实时荧光定量PCR分析中不同铁浓度处理下玛氏骨条藻内参基因的筛选

实时荧光定量PCR(qRT-PCR)是定量分析基因表达的常用方法,选择合适的内参基因对准确分析目的基因表达水平至关重要。本研究以不同铁浓度培养条件下的玛氏骨条藻为材料,定量分析Cytb、EF-1α、HPRT、UBC、GAPDH、β-actin以及β-tubulin 7个内参基因的表达情况,并利用GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件对这些内参基因的稳定性进行综合评价。结果表明,Cytb和EF-1α的表达稳定性较好,EF-1α+Cytb组合的稳定性最佳,是玛氏骨条藻基因表达研究的理想内参基因,而其他基因的表达稳定性较差,不适合作为内参基因。本研究为玛氏骨条藻基因表达研究过程中内参基因的选择提供了方法学上的依据。     

基于玛氏骨条藻转录组的脂肪酸合成途径分析

本研究利用Illumina Hiseq2000对不同生长时期的玛氏骨条藻(Skeletonema marinoi)进行转录组测序,得到的转录本通过NR、NT、Swiss-Prot和KOG数据库进行功能分类,通过GO和KEGG数据库进行相关代谢途径分析和基因差异表达分析,在此基础上构建了S.marinoi的脂肪酸生物合成途径,发现共存在26种酶和蛋白对应的33个编码基因,对这33个基因序列进行比对发现其与假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)的同源性较高。在该代谢通路中,S.marinoi在不同生长时期出现显著差异表达的基因有15个。与指数期相比,柠檬酸裂解酶和长链酰基-CoA合成酶(Comp14198_c0)的编码基因在稳定期和衰亡期出现显著下调表达,而柠檬酸合酶的编码基因仅在稳定期出现显著下调表达。与之相反的是,以乙酰-CoA羧化酶编码基因为代表的12个编码基因在稳定期和衰亡期均出现了显著上调。通过分析,初步推测S.marinoi在稳定期的脂肪酸合成能力高于指数期。这些信息为海洋微藻脂肪酸生物合成途径的研究提供了理论基础,有助于对S.marinoi进行基因改造,提高脂肪酸的合成量。同时,又能为赤潮的防治提供新的思路。     

多形微眼藻在不同氮源条件下固碳途径的转录组解析及与其他微藻的比对

本研究通过转录组技术对不同氮源培养下的多形微眼藻(Minutocellus polymorphus)固碳途径进行分析。通过对转录本进行NR、NT、Swiss-Prot和KOG富集分类及GO、KEGG相关代谢途径和基因差异表达分析,构建了多形微眼藻固碳途径。研究发现该藻除具有C₃固碳途径外,还具有较完整的C₄固碳通路。在注释到的164个固碳相关编码基因中,有33个出现明显表达差异。根据基因的差异表达情况可以发现,在有机氮源中多形微眼藻C₃固碳途径的核酮糖-1,5-二磷酸再生阶段和C₄固碳途径的磷酸烯醇式丙酮酸再生阶段相关编码基因均有上调表达, C₄固碳羧化阶段相关编码基因均有下调表达。研究对比了多形微眼藻与假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)、三角褐脂藻(Phaeodactylum tricornutum)和抑食金球藻(Aureococcus anophagefferens)固碳途径的异同点,发现多形微眼藻与抑食金球藻有相似的C₄...     

南极冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L过氧化氢酶的热胁迫响应

为了研究南极冰藻的热胁迫应答机制,本文根据转录组测序得到的冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L过氧化氢酶CiCAT基因分析了其编码蛋白的特征,同时研究了CiCAT基因表达和过氧化氢酶活性在培养温度升高时的响应变化情况。结果表明:CiCAT基因序列全长为2 066 bp,编码492个氨基酸。在过氧化氢酶的系统进化树中,南极冰藻与其他绿藻聚类为一个分支。CiCAT编码的蛋白序列与盐藻和红球藻的过氧化氢酶序列相似性较高,分别为80.5%和78.9%。当南极冰藻处于热胁迫条件下,CiCAT基因的相对表达量和过氧化氢酶活均呈现出先上升后下降的趋势,但在胁迫24 h时CiCAT基因的表达量变化不明显,而实验组的酶活显著高于对照组。在胁迫72 h时,基因表达量和酶活均达到最高值。研究初步表明,与在常温藻类和高等植物中的功能相似,在经受热胁迫的情况下,南极冰藻中的抗氧化酶系统也发挥着重要作用。     

