红树林混合发酵产氢菌群中梭菌属Fe-氢酶基因(hydA)的克隆及序列分析

采用间歇产气试验方法对红树林淤泥中的混合菌群进行产氢菌群富集,并对混合产氢菌群发酵产氢过程中发酵液的pH值和氧化还原电位(ORP)的变化进行分析.此外,在产氢速率最高时段,发酵液中菌群经过常规的基因组提取,分别采用通用的梭菌属Fe-氢酶基因和16S rRNA基因引物进行PCR扩增,扩增产物经变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析.结果发现产氢菌群中至少有6种,而Fe-氢酶基因只含有一种.将Fe-氢酶基因的扩增片段切胶纯化之后,经PCR重新扩增、纯化,克隆测序.NCBI序列比对结果表明,该片段序列与产气荚膜梭菌Fe-氢酶基因的序列相似性达99%.根据已知产气英膜梭菌Fe-氢酶基因序列设计引物,经两轮PCR扩增获得Fe-氢酶基因全序列.混合菌群中Fe-氢酶基因GenBank数据库的登录号为EU590683.此外,采用Bioedit和Mega2软件构建了Fe-氢酶的NJ系统进化树,结果表明该Fe-氢酶基因与产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)聚为一类.推测的氨基酸序列与产气英膜梭菌的相应序列相似性达97%-99%.PfamHMM结构域查找结果发现,此氢酶含有五个结构域,分别为1个2Fe-2S铁硫簇结合区域、2个4Fe-4S结合区域、Fe-氢酶大亚基和Fe-氢酶小亚基.     

起始pH值对海洋混合菌群产氢量的影响

对采自天津潮间带的污泥进行热休克处理,厌氧条件下富集混合菌群进行产氢试验;设置起始pH从4．0到8．0（间隔0．5个单位）,比较混合菌群在不同pH培养条件下产氢量;利用变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析不同起始pH培养条件下的混合菌群组成。结果表明,在起始pH为7．0时,混合菌群产氢量最高。不同起始pH对产氢量的影响,依...     

蓝藻氢代谢相关酶及其分子生物学研究进展

综述了蓝藻中催化氢代谢反应的2种关键酶—固氮酶和氢化酶的生物学特征、分子基础及其编码基因和转录等最新研究进展。蓝藻在固氮细胞中的净产氢量是固氮酶和氢化酶(包括吸收氢化酶和双向氢化酶)综合作用的结果,但在非固氮情况下的产氢则主要是由双向氢化酶催化的。可通过有效利用基因工程技术对产氢相关酶基因进行改造,改进生物产氢系统。     

印度尼西亚卡利安达岛近岸热泉微生物和氢酶基因的多样性

研究对2011年7月采自印度尼西亚卡利安达岛近岸热泉的样品,进行了细菌和古菌16S rRNA基因和细菌氢酶基因克隆文库的构建、序列测定和多样性分析。结果表明:热泉系统的细菌和古菌由16个门组成,Proteobacteria为热液流体和沉积物的优势类群,丰度分别为59.5%和73.3%,Cyanobacteria为菌苔的优势类群(丰度,56.5%);具有氨氧化作用的Crenarchaeota为古菌的优势类群。热泉系统中,70%以上的种类与海洋细菌的亲缘关系最近,说明该系统具有海洋特性;约20%的种类与陆地热泉中嗜热或中等嗜热细菌的亲缘关系最近,这些种类可能来源于高温地层内部,并参与了铁氧化还原、氢氧化、硫氧化和硝酸还原等过程。热泉系统中,NAD(P)-关联的双向NiFe-氢酶基因和FeFe-氢酶基因的组成分布也受到温度和盐度分布变化的影响。研究为揭示浅海热液系统提供理论参考。     

烟台市区河流入海口微生物群落的分析

2015年4月在烟台市区4条主要河流(辛安河、逛荡河、鱼鸟河和夹河)入海口处采集12个样品,利用PCR-DGGE方法分析了此区域的细菌群落组成和优势菌群。通过统计学手段对DGGE图谱进行分析,结果表明4条河流入海口细菌群落丰富度都较高,12个取样点扩增的DGGE条带数都在30以上,样品的Shannon指数均高于3.3,个别甚至可达3.61。其中,辛安河和逛荡河的Shannon指数平均值均高于鱼鸟河和夹河,夹河多样性最低;而且UPGMA聚类分析结果显示地理位置越接近,其细菌组成的相似度越高。在DGGE电泳条带中选取14条主要条带进行扩增和序列测定,所得到的序列进行了系统进化分析发现4条河流入海口的优势菌群主要为变形杆菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)。这与近年来关于山东近岸海域细菌多样性的研究结果相符合,为研究和保护烟台市区河口处环境提供科学依据。     

