植物生长调节剂对冈村枝管藻盘状体生长发育的影响

研究了6-苄基腺嘌呤(6-BA)、激动素(KT)、奈乙酸(NAA)和甲壳素4种植物生长调节剂对枝管藻(Cladosiphon okamuranus Tokida)盘状体的影响.结果表明:在试验范围内6-BA对盘状体的生长具有较明显的促进作用,其质量浓度为0.5 mg/L时的促进效应最强;不同质量浓度KT下生长的盘状体直径均大于对照,其最有效质量浓度为1 mg/L;NAA可以延长枝管藻盘状体的生长时间,促进盘状体生长,其质量浓度为5 mg/L时,盘状体的生长时间被延长7 d左右,直径可达780μm,比对照(540μm)高出240 μm;甲壳素对盘状体生长有明显的抑制作用.     

温度、盐度和pH对冈村枝管藻中性游孢子附着及生长发育的影响

用毛细管法分离出冈村枝管藻成熟的多室孢子囊,并对中性游孢子的发育模式及温度、盐度、pH对其附着及生长发育的影响进行了研究。结果发现：（1）中性游孢子正常发育模式如下：附着后,形成盘状体;而后在盘状体中间产生同化丝,大量同化丝产生后,基部细胞变形、聚集,形成假薄壁组织,直立藻丝形成;（2）中性游孢子附着及生长发育明显受温度、盐度和pH条件的影响。中性游孢子附着的适宜温度17--28℃、盐度为20～50、pH为5～10．4;直立藻丝形成的条件为温度17～26℃、盐度20～40、pH7～10。本研究为冈村枝管藻海上栽培提供了理论依据。     

Phaeocystis globosa与Phaeocystis antarctica叶绿体psbA基因的比较

测定了2株球形棕囊藻Phaeocystis globosa P1、P2的psbA基因序列。发现得到的2个序列完全相同。以P2序列对比分析了P．globosa和P．antarctica的psbA基因在DNA序列、氮基酸序列和RNA二级结构上的差异性，发现2种棕囊藻psbA基因DNA序列和氨基酸序列非常保守，无插入／缺失，其核苷酸和氨基酸变异率分别为1．88％和1．13％。与核基因核苷酸的碱基替换不同，psbA基因核苷酸的碱基替换主要发生在密码子的第1位上。且不引起氨基酸的变化，引起氨基酸变化的碱基替换都发生在密码子的第2位和第3位上。在RNA二级结构上两序列的1～4茎环结构完全相同，表现出明显的棕囊藻属的特异性，其它结构区域差异较大。种间差异表现明显。由于psbA基因DNA序列和氨基酸序列非常保守，可能不适宜棕囊藻属的系统发育分析。但其RNA二级结构可能对于棕囊藻的分子分类有一定的参考价值。     

海洋球石藻Emiliania huxleyi(Prymnesiophyceae)病毒主要外壳蛋白基因的克隆与序列分析

在实验室纯培养条件下,用过滤的海洋球石藻特异性病毒(Emiliania huxliyi virus,EhV)EhV-99B1株感染球石藻(E.huxleyi,Eh),建立病毒与宿主之间稳定的感染体系,病毒裂解滤液经卷式切向流超滤和PEG 8000浓缩、CsC1密度梯度离心,获得足量高纯度的病毒颗粒.根据已报道的其它EhV株系主要外壳蛋白(MCP)基因内保守片段设计合成一对特异引物,从EhV-99B1病毒基因组中克隆到了长度约为300bp的病毒外壳蛋白基因保守片段.该片段与pBS-T载体连接后转化Escherichia coli DH5α,对筛选到的阳性克隆进行序列测定与分析.结果表明,该克隆片段与GenBank中EhV163(AF453851)分离株的同源性最高,该区域内的核苷酸与对应推导的氨基酸序列同源性均为100%,证实获得的DNA片段是EhV-99B1的外壳蛋白基因;与EhV203(AF453855)分离株的核苷酸及氨基酸序列的同源性较低,分别为93%和100%.表明该病毒在自然海域中分布广泛并具有一定的多态性,同时在进化上也存在相当的复杂性.因此,MCP基因可以作为一种新的分子遗传标记以区分自然群落中EhV的不同基因型,对于理解海洋球石藻类病毒与宿主之间复杂的相互作用关系将是一个十分有价值的工具.     