海带钒依赖溴过氧化物酶基因甄别和表达分析

钒依赖溴过氧化物酶(Vanadium-dependent bromoperoxidase,vBPO)在富集碘的褐藻中广泛存在,催化碘化物生成,消除过量过氧化氢,保护藻体。因此,vBPO基因是褐藻天然免疫和防御应答的指示基因之一。中国广泛栽培海带(Saccharina japonica),但现行的"浮绳网藻体倒置避夏栽培"模式可能使海带孢子体持续性地处于强紫外线、强光照、高温度及频繁的光照和温度波动等环境因素的胁迫状态。这可能是导致海带病害越来越频繁的生理学原因。本研究用转录组测序方法分析了海带孢子体4个生长发育时期(薄嫩期、厚成期、成熟期和衰老期)vBPO基因的表达模式,获得了59条至少在一个生长发育时期表达的vBPO基因转录本组装物,其中的4条含有完整vBPO基因开放阅读框。用这4条序列含有的开放阅读框逆翻译成氨基酸序列并与从NCBI数据库下载的16个物种的28条vBPO氨基酸序列构建分子系统学树,发现它们的氨基酸序列与掌状海带(Laminaria digitata)的vBPO亲缘关系最近,并与所有褐藻vBPO聚为一枝。这说明这些转录本就是海带vBPO基因表达产物。研究还发现,59条海带vBPO基因转录本在4个发育时期的平均丰度是相应时期全部基因转录本的平均丰度的9～19倍,平均13倍,这说明海带天然免疫和防御应答机制之一的碘富集机制持续性处于高活性状态。研究还发现海带vBPO基因表达模式与碘含量变化呈正相关(r=0.974)。     

栅藻全转录组测序与类胡萝卜素合成途径相关基因分析

栅藻(Desmodesmus sp.)是一种能产生重要次生代谢产物类胡萝卜素的海洋绿藻,为了深入了解栅藻类胡萝卜素代谢途径及关键酶基因,本研究通过Illumina高通量测序平台对栅藻进行转录组测序.利用Trinity软件对转录组数据进行从头组装,共获得37 634个Unigenes,经过与Nt、Nr、Swiss、Prot、KEGG、COG、GO数据库比对,共有23 235个Unigenes获得注释.GO分类中(level 2)注释最多的分别是代谢过程(metabolic process),细胞组分(cell part)和催化活性(catalytic activity),与KEGG数据库比对发现14 123个Unigenes与128条代谢途径相对应.根据组装和注释的转录组结果,鉴定了栅藻中与类胡萝卜素生物合成途径相关的基因,构建了栅藻类胡萝卜素代谢途径,获得的栅藻转录组数据有利于进一步研究类胡萝卜素代谢途径中相关基因的功能及调控.     

海洋微拟球藻对共培养三角褐指藻的分子生理学响应机制

本研究运用多物种混合转录组测序(msRNA-seq)法分析了对数生长期海洋微拟球藻响应相同细胞数指数末期三角褐指藻共培养的生理机制。两种藻的细胞总数在8 d内基本不变。三角褐指藻转录组结果中存在与生长有关的基因的表达,且难以与响应共培养的生理过程区分。因此,我们只分析微拟球藻响应共培养的转录组变化及其揭示的生理学机制。分析发现在共培养的初始24 h内共有8 235个基因表达,其中,809个为显著差异表达基因,351个下调表达,458个上调表达。这些差异基因被富集到7条KEGG通路中。其中,在DNA复制和同源重组通路上所富集的基因呈下调表达,而在氨基和核苷酸糖代谢通路、Focal adhesion、PI3K-Akt、cAMP、ErbB信号通路上所富集的基因呈上调表达。结果表明海洋微拟球藻响应三角褐指藻共培养时发生了一系列生理学变化。这是应用多物种混合转录组测序分析微藻间互作的初步尝试,建立的方法也适用微藻和其它微生物的互作机制研究。     