成团泛菌依赖型磷酸甘油酸变位酶基因的克隆、序列分析及产氢中的差异表达

为研究高效产氢菌株成团泛菌(Pantoea agglomerans)BH-18中依赖型磷酸甘油酸变位酶(cofactor-dependent phosphoglycerate mutase, dPGM)与产氢之间的关系,本研究根据GenBank上已登录的肠杆菌中编码 dPGM的基因序列设计一对引物,从细菌基因组 DNA中克隆得到编码 dPGM基因的完整开放阅读框,其长度为753 bp,编码250 aa。采用BLAST对其与NCBI GenBank中的核苷酸序列进行比较分析,结果表明该基因保守性相对较高,与肠杆菌科众多菌株中的 dPGM 基因相似性达100%。采用Bioedit和Mega4软件构建NJ系统进化树,结果表明成团泛菌BH-18的dPGM氨基酸序列与Enterobacter asburiae的dPGM聚为一类,而与成团泛菌属中其他菌株的该蛋白关系较远, dPGM的氨基酸序列在属内不保守。最后,根据已获得的基因序列设计引物,采用RT-PCR的方法分析了成团泛菌BH-18产氢过程中dPGM基因的转录情况,结果表明dPGM基因的转录与产氢呈正相关,依赖型磷酸甘油酸变位酶是产氢过程中的关键酶。     

两种鲨鱼鳃部真菌菌群的PCR-DGGE分析

以提取自东海海域两种鲨鱼(尖吻鲭鲨和噬人鲨)鳃耙组织的总DNA为模板,对其真菌菌群rDNA的基因内转录间隔区ITS1序列进行了PCR扩增,扩增产物经变性梯度凝胶电泳(DGGE)分离,电泳图谱中的7条主要条带经过二次PCR扩增后进行了克隆测序。NCBI-BLAST比对及分子系统发育分析结果表明,尖吻鲭鲨鳃部真菌菌群的优势种来自四个分类单元,其中一个来自青霉属,三个来自曲霉属;噬人鲨鳃部真菌的优势种来自四个分类单元,其中一种来自青霉属、两个来自梗孢酵母属、一个来自枝顶孢属;青霉属为两种鲨鱼鳃部共同的优势菌;另外DGGE指纹图谱显示还有种类较丰富的劣势菌存在。数据库检索显示多数真菌分类单元具有较好的产生生物活性天然产物的潜力。该PCR-DGGE分析揭示鲨鱼鳃部栖生有较丰富的真菌类群,它们的代谢产物及其与宿主之间的相互作用还有待深入研究。     

海洋沉积物中异化铁还原细菌还原重金属Cr(Ⅵ)研究

利用异化铁还原细菌处理Cr(Ⅵ)是重金属污染修复领域的一个新兴研究方向。本文以海洋沉积物中异化铁还原混合菌群为研究对象,分析铁还原细菌异化铁还原性质对重金属Cr(Ⅵ)还原效率的影响。菌群异化铁还原性质的实验结果表明,以柠檬酸铁和氢氧化铁为不同电子受体时,菌群异化铁还原的效率存在差异,培养体系累积Fe(II)浓度分别为85.08±5.85 mg/L和32.55±4.78 mg/L。电子受体对混合菌群组成的影响主要表现在,以柠檬酸铁和氢氧化铁为电子受体时,混合菌群多样性Shannon指数分别是4.615和4.158,较对照组高(Shannon指数3.735)。异化还原Fe(Ⅲ)培养体系中,细菌种群的优势菌属是Clostridium,属于梭菌目Clostridiales,表明梭菌是参与Fe(Ⅲ)还原的主要优势菌。菌群异化铁还原性质对Cr(Ⅵ)还原效率影响的实验结果表明,柠檬酸铁为电子受体,细菌在Fe(Ⅲ)浓度为1 120 mg/L时异化铁还原效率高,并且还原Cr(Ⅵ)达100%。氢氧化铁为电子受体, Fe(Ⅲ)浓度1 680 mg/L时,异化铁还原Cr(Ⅵ)效率高(72%),是对照组4倍。研究结果为进一步应用微生物治理重金属Cr(Ⅵ)污染提供理论依据。     

TMCPX80管线钢焊接件耐氢渗透研究

采用氢渗透试验法、硫化氢致应力四点弯曲法研究了TMCP X80高强度管线钢焊接件不同部位的氢渗透及其开裂行为,用扫描电镜对母材、热影响区、焊材进行显微组织分析.结果表明,该SZP-117试样各区显微组织不同,焊材比母材耐氢渗透能力差,焊接后熔合线部位耐氢渗透能力大于焊材的,但热影响区耐氢渗透性能次于母材.另外,s-117试样大热输入耐氢致开裂的能力比小热输入差.     

