合浦珠母贝基因组微卫星富集文库的构建与分析

采用生物素标记的(AC)_(15)探针和磁珠富集法构建合浦珠母贝(Pinctada fucata)基因组DNA微卫星富集文库。随机挑选2097个克隆进行筛选,得到483个候选克隆(23.03%),对其中135个阳性克隆测序分析发现122个克隆含有微卫星重复单元(90.37%)。进一步通过序列比对,最终得到65个具有特异微卫星序列的阳性克隆(53.28%),其中包含85个微卫星DNA结构域,其中完美型(perfect)70个,占82.36%;非完美型(imperfect)7个,占8.24%;混合型(compound)8个,占9.41%,重复次数主要分布在5~20(95.74%),平均重复次数为7.83,(AC/GT)n重复所占比例最高(75.53%)。基于微卫星两端的侧翼序列,利用Primer Premier 5.0设计引物,获得11对具有多态性的微卫星引物。本研究为开展合浦珠母贝分子育种及资源评价分析提供了基础资料。     

合浦珠母贝转录因子PF-CREB3L2基因的克隆和鉴定

克隆得到了合浦珠母贝(Pinctada fucata)PF-CREB3L2蛋白的c DNA序列,其c DNA全长1 983 bp,其中开放阅读框长度为1 728 bp,编码的蛋白含有575个氨基酸残基。组织表达分布实验发现,其在合浦珠母贝内脏囊中表达量最高,在外套膜和鳃中也有大量表达,推测其广泛参与合浦珠母贝的贝壳形成等生理活动。贝壳损伤修复实验中发现,在合浦珠母贝贝壳受到损伤后,PF-CREB3L2和基质蛋白的表达量会迅速上升,且PF-CREB3L2的峰值出现更早,推测其通过影响基质蛋白转录,参与合浦珠母贝生物矿化的调控过程。PF-CREB3L2与合浦珠母贝基质蛋白表达相关性的分析发现,PF-CREB3L2与Prisilkin39、KRMP的表达量呈现显著的正相关,说明其可能特异性地调控某些基质蛋白的转录。     

中药对合浦珠母贝插核手术伤口愈合效果和珍珠质量的影响

研究了3 种中药对合浦珠母贝(Pinctada fucata)插核手术后体重日增长速度、伤口的愈合效果及其对珍珠质量的影响。试验采用白藜芦醇、芦荟胶和云南白药对插核伤口进行单次处理(插核手术后及时处理)和3 次处理(手术后第5 天和第10 天分别进行第2 次和第3 次处理), 对体质量日增长速度、愈合率和珍珠质量进行统计分析。结果显示, 休养期各组体质量日增长速度变化趋势基本相同, 早期几乎全为负增长(0.06～?0.26 g/d), 第16 天基本恢复正常生长水平, 达到0.54～0.93 g/d, 后期云南白药单次处理组的增长速度最快(1.52 g/d), 显著高于对照组(0.34 g/d)(P<0.05), 但处理次数对体质量增长的影响不大。各试验组愈合率均较高, 10 天时试验组的愈合率达90%以上(90.7%～99.2%), 显著高于对照组(79.8%)(P＜0.05), 其中云南白药处理组的愈合率最高。各处理组的商品珠比例(87%~90%)均较高,但优质珠比例各组差异较大, 最高的是白藜芦醇和云南白药单次用药组, 分别为52.4%和54.8%。上述结果表明, 中药处理对伤口的愈合和珍珠质量具有一定的促进作用, 其中, 白藜芦醇或云南白药对伤口单次处理的效果最好。     

合浦珠母贝三倍体和二倍体三个基因座位杂合度与生长的比较

抑制第一极体(T_1组)和抑制第二极体(T_2组)形成的合浦珠母贝三倍体,其Lap-3,Pt-5和Sod-1基因座位的杂合度比野生贝或养殖贝都有提高。T_1组这三座位的平均杂合度高于T_2组。两处理组内三倍体各基因座位杂合度不一定高于同胞二倍体,在杂合座位数与大小测量间也未证实有正相关性。但三倍体的生长速度都显著高于同胞二倍体,这主要是因为三倍体性腺发育差导致能量转向体细胞生长所致。     

