10 个半滑舌鳎家系 MHC IIB 基因多态性初步研究

为检测10个半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)家系MHCⅡB(Cyse-DAB)基因的多态性水平、MHCⅡ类B位点数目以及平衡选择的作用,作者利用多聚酶链式反应(PCR)和直接测序的方法对10个半滑舌鳎家系MHCⅡB基因位点遗传变异和平衡选择进行了研究。用特异性引物和PCR扩增的半滑舌鳎MHCⅡB基因片段大约397 bp,包含一部分第一外显子,全部第一内含子和全部第二外显子。10个半滑舌鳎家系中,每家系选取5个体,每个体5个克隆序列分析发现60个不同序列,代表60个等位基因,其中有28个是新发现的,已提交到Gen Bank。同源分析表明60个等位基因相似性为89.36%。共50个个体中,有6个存在5个不同等位基因,表明在半滑舌鳎至少存在3个座位。有9个家系的MHCⅡB序列多肽结合区(PBR)的非同义替换(dN)显著高于同义替换(dS)。     

人工养殖半滑舌鳎卵巢发育及其产卵类型研究

研究了人工养殖半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)卵巢发育组织学的季节变化及其与性成熟系数(gonadosomatic index,简称GSI)和肝质量指数(hepatosomatic index,简称HSI)的关系。结果表明,半滑舌鳎成熟鱼卵巢发育经历Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期、Ⅵ期,再到重复发育Ⅱ期;人工养殖条件下,3~5月份大部分鱼卵巢处于Ⅱ期,从6月份开始,其卵母细胞内开始沉积卵黄颗粒,9~11月份,卵母细胞内卵黄颗粒充盈整个胞质,基本达到生长成熟,排卵后至翌年2月份,卵巢进入了退化吸收Ⅵ期或重复发育Ⅱ期;繁殖期GSI达到最高峰;产卵后或重复发育Ⅱ期,GSI显著下降,此时HSI显著升高至全年最高峰;半滑舌鳎在1 a中只有1个繁殖期,进行分批产卵。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)幼鱼生长性状和底色的表型和遗传参数估计

半滑舌鳎是重要的经济鱼类,已经被广泛推广养殖,致力于养殖方面的研究开展了很多工作,但是对半滑舌鳎生长性状进行准确遗传评估的研究还未见报道。为了对生长性状进行准确的遗传参数估计,本次研究以80个半滑舌鳎家系为研究对象,对半滑舌鳎早期生长性状（包括个体全长、体宽和体质量）进行分析。另外还将鱼体底面纯白与否（命名为底面颜色）作为一个性状进行研究。结果表明,四个性状都属于中等遗传力（全长为0.210、体宽为0.259、体质量为0.268、底面颜色为0.362）。三个生长性状之间具有很高的遗传相关性（0.913-0.959）,表明如果三个性状进行间接选择的话,将会取得较好效果。底面颜色性状与三个生长性状均为正遗传相关,相关系数在0.241-0.353之间,由此可知,对底面颜色进行选择时,可以加强生长性状的选择效果。通过家系育种值排序,初步筛选出了生长性状优良遗传背景丰富的16个全同胞家系,将作为亲鱼繁殖后代。本研究为半滑舌鳎优良品种的成功培育提供了重要基础资料。     

半滑舌鳎肾脏组织结构与细胞种类研究

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是中国重要的海水养殖鱼类品种,目前对于其肾脏结构与细胞种类的研究较少。本研究以半滑舌鳎肾脏为研究对象,通过切片技术、免疫组织化学与显微镜观察,描述半滑舌鳎肾脏结构与细胞分布情况。结果显示,半滑舌鳎的肾脏可以分为头肾与体肾两部分;头肾较小,具有独立的结构,位于肾脏前部,靠近脑,形态上呈分叉状;头肾由淋巴髓样细胞构成,无肾小球等分泌结构,免疫细胞丰富,包括淋巴细胞、单核细胞、颗粒细胞,是半滑舌鳎免疫细胞的主要生发部位之一,是免疫系统的重要组成;半滑舌鳎的体肾与头肾后部分叉处相连,呈纺锤状,紧贴腹腔背部,向后延伸;体肾主要由肾单位组成,有丰富的肾小囊、近曲小管、远曲小管和集合管结构,表明其具有排泄功能。     

