溶藻弧菌体外刺激泥蚶(Tegillarca granosa)血细胞后早期转录组研究

泥蚶(Tegillarca granosa)是我国传统养殖贝类,细菌性疾病导致的死亡已成为制约泥蚶养殖业发展的重要因素,血细胞是泥蚶免疫防御的执行者,血细胞能直接吞噬异物,能通过包囊作用将异物包裹,血细胞还在炎症反应和伤口修复中发挥作用。采用RNA-seq测序技术研究了溶藻弧菌体外刺激后泥蚶血细胞3h和6h时转录组动态变化,与未受刺激血细胞相比,3h时1790个基因表达发生显著改变,包括1319个上调基因和471个下调基因;6h时3183个基因表达发生显著改变,包括2629个上调基因和554个下调基因。KEGG通路富集分析发现溶藻弧菌刺激后免疫相关多个信号通路或生物学过程发生显著改变,如吞噬体、细胞凋亡、蛋白酶体、内质网加工、局部黏附等。部分免疫相关基因表达丰度3h时变化不显著而6h时发生显著改变,部分免疫相关基因3h和6h时表达丰度均显著改变。研究结果为泥蚶血细胞早期免疫反应提供了新的见解,为泥蚶抗病机理研究提供了理论基础。     

哈维氏弧菌浸泡感染下泥蚶(Tegillarca granosa)不同组织弧菌载量的变化规律分析

为明确哈维氏弧菌感染下,泥蚶（Tegillarca granosa）不同组织弧菌载量的变化规律,通过哈维氏弧菌浸泡感染泥蚶的方法,建立弧菌浓度计数标准曲线,记录攻毒水体和泥蚶组织中的哈维氏弧菌含量的动态变化及相关关系。结果显示,弧菌感染浓度为1×10⁷CFU/mL,泥蚶血液中弧菌载量显著高于鳃、闭壳肌、外套膜和肝胰腺,各组织中的弧菌载量呈现先上升,后下降,最后维持较低水平的变化规律。持续感染6 d,泥蚶血液中弧菌载量降至10²-10⁴ CFU/mL,其他组织中弧菌载量降至10⁰-10² CFU/mg。检测不同浓度弧菌（1×10⁵,1×10⁶,1×10⁷,5×10⁷ CFU/mL）浸泡感染后泥蚶肝胰腺的弧菌载量变化,结果显示,1 d时各感染组肝胰腺弧菌载量均较对照组显著增加（81.0-667.8倍）,且与浸泡水体中弧菌浓度呈显著正相关（Spearman''s ρ=0.762,P<0.001）,5 d时各侵染组肝胰腺弧菌载量均较1 d明显降低,但仍然高于对照组。研究结果为泥蚶感染弧菌发病过程中,免疫识别及免疫响应机制的研究提供了参考。     

泥蚶凝集素的抑菌作用和免疫学研究

分别从泥蚶血淋巴液和肌肉中提取出凝集素,采用全血微量培养法进行淋巴细胞转化和抑菌实验。结果表明:两种凝集素都具有促进小鼠淋巴细胞转化的免疫调节功能;两种凝集素对供试的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),甘薯薯瘟病原细菌(Fasarium oxyssporam),大肠杆菌(Escherichia coli),普通变形杆菌(Proteas valgaris),八叠球菌(Sarcina lutea)5种细菌和啤酒酵母(Saccharomyces carlsbergensis),玉米大斑病菌(Helminthos porium turcicum),稻瘟病菌(Piricularia oryzae)3种真菌都有不同程度的抑制作用,且对真菌的抑制作用大于对细菌的抑制作用;由二者分别制备的抗血清通过免疫双扩散法并不能与对方发生交叉沉淀反应,说明它们不具有同源性。     

