仿刺参体腔细胞原代培养以及灿烂弧菌胞外产物对其毒性的研究

采用CCM、HSM和L-15N 3种培养液对刺参(Apostichopus japonicas)的体腔细胞进行了体外原代培养,并用MTT还原法对细胞的体外存活力进行测定,结果显示:CCM和HSM培养的体腔细胞,在体外分别存活至3 d和6 d大量死亡;L-15N培养液可使细胞在1周内保持存活.用刺参病原菌灿烂弧菌的胞外产物与刺参体外培养细胞共培育,发现对体腔细胞有毒性作用,半致死蛋白质浓度(IC_(50))为27.6 μg/mL.     

刺参吐脏再生对胰蛋白酶活性影响的研究

本实验研究了吐脏及再生过程对刺参(Apostichopus japonicus Selenka)生长、消化生理及体成分的影响。实验分两个阶段,阶段一刺参被投喂通过添加鱼粉提高蛋白水平的饲料56 d,阶段二设置4个处理组,进行转食低蛋白饲料处理(转食单处理组)、吐脏处理(吐脏单处理组)、吐脏后转食低蛋白饲料处理(吐脏转食组)或不做处理(对照组),饲养100 d,并测定刺参的特定生长率(SGR)、胰蛋白酶活性和体壁蛋白含量。结果表明:(1)吐脏处理后刺参SGR呈明显的时间变化,前28 d呈现负增长,第28～42天恢复正生长,并于第56天后出现快速补偿生长,显著高于未吐脏刺参(P0.05)。(2)高蛋白饲料更有利于刺参吐脏后的再生恢复,吐脏处理对刺参整体实验阶段的SGR无显著性影响(P=0.271),但会显著提高体壁蛋白含量(P0.05)。(3)对照组刺参酶活性随时间平稳波动;转食单处理组刺参酶活在转食低蛋白饲料后前35 d始终高于对照组且呈现波动下降,并于第49天后持续低于对照组,呈现出具有规律的蛋白酶可塑性;吐脏处理组,刺参吐脏后第28天已再生出完整的新生肠道,新生肠道前期并不具有胰蛋白酶可塑性,直至再生后第70天方观察到消化酶对饲料的适应性调节。本研究结果表明:刺参吐脏再生过程能显著影响刺参的生长及消化生理,吐脏后42 d可从生长及酶活角度认为其新生肠道已具有与未吐脏肠道一样的消化能力,但吐脏后70 d方能观察到新生肠道的可塑性表现,研究结果将有助于进一步探讨刺参吐脏后肠道的修复能力,为刺参养殖提供一定的理论依据。     

海参纲动物的吐脏再生

随着现代生命科学的迅猛发展,海参表现出的极强生命现象--再生,引起了生物学家的广泛兴趣、并被作为器官再生的模型来研究.当前,在我国迅速发展的刺参养殖业中,吐脏现象给养殖者造成了很大困惑.为了搞清刺参吐脏的原因、过程及影响因子,结合对中国北方养殖刺参的吐脏再生过程研究结果、参考国内外有关文献,综述了海参再生器官的细胞起源、迁移与增殖机理,以为刺参养殖提供理论参考.     

刺参体腔液几种免疫指标的周年变化

为了调查刺参(Apostichopus japonicus)免疫机能的周年变化,初步探索刺参免疫的规律,于2006年7月至2007年6月对刺参体腔液几种免疫指标进行了周年测定.结果显示,周年内刺参体腔液内几种酶类显著变化的转折点为9月、10月,1月,2月、4月和5月.刺参体腔液几种酶类活性变化与温度和盐度等环境因素并不存在相关关系,因此推测这些显著变化并不是单一的温度、盐度等环境因素作用的结果,综合分析,其变化原因可能与刺参的夏眠、生理及繁殖等因素的作用有关.     

刺参体腔细胞的电镜制样技术研究

设计2种不同的固定方法,比较2种固定方法在刺参体腔细胞的扫描电镜制样和透射电镜制样中固定效果的优劣.选择能使体腔细胞充分分散的固定方法用于扫描电镜制样;而将能使体腔细胞凝聚成团的固定方法用于透射电镜制样.获得了令人满意的体腔细胞扫描和透射电镜照片.以多聚赖氨酸法、明胶法和聚乙烯醇缩甲醛法收集、黏附固定后的体腔细胞,实验结果显示：3种方法均可起到黏附体腔细胞的作用,通过探讨玻片黏附体腔细胞的有效方法,建立适用于海产无脊椎动物体腔细胞、血细胞、生殖细胞和原生动物、细菌等样品的扫描电镜制样方法.     