盐度和体质量对半滑舌鳎标准代谢率的影响

采用流水式呼吸仪测定了不同体质量的半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)在盐度为16.43～33.62条件下的标准代谢率.结果表明:各个盐度下的标准代谢率与体质量呈正相关,而单位体质量标准代谢率与体质量呈负相关;标准代谢率与体质量之间的关系可用幂函数Rs=aM<'b>表示.不同盐度下,标准代谢率的组间...     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)Patched 1基因的克隆和表达分析

Hedgehog(Hh)信号通路在脊椎动物和非脊椎动物发育过程中细胞信号传导方面发挥重要的作用。Patched 1 (Ptc1)基因是Hh的受体,通过和Hh配体结合调节Hh信号通路。本研究克隆和鉴定了半滑舌鳎的Ptc1基因(csptc1),该基因cDNA全长为5212 nt,编码蛋白包括1543个氨基酸残基,序列比对和进化分析显示该蛋白在进化过程中较为保守。荧光定量显示该基因在脑,肝脏,心脏,鳃,肠,脾脏、肾脏和性腺组织中普遍表达,在精巢中的表达水平显著高于卵巢。精巢中的原位杂交信号主要位于该基因主要在初级精母细胞,次级精母细胞和支持细胞中,而在卵母细胞中的信号较弱。Csptc1基因在卵巢中的甲基化水平高于在雄鱼和伪雄鱼精巢中。这一研究结果可能说明csptc1基因参与了 Desert Hedgehog (DHH)基因维持雄鱼和伪雄鱼的生殖细胞系以及精子发生等生物学过程。     

Evaluation of reference genes for quantitative real-time PCR analysis of gene expression during early development processes of the tongue sole (Cynoglossus semilaevis)

Differential expression of genes is crucial to growth and development of fish. To select the appropriate genes for gene normalization during Cynoglossus semilaevis early developmental process, eight candidate reference genes (ACTB, B2M, EF1A, GADPH, RPL7, TUBA, UBCE and 18S) were tested for their adequacy by using quantitative real-time PCR. The results showed that the expression of all the examined genes exhibited tissue dependent variations in the mature C. semilaevis. EF1A was listed as the most stable reference among the 14 tissues by RefFinder. Furthermore, the recommended comprehensive ranking of the stability determined by RefFinder showed that 18S was the most stable gene during the early developmental stages (from oosphere to 90 days old) in this study. However, when divided the C_t value data of the above mentioned early developmental stages into two separate periods (embryo and post-hatching periods), TUBA and 18S represented the most stable references of these two developmental periods, respectively. Consequently, the reference gene should be carefully and accurately chosen even for studies of the same species at various developmental processes. The relevant data may help in selecting appropriate reference genes for mRNA expression analysis, and is of great value in the studies of fish growth and development.     

适宜浓度的维生素E促进半滑舌鳎生长激素基因的表达

本实验旨在探究维生素E对半滑舌鳎垂体组织中生长激素基因表达的影响。作者在每千克等氮等能的基础饲料中分别添加0、400和1 600mg的DL-α-生育酚乙酸酯(维生素E)投喂半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)成鱼(464±2.6) g,进行为期8周的养殖实验;另外,在L-15培养基中添加0、18和54μmol/L的维生素E,对半滑舌鳎成鱼(464±2.6) g的垂体细胞进行为期3 d的体外原代培养实验。分别取垂体组织和原代细胞,通过荧光实时定量PCR分析其gh mRNA的相对表达量。实验结果表明:垂体组织中gh mRNA的相对表达量随着饲料中维生素E含量的增加而呈现先升高后下降的变化趋势,在400 mg/kg组时显著高于其他各组(P0.05);随着细胞培养液中维生素E浓度的升高, gh mRNA的相对表达量显著增加(P0.05)。由此可见,适宜浓度的维生素E能够促进半滑舌鳎垂体组织中生长激素基因的表达。     