碱蓬PEPCase基因的克隆与分析

采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术首次获得碱蓬(Suaeda glauca)中含PEPCase基因完整编码区的cDNA序列,长度为3 038 bp.获得的序列采用生物信息学方法和系统进化方法进行分析.结果表明,获得的cDNA序列包含2 898 bp的完整开放阅读框,编码的966个氨基酸序列含有两个PEPCase活性位点以及6种其他的活性位点;预测蛋白质的相对分子质量为109 785.3,等电点为5.51,属于不稳定的亲水性蛋白;含量相对较多的氨基酸是Leu、Glu、Arg、Asp、Ser,不含Pyl和Sec;不包含跨膜结构和信号肽序列,推断为非分泌性蛋白;二级结构以α螺旋为主,三级结构为紧密球状结构;分析结果还表明获得的碱蓬PEPCase基因应该属于C3型.通过对碱蓬PEPCase基因的克隆及序列分析从而为后期碱蓬PEPCase蛋白表达的研究及获得高油量的转基因碱蓬植株奠定了基础.     

曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)-肌动蛋白基因的 cDNA 全长克隆与序列分析

采用RT-PCR和快速扩增cDNA末端(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术首次克隆了曼氏无针乌贼?-肌动蛋白基因的 cDNA 全序列, 该序列全长为 2000bp, 由长 197bp 的 5’非翻译区(untranslated region, UTR), 669bp 的 3’非翻译区, 和 1134bp 的开放阅读框(open reading frame, ORF)组成。阅读框共编码 377 个氨基酸, 推算的分子量约为 42.0kDa, 理论等电点为 5.16。曼氏无针乌贼-actin 氨基酸序列中 Ile12、Ser172、Ser174、Gln223、His227、Ile231、Gly232、Ser320、Glu328、 Thr360等10个氨基酸残基具有特异性, 以及2个特殊的氨基酸残基位点和2个软体动物特有的氨基酸残基。曼氏无针乌贼?-actin 氨基酸序列与软体动物、节肢动物、脊椎动物的相似性高达 97%。NJ法系统进化分析显示曼氏无针乌贼首先与软体动物聚在一起, 然后与节肢动物聚在一起, 再与鱼类、两栖类、哺乳类聚在一起。     

桐花树多酚氧化酶同源基因片段的克隆及序列分析

以桐花树(Aegiceras corniculatum (L.) Blanco)叶为材料, 采用同源PCR克隆策略, 扩增桐花树多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase, PPO)铜结合区之间的cDNA序列.该序列长度597 bp (Genbank accession No. GQ404509), 编码了一段由199 个氨基酸残基组成的多酚氧化酶保守区片段.桐花树PPO保守区片段具有PPO铜结合区A(CuA)的特征信号序列Hnswl.FFpFHRyyLyffE.同源比对表明, 该序列与GenBank上其他已有的植物多酚氧化酶氨基酸序列的同源性都在65%以上.     

大黄鱼(Larimichthys crocea)IGF-Ⅰ基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR和RACE技术克隆了大黄鱼胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)cDNA的全序列,序列全长2027bp,由57bp的5’非翻译区、1409bp的3’非翻译区和561bp的开放阅读框组成。序列分析表明,大黄鱼IGF-Ⅰ编码区包括信号肽、成熟肽(B、C、A、D)和E等6个区域的186个氨基酸,形成成熟肽时,信号肽和E区被切除,成熟肽分子量7.5kDa,等电点(pI)为7.76,成熟肽的B区和A区有6个保守的半胱氨酸残基,形成3对二硫键,起到了稳定IGF-Ⅰ三维结构的作用。与其它物种的IGF-Ⅰ比对后发现A、B区域比较保守,C、D区域保守性较差;E区域的分析结果表明,大黄鱼IGF-ⅠcDNA序列为Ea-4亚型。核苷酸同源性分析发现,大黄鱼IGF-ⅠcDNA与美国红鱼同源性最高,为99.47%;与斜带石斑鱼、金头鲷和褐牙鲆的同源性依次降低,分别为97.68%、97.50%和95.90%。     

织锦巴菲蛤(Paphia textile)过氧化氢酶基因cDNA全长克隆、序列同源分析与组织表达

Catalase is an important antioxidant protein that can protect organisms against various forms of oxidative damage by eliminating hydrogen peroxide. In this study, the catalase c DNA of Paphia textile(Pt CAT) was cloned using RTPCR and rapid amplification of c DNA ends(RACE). Pt CAT is 1 921 bp long and consists of a 5′-UTR of 50 bp, a 3′-UTR of 349 bp, and an ORF of 1 542 bp that encodes 513 amino acids with a molecular weight of 58.4 k D and an estimated isoelectric point of 8.2. Sequence alignment indicated that Pt CAT contained a highly conserved catalytic signature motif(~(61)FNRERIPERVVHAKGAG~(77)), a proximal heme-ligand signature sequence(~(352)RLFSYSDP~(359)), and three catalytic amino acid residues(H~(72), N~(145), and Y~(356)). Pt CAT also contains two putative N-glycosylation sites(~(34)NKT~(36) and ~(437)NFT~(439)) and a peroxisome-targeting signal(~(511)AQL~(513)). Furthermore, Pt CAT shares 53%–88% identity and 29%–89% similarity with other catalase amino acid sequences. Pt CAT m RNA was present in all tested organs, including the heart, digestive gland, adductor muscle, gonad, gill, and mantle, but its expression was highest in the digestive gland. High-temperature-induced stress produced two expression patterns of Pt CAT m RNA: first, an initial up-regulation followed by a down-regulation in the heart, digestive gland, and gonad and, second, consistent down-regulation in all other organs. These results demonstrate that Pt CAT is a typical member of the catalase family and might be involved in the responses to harmful environmental factors.     

曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)ALSM基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR和RACE技术分离、克隆得到曼氏无针乌贼肝脏ALSM(Astacin-like squid metalloprotease)基因。序列分析表明,ALSM cDNA序列全长1418bp,其包括53bp的5’端非翻译区,1290bp阅读框以及含有poly(A)信号AATAAA的75bp3’端非翻译区,阅读框编码429个氨基酸残基。推导蛋白的相对分子质量为48916.31Da,等电点为7.978。ALSM氨基酸序列的同源性分析显示,不同进化地位动物的ALSM氨基酸序列都具有较高的同源性。系统发生树分析发现,曼氏无针乌贼ALSM首先与金乌贼、莱氏拟乌贼、长枪乌贼及太平洋褶柔鱼的ALSM-Ⅰ亚型聚类,再与其ALSM-Ⅱ及ALSM-Ⅲ亚型聚类。生物信息学分析表明,ALSM编码的蛋白为一种亲水性的分泌蛋白。这些结果对进一步研究ALSM的结构与功能以及从基因调控角度探索曼氏无针乌贼在养殖条件下生物学特性变化机理具有重要意义。     

Cloning and expression analysis of the chloroplast fructose- 1,6-bisphosphatase gene from Pyropia haitanensis

Fructose-1,6-bisphosphatase(FBPase) is one of the key enzymes in Calvin circle and starch biosynthesis. In this study, the full-length of cpFBPase gene from Pyropia haitanensis was cloned by using rapid amplification of cDNA ends(RACE) technology. The nucleotide sequence of PhcpFBPase consists of 1 400 bp, including a 5′ untranslated region(UTR) of 92 bp, a 3′?UTR of 69 bp, and an open reading frame(ORF) of 1 236 bp, which can be translated into a 412-amino-acid putative peptides with a molecular weight of 44.3 kDa and a theoretical pI of 5.23. Multiple sequence alignment indicated that the protein belonged to the chloroplast FBPase enzyme. Phylogenetic analysis showed that the protein assembled with the cpFBPase of a thermal tolerant unicellular red micro-algae Galdieria sulphuraria. Expression patterns analyzed by qRT-PCR revealed that the expression of PhcpFBPase gene in the thallus phage was 7-fold higher than in the conchocelis phage, which suggested the different mechanisms of inorganic carbon utilization among the different life phages of P. haitanensis. And the different response modes of PhcpFBPase mRNA levels to high temperature and desiccation stress indicated that PhcpFBPase played an important role in responsing to abiotic stress.     

Cloning and sequence analysis of the self-fertilizing fish Rivulus marmoratus immediate early gene c-fos

We have cloned the proto-oncogene c-fos from a self-fertilizing fish Rivulus marmoratus (Cyprinodontiformes, Rivulidae) after screening of R. marmoratus λGEM-11 genomic DNA library, and sequenced over 12 kb including all exons, introns and the promoter region. The R. marmoratus c-fos gene consisted of one noncoding exon and four exons with high similarity to those of fugu and mammals. We sequenced ≈7 kb of the R. marmoratus c-fos gene promoter region to gain a better understanding of the molecular anatomy of the immediate response of this gene upon cellular damage. In the promoter region, R. marmoratus c-fos gene has seven xenobiotic response elements (XREs) and eight metal response elements (MREs) as well as two estradiol (E2), 4 NFκB, 2 CarG, 2 prolactin (PRL) motifs and one pit1 site, while the 3^′-UTR of this gene contains the estrogen response element (ERE). The seven XRE and eight MRE motifs raise the possibility of its regulation by exposure to environmental pollutants. In this paper, we discuss the gene structure of R. marmoratus c-fos gene and compare its promoter region with those of other organisms' c-fos genes. We propose its potential use in ecotoxicology.     