TMCPX80管线钢焊接件耐氢渗透研究

采用氢渗透试验法、硫化氢致应力四点弯曲法研究了TMCP X80高强度管线钢焊接件不同部位的氢渗透及其开裂行为,用扫描电镜对母材、热影响区、焊材进行显微组织分析。结果表明,该SZP-117试样各区显微组织不同,焊材比母材耐氢渗透能力差,焊接后熔合线部位耐氢渗透能力大于焊材的,但热影响区耐氢渗透性能次于母材。另外,s-117试样大热输入耐氢致开裂的能力比小热输入差。     

水产品鲐鱼(Pneumatophorus japonicus)细菌多样性及优势微生物分析

为研究鲐鱼(Pneumatophorus japonicus)在不同冻藏时期的优势微生物,并且得到一个较全面的细菌群落组成结构,采用16SrDNA基因克隆文库及克隆子分析等方法,分别对冻藏1d、8d和20d条件下鲐鱼鳃体系中的细菌种群多样性、优势微生物及其中产组胺菌的变化进行分析。结果表明,不同时期鲐鱼鳃内的细菌多样性均较强;冻藏1天的鳃体系中不动杆菌属(Acinetobacter)占优势为总数的77.5%,产组胺细菌如泛菌属(Pantoea)和肠杆菌属(Enterobacter)较少;第8天优势细菌种群是梭杆菌属(Fusobacteria bacterium)和希瓦氏菌属(Shewanella),而产组胺菌如发光杆菌属(Photobacterium)和弧菌属(Vibrio)较前期数量有所增加;冻藏到第20天的优势种群为哈夫尼菌属(Hafnia)和沙雷菌属(Serratia),它们均是产组胺的菌群。鲐鱼中细菌多样性及其优势微生物的变化等全面信息可为了解鲐鱼水产品组胺发生的微生物机制及其控制方法提供重要依据。     

脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)3 个野生群体mtDNA 16S rRNA 序列差异及长臂虾科系统进化关系

采用PCR扩增和序列测定等技术,对脊尾白虾3个野生群体共计58个个体的线粒体16SrRNA基因片段进行初步研究。结果表明,在获得的长度为509bp核苷酸序列中,共检测到7个变异位点、8种单倍型,除象山湾群体外其它两个群体遗传多样性水平都较低。AMOVA分析表明,象山湾与莱州湾群体有显著的遗传差异,其余群体间的遗传差异不显著。另外,将本研究所得序列与GenBank中长臂虾科11个种的16SrRNA基因片段序列进行比较后,发现其聚类关系与传统分类略有不同,并依据16SrRNA序列变异百分比推测了长臂虾科12个种的大致分化时间。     

北极细菌Pseudoalteromonas sp.A2对H2O2胁迫的转录组分析

海水中的高溶解氧浓度、低温和UV辐射导致了氧胁迫是北极海洋细菌面临的主要胁迫因素之一。本文对北极细菌Pseudoalteromonas sp.A2对H₂O₂导致的氧胁迫的应答特征进行了转录组测序和基因差异表达的比较分析,以期发现与氧胁迫相关的关键功能基因。研究表明,与对照组相比,1 mmol/L的H₂O₂可导致菌株A2转录组的很大变化,包括109个基因的显著上调与174个基因的显著下调。COG分析表明,在功能已知的基因中,与转录后修饰、蛋白质转换和分子伴侣相关的基因大部分显著上调,而与氨基酸运输和代谢等相关基因则大部分显著下调。值得指出的是,有18个与鞭毛相关的基因和4个与热激蛋白相关的基因显著上调;同时,有9个与细胞色素和细胞色素氧化酶相关的基因和5个与TonB依赖受体相关的基因显著下调。在GO分析表明具有抗氧化活性的18个基因中,只有1个基因的表达显著上调,而有2个显著下调。简言之,RNA-Seq表明,除了传统的抗氧化基因和应激蛋白外,鞭毛相关基因和功能未知基因在菌株Pseudoalteromonas sp.A2的氧胁迫适应性中起着重要作用。该转录组分析和氧胁迫相关基因的发现有助于了解北极细菌的氧胁迫适应机制。     