盐度突变对半滑舌鳎血浆渗透压和鳃丝Na+/K+-ATP酶活性的影响

研究了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)由盐度30突变至0、1O、20、35和40盐度后血浆渗透压和鳃丝Na+/K+-ATP酶活性的变化.结果表明,盐度对半滑舌鳎血液渗透压和鳃丝Na+/K+-ATP酶活性均有显著影响(P＜0.05).盐度突变后,各处理组的血液渗透压和鳃丝Na+/K+-ATP酶活性...     

半滑舌鳎病原鳗利斯顿氏菌表型及分子特征研究

2008年12月,江苏赣榆某渔场养殖半滑舌鳎出现大量死亡,症状主要表现为:头部、鳃盖及鳍基出血,尾鳍腐烂,腹腔膨胀并积有大量腹水,部分病鱼肠管脱出肛外。从病鱼肝脏、腹水中分离出大量优势生长的细菌,人工感染试验证明其对半滑舌鳎有较强的致病性。对3株分离菌进行了形态特征、理化特性、胞外酶及溶血素活性等表型生物学性状检验;测定了代表菌株的16S rRNA和gyrB基因序列,分析了16S rRNA和gyrB两种基因序列的同源性,并构建了系统发生树,比较了两种基因对分离菌的鉴定能力;结果表明gyrB基因用于细菌种间鉴定更具优越性;基于16S rRNA和gyrB基因的系统发育学分析表明分离菌与鳗利斯顿氏菌具有高同源性,根据分离菌的表型及分子特征,判定分离菌为利斯顿氏菌属(Listonella MacDonell and Colwell 1986)的鳗利斯顿氏菌[Listonella anguillarum (Bergeman 1909) MacDonell and Colwell 1986]。胞外酶活性及溶血活性检测表明3株分离菌均具有淀粉酶、蛋白酶、卵磷脂酶等胞外酶活性,在含7%家兔脱纤血液营养琼脂培养基上呈β型溶血,PCR检测3株供试菌均可扩增出大小约493 bp的溶血素基因和大小约248bp的金属蛋白酶基因。分离菌的耐药谱测定结果显示,对供试49种抗菌药物中的青霉素G等13种药物耐药,对羧苄青霉素等6种药物存在敏感与耐药的株间差异。     

泥蚶人工选育群体的微卫星分析

采用微卫星分子标记技术对人工选育的泥蚶(Tegillarca granosa)群体进行遗传多样性分析。结果表明:在12个标记位点中,每个位点的等位基因数为2~9个,观测杂合度平均范围0.4195~0.4725,期望杂合度平均范围为0.5700~0.6323。哈迪-温伯格平衡检验结果显示,在48个群体-位点组合中有32个群体-位点组合显著偏离平衡。Shannon遗传多样性指数为1.0608~1.2242。群体间的遗传分化系数Fst值从0.0347~0.4549,平均值0.1930;基因流Nm值为0.2996~6.9617,平均值2.3367;群体近交系数Fis范围0.0052~0.7135,平均值0.2468。结果表明,连续的人工选育过程,群体的遗传多样性仍然比较高,但选育过程对群体的遗传多样性和遗传分化有一定程度的影响。     

