PCR method is developed to study through time, the mRNA expression profile of penaeidin in the muscle and haemoeyte tissue of Chinese shrimp infected with vibrio (Vibrio anguillarum) and WSSV (white spot syndrome virus). Research results showed that the same pathogens infection experiments produced similar gene expression profile in different tissues while different expression profiles appeared in the same tissues infected by different exterior pathogens. In vibrio infection experiments, a “U” like expression profile resulted. Expression levels of ponaeidin increased and surpassed the non-stimulated level, indicating that penaeidin from Chinese shrimp has noticeable antimierobial activities. In WSSV infection experiments, the expression profile appeared as an inverse ““““U““““ with the expression ofpenaeidin gradually decreasing to below baseline level after 24 h.The expression of antimierobial peptides gene in mRNA level in response to virus infection in shrimp showed that international mechanisms ofvirns to haemoeytes and microbial to haemoeytes are completely different. Decline of ponaeidins expression levels may be due to haemoeytes being destroyed by WSSV or that the virus can inhibit the expression ofponaeidins by yet undiscovered modes. The expression profiles of penaeidin in response to exterior pathogen and the difference of expression profiles between vibrio and WSSV infection provided some clues to further understanding the complex innate immune mechanism in shrimp.