日本对虾(Penaeus japonicus)病原需钠弧菌(Vibrio natriegens)表型与分子特征及LAMP检测方法的建立

采用常规表观生物学特性及16S rRNA、gyrB及rpoA基因同源性检索与系统发育学分析等方法,对分离自江苏连云港某育苗场的大批死亡日本对虾蚤状幼体的优势生长菌进行了综合鉴定。结果表明,其形态和生理生化特征与弧菌属的需钠弧菌相近;16S rRNA、gyrB及rpoA基因同源性检索也均与需钠弧菌相似性最高,分别为98%、89%和95%,且三种基因的NJ系统发育树也均与需钠弧菌聚为一个分支;分离菌的致病性试验表明其半数致死量LD50为1.8×106CFU/ml。综合分离菌的致病性、形态与生理生化特征及基因同源性与系统发育分析结果,认为引起日本对虾蚤状幼体大批死亡的病原为需钠弧菌。基于gyrB基因序列设计1套LAMP特异性引物,建立了需钠弧菌的快速特异性检测方法,可用于由需钠弧菌引起的水产动物疾病的诊断及分子流行病学的调查研究。     

不同饲养方式对乌鳢(Ophiocephalus argus)肠道微生物群落结构差异及种类多样性的影响

以乌鳢(Ophiocephalus argus)为研究对象,采用不同日粮饲喂,试验W1组饲喂冰鲜鱼,试验W2组饲喂畜禽内脏。12周后,取肠道内容物,利用16S rDNA技术研究投喂不同饲粮的乌鳢肠道生物群落结构差异和微生物多样性,分别获得W1组和W2组乌鳢肠道细菌有效序列51124和39298条。结果分析表明;W1组和W2组物种注释(operational taxonomic unit,OTU)数目分别为2631和4114条,分类地位明确的细菌种类分别隶属5个属和49个属,W1组和W2组乌鳢肠道细菌种类差异很大。W1组乌鳢肠道细菌的优势类群是邻单胞菌属(Plesiomonas)、狭义梭菌属(Clostridium sensu stricto)、鲸蜡菌属(Cetobacterium);W2组乌鳢肠道细菌的优势类群是狭义梭菌属(Clostridium sensu stricto)、邻单胞菌属(Plesiomonas)、Spartobacteria、甲基副球菌属(Methyloparacoccus)、杆菌属(Alsobacter)、Saccharibacteria、分支杆菌属(Mycobacterium)。W2组乌鳢肠道细菌香农指数高于W1组乌鳢肠道细菌,表明前者肠道细菌多样性大于后者。本实验揭示了畜禽内脏饲喂乌鳢肠道细菌的群落种类多样性、OTU丰富度和物种总数均高于冰鲜鱼饲喂乌鳢;W1组肠道有益菌OTU丰富度大于W2组,且W2组还存在一些潜在致病菌。本研究为乌鳢的健康养殖和后续肠道微生物资源的挖掘提供了理论依据。     

10个菲律宾蛤仔野生群体的遗传多样性研究

对我国沿海地区10个菲律宾蛤仔野生群体线粒体16S r RNA和COI基因部分序列进行测序,分别得到了长度为473bp和632bp的片段。结果表明,16S r RNA 193条序列A+T平均含量为66.6%,共检测到21个变异位点,193个个体具有22种单倍型;COI基因183条序列A+T平均含量为64.8%,共检测到126个变异位点,183个个体具有67种单倍型。基于群体间遗传距离利用Mega5.1软件构建10个群体的NJ树,聚类结果表明,大连群体和荣成群体聚为一支,其余8个群体聚为一支。AMOVA分析表明,大连群体和荣成群体间分化不显著,而荣成、大连群体与其余8个群体间的分化达到极显著水平(P0.01),说明我国沿海的菲律宾蛤仔野生群体存在一定的遗传分化。     