半滑舌鳎3个形态性状与体质量的相关及通径分析

为了深入认识半滑舌鳎形态性状与体质量之间的关系,本研究使用831尾12月龄左右半滑舌鳎个体的体质量[BM(g)]和形态性状,包括全长[TL(cm)]、体高[BH(cm)]、体厚[BW(cm)],通过模型拟合筛选获得能够反映雌、雄性个体各个形态性状与体质量关系的最佳模型。建立了以形态性状为自变量、体质量作为因变量的回归方程,并计算了直接、间接通径系数和决定系数。模型拟合结果显示,雌、雄个体全长、体高和体厚与体质量的最优拟合模型都为幂函数曲线模型,雌性个体3个形态性状与体质量的最优模型分别为:y⌒=0.004x3.090、y⌒=0.382x2.983、y⌒=61.912x2.461;雄性个体的3个最优模型公式依次为:y⌒=0.005x3.003、y⌒=0.300x3.147、y⌒=57.681x2.156。通径分析结果显示,雌性个体中体高对体质量的直接影响最大,通径系数为0.535,而雄性个体全长对体质量的直接作用最大,通径系数为0.407。雌、雄个体的3个形态性状对体质量都有极显著的直接作用,其最优多元回归方程:雌性为BM=-88.530+1.297 TL+15.862 BH+39.021 BW;雄性为BM=-71.579+2.587TL+7.351 BH+35.595 BW。     

基于Illumina HiseqTM 2000高通量转录组测序的里氏拟石磺SSR 标记开发

为给石磺科贝类系统进化研究和资源保育工作提供更有效的分子标记,使用Illumina Hiseq TM2000高通量测序技术对里氏拟石磺进行转录组测序,以所得的拼接序列为基础,利用MISA和SSR Hunter1.3软件进行微卫星序列的查找,对选出的51个微卫星位点进行引物设计,经PCR扩增得到单一清晰扩增条带的位点24个,研究湛江里氏拟石磺群体扩增。结果表明,其中14个位点表现多态性。14个多态性位点得到的等位基因数为2~4,其中观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)分别为0.031 3~0.714 3和0.031 3~0.708 4,多态性信息含量(PIC)为0.089 5~0.640 5,14个位点中的2个位点表现为高度多态性(PIC0.5),10个位点表现为中度多态性(0.5PIC0.25),另外2个位点表现为低度多态性(PIC0.25)。经Sequential Bonferroni校正的Hardy-Weinberg平衡检验,9个位点不偏离平衡(P0.05)。开发的SSR标记可用于里氏拟石磺群体遗传学和石磺科贝类间的系统发生研究,并为里氏拟石磺的群体种质保护提供数据支持。     

大珠母贝微卫星DNA标记的分离与筛选

采用生物素标记的(CA)15探针和磁珠富集法构建了大珠母贝(Pinctada maxima)微卫星DNA文库,随机挑选1200个菌落,经PCR筛选得到298个候选克隆,成功测序246个,分析获得251个微卫星序列,其中完美型、非完美型和混合型分别占63%、32%和5%。除探针中使用的CA重复外,还得到AT、GT、TC、AG、GC、TAA、CAA、AGG、GATA、GACA、GTGC、CGTC、GACG、CTGT等重复序列。设计引物90对,挑选其中30对合成并筛选出21对能在大珠母贝基因组有效扩增的引物。种群PCR扩增后利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行检测,获得了10个多态位点,共检测出59个等位基因,片段长度范围为133~444 bp。各位点等位基因数2~8个,平均等位基因数5.9个;有效等位基因数为1.342 3~6.000 0,平均为4.124 0;多态性信息含量(CPI)为0.222 5~0.811 8,平均0.7179;期望杂合度(He)为0.259 3~0.847 5,平均0.717 9;观测杂合度(Ho)为0.300 0~0.800 0,平均0.533 3。这些微卫星多态性标记的获得,为进一步开展大珠母贝遗传育种、保护生物学和种群遗传多样性等研究奠定了一定基础。     