苯并芘B[a]P对泥蚶组织EROD、GST酶活力和MDA含量的影响

采用实验生态学的方法,通过染毒和清除,研究了不同浓度(0.05、0.5、5和10 μg/L)苯并芘B[a]P胁迫15d和释放15d后,泥蚶(Tegillarca granosa)消化盲囊和鳃丝乙氧基异吩唑脱乙基酶(EROD)、谷胱甘肽转移酶(GST)活力和脂质过氧化物(MDA)含量的变化。结果表明: 在胁迫阶段0.5、5 和10μg/L,B[a]P处理组对泥蚶消化盲囊和鳃丝EROD、GST 酶活力和MDA含量显著影响(P＜0.05), EROD、GST 酶活力分别被诱导和抑制,第5d趋于稳定, MDA含量随时间呈上升趋势, 在第10d基本达到峰值并趋于稳定。在清除阶段, EROD活力和MDA含量逐渐下降, GST活力逐渐升高, 并在5～10d恢复到对照组水平。本研究中, EROD和GST活力的变化能够反映机体解毒代谢的能力, MDA含量的变化反映了机体氧化损伤的程度,表现出了一定的剂量和时间效应。     

水温和余氯对泥蚶胚胎发育的毒性效应

为了研究三门湾海域温排水污染对水生动物发育的影响,本实验通过室内模拟三门湾核电站温排水的余氯残留和温升效应,研究了不同温度和不同游离余氯质量浓度耦合下对泥蚶(Tegillarca granosa)胚胎发育的影响.实验水温为29℃、32℃和35℃,游离余氯质量浓度为0.025、0.050、0.100、0.200、0.40...     

泥蚶快速生长季生化代谢物的变化特征

研究了象山港泥蚶(Tegillarca granosa)快速生长季(2020年5—11月)糖原、游离氨基酸和脂肪酸等代谢物的组成、含量及其变化,并对其营养特征变化进行了分析。结果显示,7—9月为泥蚶快速生长期,此期前后泥蚶生长缓慢。泥蚶肌肉糖原含量约5.6~11.1mg/g;牛磺酸、丙氨酸、谷氨酸和天冬氨酸是其主要的游离氨基酸;不饱和脂肪酸含量丰富,且主要为多不饱和脂肪酸。生长过程中几种生化代谢物含量变化显著:5—7月间,糖原含量显著降低、氨基酸和脂肪酸组成发生显著变化。7—9月间,糖原含量、生糖和呈味氨基酸含量显著升高、饱和及单不饱和脂肪酸含量显著降低,但脂肪酸组成结构无显著差异。11月,氨基酸及多不饱和脂肪酸含量均显著升高。11月泥蚶具有高的营养品质。本研究为泥蚶养殖管理及水产品营养研究提供参考。     

24个泥蚶EST-SSR标记的开发与分析

利用3000条泥蚶(Tegillarca granosa)单拷贝序列,筛选到132条含有SSR候选位点序列,成功设计引物50条。群体多态性检测结果显示,24个SSR位点为多态性,各位点的等位基因介于2~5个,平均等位基因数3.5个;观测杂合度Ho、期望杂合度He、多态信息含量PIC范围分别为0.000~0.591、0.045~0.727、0.043~0.696;多态位点中有11个高度多态、4个中度多态、9个低度多态;进行哈迪-温伯格平衡检测后,用Bonferroni correction法进行校正,结果有17个位点显著偏离平衡。     

可口革囊星虫与其栖息地底泥中的重金属含量及相关性分析

用原子吸收光谱法(AAS)和原子荧光光度法(AFS)测定了采集于北海银滩镇、厦门海门岛、宁德漳湾镇、乐清西门岛、温岭坞根镇、三门花桥镇等地区自然滩涂以及温岭坞根镇养殖区的可口革囊星虫(Phascolosoma esculentas)及其栖息地的底泥样品中Zn、Cu、Mn、Fe、Cd、Pb、Hg 和As 等8 种重金属含量, 并对检测结果进行了含量特征、生物体与栖息地底泥中重金属含量相关性分析、生物体重金属富集系数分析。结果表明: 不同栖息地可口革囊星虫间的重金属含量差异性显著(P<0.05), 各群体中Pb 含量均超过标准, 厦门海门岛群体中Cd 含量超标; 厦门海门岛、乐清西门岛自然滩涂栖息地和温岭坞根镇养殖区等底泥中重金属含量相对较高, 所有采样点底泥中Cu 含量以及乐清西门岛自然滩涂底泥中Cd 含量达到沉积物质量标准Ⅱ类; 可口革囊星虫对Zn、Cu、Fe 的富集系数均小于1, 对Mn、Cd、Pb、Hg 和As 的富集系数均大于1。Zn、Cu、Fe、Pb 和As 的富集系数在大部分群体间差异性较小; 可口革囊星虫中的Fe 和As 含量与底泥中的Fe 和As 含量高度正相关, Zn 和Hg 含量的相关性次之, 其余重金属元素含量的相关性较差。     