褐藻寡糖对刺参体腔液和体壁免疫相关酶活性变化的影响

研究刺参基础饲料中添加0.1%的褐藻寡糖对刺参体腔液和体壁中过氧化物酶(Peroxidase, POD)、酸性磷酸酶(Phosphatase, ACP)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AKP)和溶菌酶(Lysozyme, LSZ)活性的影响.实验周期为40 d,每隔10 d取样1次,检测刺参体腔液和体壁中免疫相关酶活性的变化.结果显示:褐藻寡糖组刺参体腔液中POD、AKP和ACP活性均呈现先增高后降低的趋势,POD在第10 d时极显著提高(P<0.01),比对照组提高306%,AKP实验期间均与对照差异显著(P<0.05),活性最高时比对照组提高298%,ACP和LSZ分别在第20和40天与对照组差异显著(P<0.05),分别比对照组提高66%和26%;褐藻寡糖组刺参体壁中POD、AKP、ACP和LSZ活性与体腔液相比提高幅度较小,POD、AKP和ACP活性分别在第20,20和30天与对照组差异显著(P<0.05),分别比对照组提高了24%、20%和35%,LSZ活性略有提高但无显著性差异(P>0.05).研究结果表明,褐藻寡糖均能提高刺参体腔液和体壁中POD、ACP、AKP和LSZ活性,显著增强了刺参非特异性免疫水平,将其应用为刺参免疫增强剂具有广阔的前景.     

干露胁迫对刺参中韩群体杂交子一代应激及免疫指标的影响

通过刺参中国群体(C)和韩国群体(K)群体间杂交和群体内自繁,获得了4个交配组合CC(C♀×C♂)、KK(K♀×K♂)、CK(C♀×K♂)和KC(K♀×C♂)的子一代。实验研究了干露胁迫对4组刺参体腔液中儿茶酚胺类激素水平和免疫指标的影响,比较了刺参中韩群体杂交和自交子一代对干露胁迫的应激反应。结果显示:受到干露胁迫的4组刺参体腔液内儿茶酚胺类激素水平都出现上升的趋势,其中KK和KC组激素水平上升幅度大于CC和CK组。4组刺参体腔液内细胞数在胁迫开始后逐渐上升,KK和KC组在胁迫结束时显著高于初始值。4组刺参体腔液细胞吞噬活性都呈"降低-升高-又下降"的趋势,但在整个实验过程中变化不显著。干露导致4组刺参体腔液内超氧化物歧化酶活性显著上升,同时,KK和KC组的过氧化氢酶活性显著上升。4组刺参体腔液内溶菌酶活性在胁迫过程中受到抑制,但变化不显著。上述结果表明,刺参中韩群体杂交和自交子一代对干露胁迫的应激程度不同,CC和CK组子一代对干露胁迫具有更好的抗性。     

刺参呼吸树的超微结构观察与研究

用光镜、扫描电镜和透射电镜观察研究健康刺参（Apostichopus japonicus）呼吸树的形态结构,并观察研究濒死刺参呼吸树的异常,结果显示：刺参呼吸树由外向内依次为体腔上皮、肌层、血腔、内皮细胞和中央腔。体腔上皮细胞游离面有长而不规则的微绒毛,细胞上部吞饮小泡丰富,细胞中常见吞噬体。内皮细胞表面有各种形状的细胞突起,细胞顶浆分泌活跃,细胞内质膜小泡丰富。体腔上皮细胞和内皮细胞中丰富的吞饮小泡和质膜小泡提示这两种细胞具有吸收功能。体腔上皮和内皮下连续成层的基膜围戍呼吸树中封闭的血腔。内皮层与内皮基膜构成呼吸树的呼吸膜,由泄殖腔进入呼吸树中央腔的海水和呼吸树血腔中的血液经此气一血屏障进行气体交换,完成呼吸作用。体腔上皮与上皮下基膜构成体腔液一血液屏障,刺参的体腔液与呼吸树血腔中的血液经此屏障进行物质交换。呼吸树还在渗透压调节和代谢产物排泄中起作用。在濒死刺参的呼吸树中,纤毛虫大量积聚在中央腔中并附着在内皮层上,导致呼吸作用不能正常进行,这可能是当养殖水体恶化时造成刺参患病并死亡的重要原因之一。     

急性高温低氧胁迫下刺参体腔液细胞miRNA表达谱的构建和靶标基因的功能分析

为了探究刺参应对极端高温、低氧环境的内在分子调控机制,促进刺参养殖产业的可持续发展.本研究以刺参体腔液细胞作为研究对象,分别构建了高温、低氧下miRNA的差异表达谱并分析了差异表达miRNAs的靶基因功能.研究表明:高温组中共发掘了20个差异表达miRNA,其中11个上调,9个下调;低氧组中共发掘了10个差异表达miR...     