合浦珠母贝三倍体和二倍体的生长比较

合浦珠母贝Pinctada martensii(D.)三倍体和二倍体的生长测定表明,三倍体成贝平均壳高、壳长、壳宽和体重均超过二倍体同胞,差异极显著(P<0.01)。特别是抑制第一极体形成的三倍体,经两年养殖,壳高、体重和肉重分别比二倍体增加13.01％,44.03％和58.37％。在繁殖期,三倍体的增长率显著超过二倍体。非繁殖期的大多数月份,三倍体的增长率和二倍体相差不大。因此,可以认为三倍体生长速度快主要是由于三倍体的生殖腺发育受阻,体内积累的能量转移到体细胞生长所致。     

三倍体和二倍体合浦珠母贝育珠比较初步研究

利用人工诱导培育的三倍体合浦珠母贝Pinctada martensii(D.)进行插核育珠试验,并同处理组内的二倍体同胞进行比较。结果表明:三倍体合浦珠母贝的留核率和正圆珠比率分别为81.0％和58.8％,而二倍体则为71.3％和37.8％;在非正圆珠中两者的污珠率差别不大,但三倍体的尾巴珠和素珠的比率明显低于二倍体;三倍体的正圆珠珍珠层平均厚度和平均重量分别为381μm和163mg,二倍体分别为265μm和105mg,两者差异极显著(P<0.01)。初步表明,利用三倍体合浦珠母贝培育珍珠,能缩短育珠期,提高珍珠的产量和质量。     

马氏珠母贝养殖群体的生长特性研究

从养殖于深圳大亚湾海区的3月龄马氏珠母贝Pinctada martensii养殖群体中挑出较大和较小个体的贝分为2个组,分别命名为大个体组和小个体组,以同样的方式进行养殖,在3—12月龄间每隔1—2月对其生长进行测量;同时取12月龄的贝200个编号进行个体生长测量,到16月龄结束。经t检验,大个体组贝在各个测量阶段4个性状(壳长、高、宽和体重)都显著大于小个体组(p<0.01),大个体组日增长幅度在3—9月龄也大于小个体组;经最小显著差法分析,个体测量的3个亚组间大小存在显著差异(p<0.01),顺序为Ⅰ(Ⅰ’)<Ⅱ(Ⅱ’)<Ⅲ(Ⅲ’),但其日增长量为Ⅰ(Ⅰ’)>Ⅱ(Ⅱ’)>Ⅲ(Ⅲ’),同时显示出初始值较大的个体在后期仍有较大的增长趋势,但个别初始值较小的个体增长快,在生长后期个体也很大。3—9月龄贝的大小平均增长率大于11—16月龄贝,而体重增长要小于11—16月龄贝。该研究结果对选择育种中亲本的选留、珍珠生产中植核贝的选留具有较大的指导作用。     

合浦珠母贝β-肌动蛋白基因的克隆和序列分析

为进一步研究珍珠质基质蛋白外排机制,同时为今后合浦珠母贝(Pinctada fucata)不同组织的基因表达研究提供阳性对照,根据大鼠(Rattus norvegicus)胞质型肌动蛋白β-actin设计引物,通过RT-PCR方法克隆鉴定了合浦珠母贝肌动蛋白同源基因片段。序列分析表明,该片段编码的氨基酸序列与相应同源片段具有较高的保守性。合浦珠母贝β-肌动蛋白有多个特有的氨基酸残基。合浦珠母贝可能是在系统进化上较早分出的一支。     

合浦珠母贝二倍体、三倍体和非整倍体群体的基因杂合度与生长比较

采用淀粉凝胶电泳方法对合浦珠母贝Pinctadamartensi(D.)雌性三倍体与雄性二倍体交配,细胞松弛素B抑制其受精卵第一极体释放产生的二倍体、三倍体及非整倍体3个群体进行了同工酶研究。二倍体、三倍体及非整倍体群体在6个多态位点的平均基因杂合度分别为0.255±0.087,0.286±0.097,0.275±0.089,三倍体的杂合度高出二倍体约12%,表明多倍体诱导能增加诱导群体的杂合度。但在单个位点上,三倍体的杂合度不一定高于二倍体;在各自群体内,平均杂合位点数与生长间无明显的相关性,单个位点上的杂合子也未完全表现出其生长大于纯合子,且差异不明显(p>0.05)。因此,合浦珠母贝三倍体的快速生长难以完全用杂合度增高假说解释,只能说明诱导处理能使三倍体的杂合度增高,而能量再分配和"巨型性"可能对其快速生长起着不可忽视的作用。非整倍体群体的杂合度高于二倍体群体,但其生长却小于二倍体,其原因可能是染色体的增减对机体的生长有一定的影响。     