海萝抗氧化酶系与失水响应因子表达模式分析

潮间带红藻海萝(Gloiopeltis furcata)对失水胁迫具有很强的耐受能力。为探索海萝周期性失水过程中的响应机制,本研究在24 h内设计了两次连续的失水-复水循环处理,测定了海萝抗氧化酶活力的变化情况。同时,利用转录组测序技术,结合荧光定量PCR方法(qRT-RCR),对海萝失水响应基因的转录表达进行了验证。结果表明:海萝转录组共组装到32681条基因。与对照组相比,处理组共表达了7161条差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)。KEGG分析显示, DEGs分布在代谢、环境信息加工、有机体系统、遗传信息加工、细胞进程等方面。海萝抗氧化酶活力测定发现,抗氧化能力对海萝响应失水胁迫十分重要。过氧化氢酶(CAT)、硫氧还蛋白还原酶(TrxR)、超氧化物歧化酶(SOD)参与抗氧化过程,其中CAT酶活力对海萝抵抗失水胁迫尤为重要。此外,qRT-PCR结果显示,海萝中渗透调节物质红藻糖苷合成的相关基因(GfUGPase、GfGK、GfGPDH)只对初次失水处理有正响应。而热激蛋白70基因(GfHSP70)、碳酸酐酶基因(GfCA)、MYB蛋白编码基因(GfMYB)以及谷胱甘肽S转移酶基因(GfGST)在两次失水过程中其转录水平均有上调表达,它们也参与了海萝失水响应机制。     

基于转录组测序对两种氮素营养条件下多形微眼藻氮代谢途径的解析

探究微藻的氮代谢通路对了解其对不同氮源利用的分子机制具有重要意义。本研究利用Illumina高通量测序技术对两种氮素营养条件下(硝酸氮和尿素)多形微眼藻的转录组进行分析,通过基因功能注释及数字基因表达谱分析,研究了多形微眼藻细胞内氮代谢的调控机制。结果检测出15种参与氮代谢的酶,对应76个编码基因,构建了多形微眼藻的氮代谢通路图。其中10个酶编码基因在两种不同氮素营养条件下存在差异表达,最显著的是谷氨酸合成酶、谷氨酸脱氢酶和谷氨酰胺合成酶相关基因。有机氮源(尿素)实验组中,多形微眼藻细胞内的硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶等基因的差异表达明显高于无机氮源(硝酸钠)实验组,表明当环境中的氮源为尿素时,会对多形微眼藻细胞内硝酸盐的转化和利用有一定影响。本研究初步阐述了硝酸盐、尿素的吸收转运对多形微眼藻细胞内氮代谢的影响机制,可为硅藻在不同氮素营养条件下的吸收利用机制及氮代谢响应研究提供依据。     

光学活性藻蓝蛋白β亚基的体内重组

在Synechococcus sp.PCC 7002中,首先发现了特异性催化脱辅基藻蓝蛋白β亚基(153位)与藻蓝胆素(phycocyanobiling, PCB)连接的裂合酶基因cpcT.本实验在Synechocystis sp.PCC 6803中找到与cpcT具有高度同源性的基因slr1649.构建2组相容的重组质粒pCDF-cpcB(C82I)或(C153I)-ho1-pcyA和pRSF-slr1649,cpcB(C82I)和cpcB(C153I)分别编码82和153位被突变的脱辅基藻蓝蛋白β亚基,slr1649编码可能的特异性裂合酶,在大肠杆菌体内生成PCB必需的2个基因(ho1编码血红素氧化酶,pcyA编码藻蓝胆素合成酶),将这些基因共同转化到大肠杆菌诱导表达,利用亲和层析柱对可溶性蛋白进行纯化,产物进行SDS-PAGE、色素蛋白锌电泳和光谱检测.结果表明基因slr1649能够特异性催化CpcB(153位)与PCB的连接,产生了具有光学活性的CpcB(C82I)-PCB,为进一步研究螺旋藻藻蓝蛋白的生物活性奠定了基础.     

黄海两种典型硅藻的磷胁迫生理研究

在实验室批次培养条件下,研究黄海两种浮游植物优势种玛氏骨条藻(Skeletonema marinoi)和旋链角毛藻(Chaetoceros curvisetus)在低磷条件下的生长特性、环境中不同形态磷浓度的变化以及磷饥饿状态下浮游植物的营养吸收动力学和碱性磷酸酶动力学。结果表明,玛氏骨条藻在磷胁迫情况下可利用自身较高的吸收速率和较小的细胞体积有效摄取环境中的无机磷快速生长并取得优势,而旋链角毛藻在无机磷的利用上并无优势,其比玛氏骨条藻需要更多的细胞颗粒磷去维持细胞活性,而且更容易诱导碱性磷酸酶分解利用有机磷,推测在有机磷丰富的环境下旋链角毛藻会在二者竞争中取得优势。这些生理特性有可能是二者在黄海季节性水华发生过程中大量存在的原因。     