坛紫菜别藻蓝蛋白α,β亚基基因的克隆和序列分析

以野生坛紫菜色素体DNA为模板, 通过PCR扩增获得编码坛紫菜别藻蓝蛋白α亚基和β亚基的序列及两者之间的间隔序列,该序列全长为1 055 bp,其中编码α和β亚基的序列均为486 bp,间隔序列为83 bp.该序列与GenBank收录的其他4种红藻相关序列的同源性在75.6%~87.4%,与2种蓝藻的同源性分别为66.9%,68.5%,其中编码区同源性更高.     

合浦珠母贝iPS细胞相关的转录因子的克隆及分析

转录因子Sox2、Oct4、c-Myc和KLF4在iPS细胞研究中具有重要作用,将它们加入体外培养的细胞中,可以诱导体细胞去分化成为多能干细胞。作者通过RACE-PCR技术从合浦珠母贝(Pinctada fucata)的外套膜组织中克隆获得了3个转录因子——c-Myc、Sox2及KLF4的cDNA。c-Myc全长1585bp,开放阅读框的长度为1131bp,编码376个氨基酸,蛋白结构分析表明它具有保守的HLH和Myc-N结构域。Sox2全长1908bp,开放阅读框长度为990bp,编码329个氨基酸,蛋白结构分析它具有保守的HMG-box和Soxp结构域。KLF4全长2268bp,开放阅读框长624bp,编码207个氨基酸,预测该蛋白具有两个zf-H2C2_2结构域。BLAST分析它们均与太平洋牡蛎的相关蛋白具有较高同源性,说明其与太平洋牡蛎亲缘关系更近。RT-PCR实验发现这3个基因在合浦珠母贝外套膜、足、生殖腺、内脏团、闭壳肌和鳃6种组织中均有表达,表明它们是非常保守的转录因子。本研究对于合浦珠母贝细胞系建立和研究具有启发意义。     

雨生红球藻铁型超氧化物酶基因的克隆与序列分析

利用已报道的FeSOD保守区域,设计简并引物,通过简并PCR的方法获得了雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)FeSOD(HpFeSOD)cDNA的部分序列,然后采用RACE方法分别克隆到5′端和3′端。拼接后得到HpFeSOD cDNA全长,该基因全长为1 138 bp,ORF为684 bp,编码227个氨基酸。把已经得到的HpFeSOD序列推导成氨基酸序列与一些已知物种的FeSOD氨基酸序列相比较,雨生红球藻FeSOD与杜氏藻、衣藻、团藻、石莼、颤藻的同源性为89%、83%、78%、70%和63%。分子系统学分析表明,雨生红球藻FeSOD与杜氏藻FeSOD聚在一起,介于真菌与高等植物之间并且真核微藻FeSOD与高等植物的同源性更高,推测其在进化上与高等植物的亲源关系更近。     

蛋白核小球藻核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶小亚基部分基因序列的克隆与分析

以单细胞绿藻蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)(藻株编号为NMBluh015-1)为实验材料,利用几种绿藻中的核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)的小亚基(rbcS)的保守序列,设计简并引物,克隆到rbcS的一条cDNA(245 bp)和3条DNA序列(其编号为CP1、CP2和CP3,长度依次为1425 bp、810 bp、705 bp)。序列比较结果表明,该蛋白核小球藻rbcS cDNA核苷酸序列与普通小球藻(C.vulgaris)、杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)(rbcS1和rbcS2)及蛋白核小球藻"太阳小球藻"株的相似性依次为93%、92%(91%)和90%,而其编码的氨基酸序列与杜氏藻相似性最高(80%);3条rbcS DNA序列与绿藻及高等植物rbcS部分序列表现了较高的同源性,其中2条DNA(CP2和CP3)部分区段同源性很高。实验结果表明扩增得到的cDNA和DNA序列为蛋白核小球藻rbcS基因。     

稀杯盔形珊瑚钙网蛋白基因的克隆及功能分析

钙网蛋白（calreticulin,CRT）是高度保守的内质网钙结合蛋白和分子伴侣,主要参与调节钙离子水平和指导蛋白质正确折叠。在这里,我们克隆稀杯盔形珊瑚（Galaxea astreata）的CRT基因,命名为Gacrt,并分析其促进细菌凝集的能力。Gacrt全长1792bp,其中5’端非翻译区(5''UTR)为77 bp,3’端非翻译区(3''UTR)为380bp,开放阅读框(ORF)1335bp,编码444个氨基酸残基,包含信号肽结构域、内质网检索信号序列（KDEL）、两条保守的钙网蛋白家族结构和一组三重复序列。通过构建原核表达系统得到CRT重组蛋白,纯化后的重组蛋白可以促进革兰氏阳性菌藤黄微球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌凝集,具有细菌凝集活性,支持GaCRT作为免疫相关分子参与机体对细菌防御的观点。