马氏珠母贝家系遗传结构的微卫星分析

利用6个微卫星位点研究了9个马氏珠母贝(Pinctada fucata)养殖家系的遗传结构,为后续育种工作提供了指导。从60对引物中筛选出6对能够稳定扩增且多态性较好的引物。6个微卫星位点在9个家系中共检测到17个等位基因,每个位点等位基因数(A)为2~4个,平均2.833个。6个位点在9个家系上的有效等位基因数(Ne)平均值为2.030~2.632,平均杂合度观测值(Ho)为0.4306~0.6354,平均杂合度期望值(He)为0.4380~0.5962。家系间遗传分化系数(FST)为0.0749。采用NJ法进行聚类分析显示,9个家系分为明显的两支,根据遗传距离计算结果, F7和F9家系之间的遗传距离最近, F11与F12家系遗传距离最远。结果表明,9个家系的遗传多样性和遗传分化处于中等水平,可以考虑F11与F12家系杂交,以期获得较好的杂种优势, F11自交培育出遗传稳定的优良家系。     

合浦珠母贝iPS细胞相关的转录因子的克隆及分析

转录因子Sox2、Oct4、c-Myc和KLF4在iPS细胞研究中具有重要作用,将它们加入体外培养的细胞中,可以诱导体细胞去分化成为多能干细胞。作者通过RACE-PCR技术从合浦珠母贝(Pinctada fucata)的外套膜组织中克隆获得了3个转录因子——c-Myc、Sox2及KLF4的cDNA。c-Myc全长1585bp,开放阅读框的长度为1131bp,编码376个氨基酸,蛋白结构分析表明它具有保守的HLH和Myc-N结构域。Sox2全长1908bp,开放阅读框长度为990bp,编码329个氨基酸,蛋白结构分析它具有保守的HMG-box和Soxp结构域。KLF4全长2268bp,开放阅读框长624bp,编码207个氨基酸,预测该蛋白具有两个zf-H2C2_2结构域。BLAST分析它们均与太平洋牡蛎的相关蛋白具有较高同源性,说明其与太平洋牡蛎亲缘关系更近。RT-PCR实验发现这3个基因在合浦珠母贝外套膜、足、生殖腺、内脏团、闭壳肌和鳃6种组织中均有表达,表明它们是非常保守的转录因子。本研究对于合浦珠母贝细胞系建立和研究具有启发意义。     

三个文蛤家系双列杂交设计在两种环境下的配合力及杂种优势分析

A 3×3 complete diallel cross comprising three families of the clam Meretrix meretrix(P1, P2 and P3) was used to determine the combining ability of parental families and heterosis of F1 under indoor and openair environments for growth traits. Analysis of variance for shell length and whole body weight indicated highly significant cross effects, environment effects and the interaction of cross by environment. General combining ability(GCA) and specific combing ability exhibited great variation among crosses and between two environments. Pooled over environments, P2 was the top combiner among the three parental families for both traits studied. The cross of P1 and P3 had the highest SCA. Additionally, significant reciprocal effects were observed. For individual environment, about half of the crossbred combinations showed favorable Mid-parent heterosis(MPH)(1%) for the shell length and whole body weight. Our data has shown that non-additive genetic and reciprocal effects constituted the major sources of genetic variation for both shell length and whole body weight, which indicates that crossbreeding among selective families could further explore the heterotic effects.     

中药对合浦珠母贝插核手术伤口愈合效果和珍珠质量的影响

研究了3种中药对合浦珠母贝（Pinctada fucata）插核手术后体重日增长速度、伤口的愈合效果及其对珍珠质量的影响。试验采用白藜芦醇、芦荟胶和云南白药对插核伤口进行单次处理（插核手术后及时处理）和3次处理（手术后第5天和第10天分别进行第2次和第3次处理）,对体质量日增长速度、愈合率和珍珠质量进行统计分析。结果显...     