藻胆蛋白的研究概况Ⅲ.蓝藻藻胆蛋白合成的分子机制及调控

近２０年来 ,尤其是蓝藻中的集胞藻ＰＣＣ６８０３的基因组全序列测定的完成 ,使得藻胆蛋白分子生物学的研究日渐深入 ,研究人员已经先后从一些蓝藻 (包括蓝藻细胞内的蓝色小体 )和红藻细胞中克隆了一些与合成藻胆蛋白相关的基因 ,并对这些基因的数量、位置以及表达调控进行了深入的研究。这些研究加深了我们对藻胆蛋白结构及其基因进化的认识 ,同时也有利于我们理解藻胆蛋白合成的不同水平的调控方式。本文就近年来蓝藻藻胆蛋白分子生物学的研究作一综述。１藻胆蛋白脱辅基蛋白基因的表达与调控１．１藻胆蛋白脱辅基蛋白基因的转录单元的结…     

雌、雄弓背青鳉(Oryzias curvinotus)肝脏转录组比较分析

为发掘弓背青鳉(Oryzias curvinotus)肝脏功能基因、开发环境检测标记基因,本研究采用RNA-Seq技术分别测定了性成熟雌、雄弓背青鳉肝脏转录组,并获得80095044和87043984条clean reads,合并拼接出49912个unigenes(N50=2394bp)。基因表达差异分析显示在雌、雄弓背青鳉肝脏组织中存在571个差异基因(DEGs),其中364个在雄鱼中高表达,207个在雌鱼中高表达。GO和KEGG分析表明差异基因主要参与激素合成、免疫反应、氧化还原反应及卵黄发生等生物学过程。进一步,在转录组中筛选到了多个环境雌激素相关标记基因(vtgs,chgs,er,cyp450等),且这些基因在雌鱼肝脏中的表达水平显著高于雄鱼。研究结果丰富了弓背青鳉的基因资源,为研究基因功能提供了数据,也有助于进一步研究鱼类肝脏在不同性别之间的功能。     

广西北部湾5株骨条藻的分子鉴定

骨条藻(Skeletonema)隶属于硅藻门(Bacillariophyta),是一种分布广泛的广温广盐性藻类,也是我国沿海常见的赤潮生物之一.为确定北部湾涠洲岛5株骨条藻的分类地位,采用PCR克隆了这5株骨条藻核糖体的大亚基基因(LSU)和内转录间隔区(ITS)序列.通过与GenBank数据库中骨条藻属的LSU、IT...     

鬼手海葵(Aiptasia pulchella)白化恢复后的基因表达差异

海葵白化是由于海葵失去体内共生的虫黄藻和(或)共生的虫黄藻失去体内色素而导致海葵变白的生态现象。为探究鬼手海葵(Aiptasia pulchella)白化和白化恢复后相关的分子机制, 本研究对海葵进行慢性热胁迫处理, 以白化海葵和白化恢复后的海葵为研究对象, 采用2代IIlumina Hi-seq测序技术进行转录组测序, 探究两者在基因表达水平方面的差异变化, 分别获得50109686和43163786条Clean reads, 注释后获得24565和24157个Unigene。比较转录组分析结果显示, 白化海葵与白化恢复后的海葵之间存在214个差异表达基因, 其中白化海葵的高表达基因有101个, 白化恢复后海葵的高表达基因有113个, 这些差异表达基因主要与DNA复制、新陈代谢、离子转运和胶原蛋白有关。对不同处理所涉及的全部28050个表达基因进行基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA), 结果发现, 白化海葵在胶原蛋白和离子转运方面显著富集表达, 白化恢复后的海葵在核酸修复方面显著富集表达, 推测这些生物学过程在海葵白化和白化后修复过程中发挥重要作用。本研究获得的转录组数据和研究结果初步揭示了海葵共生体系在共生失衡后进行适应性调节的分子机制, 为海葵及珊瑚共生体系应对环境变化的适应性机制研究提供了理论依据。     