温度变化对刺参免疫防御和抗氧化指标的影响

本文研究了温度变化对刺参(Apostichopusjaponicus)免疫和抗氧化指标的影响,实验设置为:对照组(CT,14℃)、慢速升温组(ST,14~20℃)和快速升温组(LT,14~26℃),取样时间为0、3、6、9、12、15、20d,分别取刺参体腔液、体壁和呼吸树测定免疫防御和抗氧化指标。结果表明:温度变化对刺参免疫防御和抗氧化指标影响显著(P0.05)。各处理组总体腔细胞数量、吞噬率以及体腔液溶菌活力在3~12d内呈峰值变化,于第9d时达到最大值,至12d分别恢复至或显著低于对照组水平。而ST和LT抗菌活力、凝集活性分别在15、12d后显著低于对照组水平。各处理组体腔液总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活性在15d内显著下降,而后维持稳定;各处理组体壁T-AOC活力、SOD活性、谷胱甘肽(GSH)含量和谷胱甘肽/氧化性谷胱甘肽(GSH/GSSG)在15d内逐渐上升,而后恢复至对照组水平;各处理组呼吸树T-AOC能力、SOD活性、GSH含量和GSH/GSSG逐渐上升,并于15d后维持稳定。由此可见,温度变化会在一定时间内引起刺参免疫应激反应,而随着温度的升高刺参免疫防御功能受到明显抑制,并且刺参不同组织应对温度变化的抗氧化响应机制不同,抗氧化水平为呼吸树体壁体腔液,随着温度的升高刺参整体抗氧化水平受到抑制。     

基于RNA-seq技术的罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)不同组织转录组比较分析

罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)是我国重要的淡水虾养殖品种,为探讨罗氏沼虾不同组织基因表达差异,本研究使用Illumina Hiseq平台分析了罗氏沼虾的7个组织(眼柄、肝脏、卵巢、鳃、心脏、肌肉、精巢)转录组,质控后获得高质量的clean reads 36325476、56796932、36328098、51370140、45010606、43240160、42404294条,共计46.2 Gb的clean reads数据。测序结果经denovo组装共获得95220个Unigenes,每个Unigenes的平均长度为1064.9bp。经过生物信息学方法与五个数据库(NR, GO, COG, KEGG, SWSS-PRO)比对,共注释到20368个Unigenes。其中GO功能注释将Unigenes分为生物过程、细胞组分和分子功能3个大类50个分支;在与COG数据库比对中,共有15798条比对到了同源序列,且一共被分为25类;KEGG代谢通路包括6大类33个小类,可将Unigenes映射到330条代谢通路中。分子标记筛选后获得37751个潜在SSR位点,共发现3228575个SNP位点。本研究通过对罗氏沼虾7个不同组织进行转录组测序,数据组装及功能注释,为进一步深入挖掘和开发利用罗氏沼虾功能基因提供参考。     

硒化物在文蛤响应镉胁迫过程中作用的转录组学分析

研究两种硒化物在文蛤富集、排出镉过程中的作用,对文蛤进行转录组测序,并进行生物信息学分析,以探讨硒化物对Cd2+代谢相关机制。硒化卡拉胶组和亚硒酸钠组共产出587 855条高质量reads。基因本体分析功能注释到15 380条unigenes, KEGG通路注释到18 866条unigenes。差异基因主要富集到肌球蛋白复合物(myosin complex)、离子通道抑制(ion channel suppression)等基因本体分析功能中。差异基因KEGG通路富集显示,在嘌呤代谢(purinemetabolism)、ECM受体相互作用(extracellularmatrix receptor interaction)、硒化合物代谢(metabolism of selenium compounds)等通路显著富集。从结果分析Cd2+可以使文蛤体内蛋白转录修饰出现异常;有机硒可以通过调控金属离子通道活性来排出细胞内的Cd2+;无机硒主要作用于文蛤细胞表面,增强其表面活性抵御Cd2+进入细胞;差异基因KEGG注释结果表明有机硒与无机硒在文蛤重金属代谢中作用机制以及途径不相同。     