绿鳍马面鲀微卫星标记开发及在丝背细鳞鲀中的通用性检测

为充分挖掘绿鳍马面鲀(Thamnaconus modestus)基因组资源,开发可用于群体遗传学研究的分子标记,本研究利用NCBI数据库中公布的绿鳍马面鲀全基因组序列筛查微卫星位点并在野生群体中验证,在85个选取的位点中筛选得到30个新的多态性较高的微卫星标记。每个微卫星标记的等位基因数为4~16,平均为8.5个;观测杂合度范围为0.207~0.916,平均值为0.685;期望杂合度范围为0.315~0.971,平均值为0.756;多态信息含量范围为0.301~0.898,平均值为0.716,其中属于高度多态的位点有26个,占总位点数的86.67%;经过Bonferroni校正后,有7个位点显著偏离Hardy-Weinberg平衡。将30个绿鳍马面鲀多态性微卫星标记在丝背细鳞鲀(Stephanolepis cirrhifer)中进行通用性检测,其中13个位点成功扩增,9个位点具有多态性。本研究开发的微卫星标记可用于绿鳍马面鲀及相关物种的遗传多样性分析、QTL定位以及系统进化等研究。     

暗纹东方鲀生长性状相关微卫星标记筛选

为了筛选与暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)生长相关的分子标记,作者采用SSR结合BSA技术对同龄孵化群体的同池养殖暗纹东方鲀生长差异性状标记进行筛选。利用85对微卫星引物对暗纹东方鲀生长快、慢各30尾个体构建的两个基因池进行分析,共筛选到14个差异位点。然后分析这14个差异微卫星位点在这60个暗纹东方鲀个体中的基因型差异,结果表明:位点TOP03、TOG01、fms15、fms75与生长性状呈现极显著负相关关系(P0.01),fms89与生长性状呈现极显著正相关关系(P0.01)。用另外30个个体(生长快慢各15个)进行验证实验后,结果只有位点fms15、fms75与生长性状显著相关,相关系数分别为–0.411和–0.384。这两个微卫星位点对于暗纹东方鲀生长性状有显著效应,为开展暗纹东方鲀的分子标记辅助育种提供了有价值的参考标记。     

漠斑牙鲆养殖群体微卫星遗传多样性的初步分析

为评估养殖过程对漠斑牙鲆遗传结构的影响, 本研究利用微卫星标记对漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)山东胶南养殖群体(子一代)和江苏南通养殖群体(子三代)的遗传结构进行分析比较, 结果表明所使用的14 对引物中, 11 对引物在所选取的群体中具有多态性, 两个群体中共检测出了70 个等位基因(42 个有效等位基因), 总群体的平均观察杂合度(Ho)和期望杂合度(He)分别为0.36 和0.60。两个群体的Shannon’s 遗传多样性指数分别为1.18 和1.07, Nei’s 遗传多样性指数分别为0. 56 和0.51, 表明山东胶南群体的遗传多样性显著高于江苏南通养殖群体。两个养殖群体间的两群体间的遗传分化系数Fst 平均为0.1246, 遗传距离(Ds)为0.171, 遗传相似度为0.8432, 表明两个群体中度分化。由此可以得出, 在中国随着漠斑牙鲆累代养殖的开展, 其遗传多样性下降显著, 遗传结构已经出现了显著分化。因此, 在将来的繁育过程中应制定合理的育苗规划以维持漠斑牙鲆的多样性水平并保障产业可持续发展。     

黄口荔枝螺转录组数据的微卫星标记开发与分析

以黄口荔枝螺转录组测序所得到的拼接序列为基础,利用MISA软件进行微卫星分析,利用Primer5.0设计引物160对。结果显示,83对引物能够成功扩增,引物在黄口荔枝螺渔山列岛群体多态性检测中发现,37个SSR位点能够表现出多态性,一共获得了129个等位基因,各位点等位基因数为2~5个,平均每个位点等位基因数为3.49个,观测杂合度H_o,期望杂合度H_e,多态信息含量PIC范围分别介于0.000~0.800、0.146~0.645、0.139~0.573之间,有9个表现为高度多态,20个表现为中度多态,8个表现为低度多态。实验结果进行Hardy-Weinberg平衡检测后,利用Bonferroni correction法进行校正,有29个位点显著偏离,结果表明渔山列岛黄口荔枝螺群体总体遗传多样性水平较低。