外源CaCl2调控浒苔(Ulva prolifera)高温逆境的比较转录组研究

钙(Ca~(2+))作为一种必需的信号分子,在植物的生长发育和非生物胁迫调节中起着至关重要的作用。本实验采用BGISEQ平台进行高通量测序,获得浒苔外源CaCl_2添加(UpCa)和高温对照(UpHT)处理下相关的转录组数据,分析了在高温(35℃)下外源CaCl_2的添加转录组的变化。结果显示,根据UpHT和UpCa处理分析共获得36625条基因;与UpHT相比,在UpCa下鉴定出7513个差异表达的基因,包括6002个上调基因, 1151个下调基因,对差异基因进行了GO富集和KEGG富集分析。对膜转运、植物信号转导和环境适应性相关的差异基因进行KEGG富集分析,主要富集在内吞(Endocytosis)、植物病原菌互作(Plant-pathogeninteraction)、丝裂原激活的蛋白激酶信号通路(MAPK signaling pathway-plant)、植物激素的信号传递(Plant hormone signal transduction)、ABC转运(ABCtransporters)和磷脂酰肌醇信号系统(Phosphatidylinositolsignalingsystem)等代谢通路上。植物激素信号转导途径中,细胞分裂素、脱落酸、油菜素内酯和乙烯信号转导途径增强。抗氧化酶中FeSOD、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽S转移酶和抗坏血酸过氧化物酶等基因表达上调,下调的基因主要是热激蛋白。Ca~(2+)信号组分基因钙结合蛋白、钙调素、钙/钙调素依赖的蛋白激酶以及钙/钙调蛋白依赖性3′,5′环核苷酸磷酸二酯酶的基因表达上调,丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶和磷脂酰肌醇信号相关的基因也差异性上调。本研究系统阐述了植物信号转导、抗氧化酶、MAPK信号系统以及Ca~(2+)信号组分基因在外源CaCl_2对浒苔高温压力的调节中的重要作用,可为进一步阐明Ca~(2+)信号对高温的调节适应机制提供理论基础。     

条斑紫菜丝裂原活化蛋白激酶PyMAPK3基因的克隆及胁迫条件下的功能分析

本研究从条斑紫菜中克隆了一个丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase)基因,命名为PyMAPK3。该基因全长2155bp,开放阅读框(ORF)1401bp,编码466个氨基酸,含有两个内含子。氨基酸序列分析表明,PyMAPK3磷酸化位点的氨基酸基序为TDY,其等电点为7.17,蛋白分子量为51.6KDa,亚细胞定位于叶绿体。荧光定量PCR技术对该基因在不同非生物胁迫条件下的转录差异分析结果显示,极端胁迫条件下基因表达量显著增加。蛋白免疫印迹技术对蛋白在不同胁迫条件下的表达量分析结果显示,在不同的胁迫条件下其翻译水平的表达模式表现出与转录水平的不一致性。本研究为深入了解条斑紫菜在逆境适应机制中MAPK蛋白的作用奠定基础,同时为条斑紫菜抗逆品系的选育提供理论指导。     

加权基因共表达网络探究链状亚历山大藻爆发性生长的分子机制

链状亚历山大藻(Alexandrium pacificum)作为典型的产毒赤潮甲藻,分布广泛,而对其爆发性生长的研究将有助于探究由其引发的赤潮的分子机制。本研究通过模拟赤潮爆发的条件对链状亚历山大藻进行表达谱测序,利用表达谱测序后得到的基因表达量数据,采用加权基因共表达网络(WGCNA)构建方法探究链状亚历山大藻的爆发性生长的分子机制。通过计算基因间表达量的相关性得到了35个基因共表达模块,将基因共表达模块与链状亚历山大藻爆发性生长性状相关联,在爆发性生长阶段,有6个显著性相关的模块,基于KEGG及GO功能富集分析,这些模块涉及蛋白质的加工合成、核糖体的合成,电子传递,碳水化合物代谢等过程,表明了细胞代谢能力的提升,为细胞增殖提供了物质基础。此外有大量的未知功能的枢纽基因被发现,基因模块可以用于推测这些基因的功能,从而为以后挖掘新基因,探究潜在的调控机制提供了基础。     

病毒感染海洋球石藻Emiliania huxleyi的转录组分析

海洋球石藻Emiliania huxleyi及其特异性裂解病毒E. huxleyi virus (EhVs)在调节海洋碳、硫循环及全球气候变化中起着重要作用,也是开展真核生物病毒–宿主相互作用研究的良好模型系统之一。为了探究病毒感染条件下E. huxleyi基因表达水平的变化,以海洋球石藻E. huxley–BOF 92及其专一性裂解病毒EhV-99B1为研究对象,利用Illumina HiSeq 2000高通量测序技术,分别对E. huxleyi病毒感染组(Exp)和非感染对照组(Con)6 h和45 h的藻细胞样品进行转录组测序分析。共得到32 909条平均长度为1 153 bp的基因。病毒感染6 h和45 h分别得到2 617和5 229个差异表达基因,其中共差异表达基因465个。随机选取10条差异表达基因,采用qRT-PCR进行实验验证,结果证实转录组分析可靠。GO功能注释和KEGG通路富集,发现大量基因与氧化应激反应、脂类代谢、碳水化合物代谢及信号转导等代谢过程相关,其中变化最显著的是谷胱甘肽代谢途径。从病毒感染球石藻转录组中筛选出部分与氧化应激反应相关的基因,其中9个基因显著上调,11个基因显著下调,表明宿主能够通过体内的氧化应激反应响应病毒胁迫。