军曹鱼响应低氧胁迫转录组SNP位点鉴定及其功能注释分析

为了研究低氧胁迫下军曹鱼肠道转录组中单核苷酸多态性(SNP)标记位点及SNP所在基因SNP-Unigene的作用,通过SOAPsnp软件对军曹鱼幼鱼对照组和低氧胁迫转录组测序结果进行SNP检测,并将其比对到GO、KOG、KEGG数据库进行功能注释。结果显示,军曹鱼转录组SNP位点分布在26 120条SNP-Unigene上,共检测到431 845个SNP位点,SNP平均发生频率约为1/171 bp;SNP-Unigene功能注释发现,在低氧胁迫条件下,军曹鱼SNP-Unigene主要涉及信号转导、传染病、癌症和内分泌系统等信号通路。进一步筛选到3 417条SNP-Unigene被注释到MAPK信号通路等35条与免疫相关的通路中。基于转录组差异基因分析,检测了其中7个重要免疫通路中18个免疫相关基因的SNP位点分布情况。同时,也检测了HIF-1信号通路中PIK3CA等8个差异基因的SNP位点分布情况。研究结果将为进一步挖掘免疫及低氧相关SNP的分子遗传标记奠定基础,为军曹鱼低氧适应机制的深入研究提供科学参考。     

泥蚶低氧胁迫后血细胞转录组及耐低氧相关基因的筛选与分析

泥蚶(Tegillarcagranosa)是一种比较特别的具有较强耐低氧能力的贝类,但目前其耐低氧分子调控机理尚不知。为探究泥蚶耐受低氧的分子调控机理,本研究对低氧胁迫下的泥蚶(Tegillarca granosa)血细胞转录组中富集的信号通路及生物学过程进行分析,并初步筛选分析耐低氧基因。对低氧(DO=0.5 mg/L)胁迫6、24、72、120 h的泥蚶血细胞进行转录组测序(RNA-seq)并开展生物信息学分析,筛选出差异基因集,并对胁迫72、120 h的DEGs进行GO富集分析、KEGG通路分析,采用qPCR方法检测7个DEGs的表达量并与转录组比较。结果显示从6 h开始到120 h的4个时间点的DEGs数量呈增多的趋势, GO功能分析主要富集在JUN激酶活性的负调控、蛋白质水解的负调控及免疫系统进程等主动抗凋亡、抗逆进程; KEGG通路分析主要富集在胰岛素及胰腺分泌的信号通路、HIF-1通路、钙信号相关通路和细胞凋亡相关通路。qPCR检测结果显示, 7个基因的表达上调/下调趋势与转录组测序一致,证实了转录组测序结果的可靠性。本研究推测胰腺分泌信号通路、钙信号通路及凋亡通路在泥蚶...     

黄河口与长江口近江牡蛎的比较转录组分析

为进一步开发近江牡蛎Crassostreaariakensis的基因资源,探究黄河口与长江口近江牡蛎的遗传差异,采用Illumina HiSeq 4000测序平台对东营垦利和南通海门的近江牡蛎进行高通量转录组测序。对测序数据进行拼接后分别得到83680条和71269条unigene,并对unigene进行了基因功能注释和正选择基因的富集分析。结果表明,同源基因经筛选得到正选择基因259个,GO (Gene Ontology)功能分析中共涉及到967个相关功能类别,其中有关到生物学过程的分类条目占比最多,为590项。总体上看,与细胞器、代谢过程、结合以及催化活性相关的类别占主导地位。KEGG( Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析表明,共涉及48个代谢通路,其中与核糖体、细胞凋亡相关的通路占比最大。上述结果不仅加深了对黄河口以及长江口近江牡蛎基因表达水平差异的认识,同时也为今后进行近江牡蛎各类遗传学分析和一些关键基因的克隆以及具体功能分析提供了基础数据。     