地塞米松和过氧化氢对合浦珠母贝珍珠层结构及基质蛋白表达的影响

分别用地塞米松(Dexamethasone,DEX)和过氧化氢(H2O2)处理合浦珠母贝(Pinctada fucata),研究其对贝珍珠层和基质蛋白表达的影响。扫描电镜观察显示,DEX可促进珍珠层生长,H2O2则抑制珍珠层生长。体外碳酸钙结晶实验表明,DEX处理组间液蛋白调控文石生成的趋势加强,并加速碳酸钙结晶速率;H2O2处理组相反。实时定量PCR实验显示,DEX处理组TGFβ和NF-кB信号通路关键因子pf-smad3、pf-rel等和基质蛋白Nacrein等基因表达水平明显降低,H2O2作用组则显著上升。由上述结果推测,DEX和H2O2可通过抑制或激活合浦珠母贝的TGFβ和NF-кB信号通路,从而调控与珍珠层形成相关的基质蛋白的表达,并影响珍珠层的结构;同时暗示贝的免疫体系和矿化系统可能存在协同作用,该作用机制具有生物进化学意义,并对养殖珍珠的培育具有借鉴作用。     

长牡蛎(Crassostrea gigas)三个选育群体完全双列杂交后代生长性状分析

利用中国(C)、日本(J)和韩国(K)3个长牡蛎(Crassostrea gigas)第四(F4)代选育群体,采用完全双列杂交方式构建建立了3个自交群体、3个正交群体和3个反交群体。结果表明,各交配组合在180日龄、360日龄和450日龄生长优势差异显著(P0.05);在不同生长阶段各组合的生长性能、一般配合力值、特殊配合力值和杂种优势效能值各不相同。杂交组合C♂K♀、J♂C♀和K♂J♀分别在180日龄、360日龄和450日龄表现出较大的生长优势,而自交组合K♂K♀在各个生长阶段均表现出生长劣势。中国F4代选育群体父母本一般配合力效应值均表现为非负值,而韩国F4代选育群体父母本一般配合力效应值均表现为非正值。杂交组合的特殊配合力效应值在不同生长阶段表现不一致,但与生长优势效能值基本相符。实验结果表明,多数杂交子代在生长性状上存在一定程度的杂种优势,可进行规模化商业推广应用;中国F4代选育群体作为杂交候选父母本时,具有高的可稳定遗传给子代的加性效应值。利用群体选育建立配套系,对不同选育群体进行杂交育种是培育长牡蛎优良新品系的有效方法。     

3个凡纳滨对虾引进群体对温度和盐度耐受力的配合力分析

为筛选凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)人工选育亲本的最佳组合方式,作者采用完全双列杂交交配设计,对3个凡纳滨对虾引进群体建立了9个自繁和杂交组合群体,研究了亲本和子代对温度和盐度的耐受力。研究结果表明:9个群体对温度、盐度胁迫的耐受性均存在显著差异(P0.05),耐高温性状中亲优势(MP)和超亲优势(BP)的变化范围是–17.71%~52.95%和–30.07%~37.96%,其中UM和UH群体的杂交中亲优势均值最高,达到38.61%;耐低温性状MP和BP的变化范围是–22.04%~77.03%和–33.93%~31.17%,其中UM和TZ群体的杂交中亲优势均值最高,为60.85%;耐高盐性状MP和BP的变化范围是–39.41%~76.96%和–42.12%~19.07%,其中UM和TZ群体的杂交中亲优势均值最高;耐低盐性状MP和BP的变化范围是–44.89%~37.05%和–45.68%~28.21%,而UM和TZ群体的杂交中亲优势均值最低,仅为–9.855%;杂交后代耐受性的表现受到父本、母本一般配合力以及杂交组合特殊配合力共同影响,其中UM群体耐高低温性状的一般配合力较高,而TZ群体耐高低盐性状的一般配合力较高;特殊配合力分析表明,UM×UH为强优势组合,存在较强的抗逆非加性效应,杂交优势明显。本研究从数量遗传水平评估选育群体对温盐的耐受性能,可为进一步家系选育提供候选材料。