宁波沿海陆源排污口弓形杆菌属(Arobacter sp.)和梭菌属(Clostridium sp.)的分布特点

弓形杆菌属(Arobacter sp.)和梭菌属(Clostridium sp.)广泛存在于水体和寄生在动物体内,极易造成水体污染和人畜共患病。采用高通量454焦磷酸测序方法对宁波沿海2个重点排污口、8个一般排污口的20个站位水样进行分析,得到1年中的3月、5月、8月和10月份各排污口弓形杆菌属和梭菌属生物的分布情况。研究结果表明:弓形杆菌属检测出两个种,分别是嗜低温弓形杆菌(Arcobacter cryaerophilus)、布氏弓形杆菌(Arcobacter butzleri)。梭菌属共检测出12个种,其中产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)检出次数最高,丁酸梭菌(Clostridium butyricum)次之;排污口的类型是影响弓形杆菌属检出量的重要因素。弓形杆菌属主要分布在氮,磷含量较高的工业排污口和市政排污口,而梭菌属只在3月份的S7宁海西店崔家综合排污口呈现出相对较高的比例(7.5%),其它排污口检出量均在2%以下;弓形杆菌属和梭菌属在10个排污口20个站位4个月份的检出次数呈现正相关性;由季节性的变化引起的气温差异也是影响弓形杆菌属生长的重要因素,弓形杆菌属在5月份的时候检出次数最大,梭菌属适宜生长温度范围较广10—65°C,受温度影响较小。     

Production of methyl bromide and methyl chloride in laboratory cultures of marine phytoplankton II

Methyl halides (monohalomethanes), especially methyl bromide, are known to contribute significantly to ozone destruction in the stratosphere. Budgets of natural and anthropogenic methyl bromide suggest that marine organisms may be the source of a significant proportion of the total global production. Since phytoplankton are abundant in surface waters, they are obvious candidates. Cultures of nine phytoplankton species were grown in CO₂-enriched, nitrate-limited medium in sealed glass vessels. Species tested include Chaetoceros calcitrans, Isochrysis sp., Porphyridium sp., Synechococcus sp., Phaeodactylum tricornutum, Tetraselmis sp., Prorocentrum sp., Emiliania huxleyi and Phaeocystis sp. Methyl bromide (CH₃Br) and methyl chloride (CH₃Cl) concentrations were determined by bubbling the cultures with high-purity air, cryotrapping the effluent and analyzing it on a gas chromatograph with an electron capture detector. The Phaeocystis sp. samples were monitored with GCMS. Cell population, bacterial population, Chl a, pH, and nitrate concentration were monitored for periods of at least two weeks. CH₃Cl was produced by all cultures. CH₃Br was absent in Tetraselmis sp. and Isochrysis sp. cultures, but present in all the others. Methyl iodide (CH₃I) was present in most cultures but could not be quantified due to analytical limitations. CH₃I and CH₃Br production was fastest in stationary phase and continued long after cell division had ceased. Axeic cultures of Phaeocystis sp. achieved almost identical production rates of CH₃Cl and CH₃Br as xenic cultures of the same species. Species from tropical waters had faster CH₃Cl and CH₃Br production rates than temperate species. Scaling the observed production rates using global standing stock estimates for Chl a and particulate nitrogen indicate that phytoplankton can account for only a fraction of the CH₃Cl and CH₃Br believed to be produced in the ocean. Calculations based on the estimated global biomass of Phaeocystis sp. and E. huxleyi blooms show that their contribution is insignificantly small.     

大黄鱼(Pseudosciaena crocea)致病性维氏气单胞菌的分离鉴定与药敏特性研究

本研究从自然发病的养殖大黄鱼(Pseudosciaena crocea)肝脏处分离得到1株优势菌9L2,经形态学观察和传统生理生化鉴定,显示该菌为发酵型革兰氏阴性短杆菌,有动力,氧化酶阳性,水解赖氨酸及色氨酸等。利用Biolog细菌鉴定方法进行种属鉴定,确定9L2为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii),相似性达100%。同时对其16S rDNA基因进行PCR扩增、测序和系统发育分析,结果表明该菌与气单胞菌属的菌株亲缘关系最近,与维氏气单胞菌(登录号为LMG13695)的16S rRNA基因序列相似性达99.79%。经人工腹腔注射感染吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)的试验结果表明,9L2对罗非鱼的半数致死剂量LD_(50)为1.08×10~3CFU/g。24种抗生素药敏试验结果表明,该菌株对诺氟沙星、新生霉素、呋喃妥因、头孢曲松等13种药物高度敏感,对洛美沙星、卡那霉素等5种药物中度敏感,对利福平、青霉素等6种药物产生耐药性。20种中药体外抑菌试验结果表明,其中11种对致病菌体外抑菌效果较好,平均抑菌浓度范围为0.11—7.20mg/mL。