基于转录组测序技术的海月水母足囊生殖分子机制研究

足囊生殖是海月水母(Aurelia coerulea)抵御恶劣环境的一种无性生殖方式,对维持和扩增海月水母种群具有重要作用,目前对海月水母足囊产生的分子机制尚不清楚。本研究首次构建了海月水母产囊和非产囊螅状体转录组的表达谱,并结合生物信息学比较分析,探究驱动足囊生殖的分子机制。转录组测序共检测到44 873个基因,筛选过滤后共发现200个差异表达基因,其中95个基因在产囊螅状体中显著上调,105个显著下调。本研究挖掘出了卵黄蛋白原(基因VTG-1和VTG-2)和角蛋白(基因Hornerin)等调控海月水母足囊营养储备及几丁质形成的潜在功能基因。此外,GO和KEGG分析结果显示ErbB信号通路、Hedgehog信号通路等参与细胞分裂和分化的生物学过程在产囊螅状体中显著下调,基底膜组织、运动正调节等参与细胞迁移的的生物学过程在产囊螅状体中显著富集,表明这些生物学过程在足囊形成过程中发挥着重要作用。综上,本研究为海月水母螅状体在恶劣环境下的适应机制研究提供了理论依据。     

无鱼粉日粮条件下黄颡鱼生长性能和肝胰脏转录组差异表达的研究

本研究以黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)为试验对象,设计两种饲料:鱼粉组和无鱼粉组,在池塘网箱中投喂70 d,研究其生长性能和肝胰脏转录组表达的差异。同鱼粉组相比,无鱼粉组黄颡鱼特定生长率下降了30.25%(P0.05),饲料系数显著增加了83.94%(P0.05),全鱼脂肪含量显著下降(P0.05),血清甘油三酯含量显著下降(P0.05),血清转氨酶活力显著增加(P0.05)。肝胰脏转录组结果显示,总计有12 020个基因差异表达,其中差异表达上调的基因有5 020个、差异表达下调的基因有7 000个。同鱼粉组相比,无鱼粉组分别有1 013个基因表达显著上调、2749基因表达显著下调(P0.05)。将组间具有差异表达的基因进行GO Term、KEGG pathway分类,结果显示:无鱼粉组的肝胰脏细胞组成、细胞生物过程、细胞分子功能等绝大多数基因差异表达下调,提示肝胰脏的细胞组织结构和功能受到很大的影响;KEGG通路富集到15个显著差异代谢通路。本研究结果表明,日粮中鱼粉可能含有某些生理活性物质,这些物质以神经分泌、激素调控、代谢信号通路等为作用靶点,通过对这些代谢信号通路的调节,对鱼的整体生理代谢强度、细胞结构与功能、生理健康状态等产生明显积极促进影响。缺乏这些物质则会造成黄颡鱼生长性能下降、部分器官组织细胞(肝细胞、神经轴突)受到损伤、鱼体抗应激能力和免疫防御能力下降。     

瘤背石磺体腔细胞分类、免疫相关酶特性及初步转录组学分析

瘤背石磺(Onchidium struma)广泛分布于潮间带和潮下带,是海洋生物向陆地生物辐射进化的重要代表,也是环境监测的指示生物.为丰富瘤背石磺的基础免疫学资料,本文研究了瘤背石磺体腔细胞的类别、细胞密度和体腔液免疫相关酶活性,并通过RNA-Seq测序获得体腔细胞转录本,进行生物信息学分析.结果表明,瘤背石磺主要有...     

凡纳滨对虾大量EST的生物信息学分析

凡纳滨对虾是我国乃至世界最重要的对虾养殖种。EST(expressed sequence tags)测序是对没有基因组背景的生物进行功能基因分析最为有效的方法之一。为了研究凡纳滨对虾重要功能基因、以及为筛选分子标记奠定基础,本文集成了一套快速高效的EST信息深度挖掘的方法,并对公共数据库中161 241条凡纳滨对虾EST序列进行分析,获得了20 410 条unigenes,包括14 236条contigs和6 174条singlets。通过与NR数据库比对发现有注释的基因7 984条,并对其余12 426条未知基因中的4 702条进行了功能域注释。对有NR注释的基因的GO 分类分析获得其中2 715条基因的生物学过程、细胞定位和分子功能分类信息。此外,通过与模式生物通路图进行比对和定位,将3738条基因定位到270个KEGG通路图中,发现凡纳滨对虾的9条unigenes与果蝇丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的5个关键基因对应,提示凡纳滨对虾很可能存在类似的重要信号转导通路。另外,通过对6种组织,包括肝胰腺、淋巴器官、血细胞、鳃、眼柄和神经的EST进行比较分析,筛选获得了组织特异性转录本共7 000余条,并对这些特异性转录本进行了功能分类。本研究不仅开发了公共基因资源发掘的方法,也为对虾功能基因的研究利用提供了重要参考数据。