泥蚶初级卵母细胞发育及卵黄发生的超微结构研究

利用透射电镜技术观察了泥蚶(Tegillarca granosa)初级卵母细胞发育期间各细胞器的特征及卵黄粒的形成过程.结果显示:泥蚶初级卵母细胞的发育过程可以分为卵黄合成前期、卵黄合成期及卵黄合成后期三个时期.在卵黄发生过程中,线粒体、高尔基体、粗面内质网、微吞饮泡等都参与了卵黄粒的形成,且线粒体和粗面内质网是形成卵黄粒的主要胞器.卵黄发生的原料以外源性合成为主,外源性营养物质主要来自消化腺.     

海黍子和脆江蓠对重金属锌、镉富集的比较研究

采用室内培养实验方法,研究了褐藻海黍子(Sargassum muticum)和红藻脆江蓠(Gracilaria chouae)在不同质量浓度的锌和镉溶液里15 d,藻体的生长和体内金属离子含量的变化。结果表明:两种藻的生长速率与暴露溶液金属质量浓度呈负相关,藻体内积累金属离子的量和溶液的金属质量浓度呈正相关,藻体内金属离子的含量均在培养3 d后显著增加,且随着培养时间的延长而持续增加。海黍子和脆江蓠对重金属Zn~(2+)的富集能力明显高于对Cd~(2+)的富集能力,在相同条件下,海黍子对重金属Zn~(2+),Cd~(2+)的积累量明显高于脆江蓠。以上研究结果对利用藻类修复重金属污染的海洋水体能起到一定的指导和参考作用。     

基于微卫星的泥蚶5个地理群体遗传多样性分析

为了研究泥蚶不同地理群体的系统发育关系和遗传多样性,运用微卫星DNA标记,对浙江温州(ZJ)、山东日照(SD)、韩国釜山(KR)、广西企沙(GX)、海南海口(HN)等5个泥蚶地理群体进行了17个基因位点的遗传多样性分析。结果显示,从17对引物中共检测出115个等位基因,每个位点等位基因数(Na)2~12个。有效等位基因数(Ne)为1.192~7.849,平均观测杂合度(Ho)为0.430~0.516,平均期望杂合度(He)为0.573~0.656,5个群体的平均多态信息含量(PIC)为0.525~0.608。Hardy-Weinberg平衡检验表明,51.2%的微卫星位点偏离平衡状态(P0.05)。5个群体间的种群遗传分化系数(FST)为0.012~0.062,呈现出较低的遗传分化。UPMGA聚类分析表明,浙江群体和韩国群体首先聚在一起,亲缘关系最近,然后与海南群体聚合;广西群体和山东群体亲缘关系较近,聚为一支,然后与上面三个群体聚合。     

泥蚶人工选育群体的微卫星分析

采用微卫星分子标记技术对人工选育的泥蚶(Tegillarca granosa)群体进行遗传多样性分析。结果表明:在12个标记位点中,每个位点的等位基因数为2~9个,观测杂合度平均范围0.4195~0.4725,期望杂合度平均范围为0.5700~0.6323。哈迪-温伯格平衡检验结果显示,在48个群体-位点组合中有32个群体-位点组合显著偏离平衡。Shannon遗传多样性指数为1.0608~1.2242。群体间的遗传分化系数Fst值从0.0347~0.4549,平均值0.1930;基因流Nm值为0.2996~6.9617,平均值2.3367;群体近交系数Fis范围0.0052~0.7135,平均值0.2468。结果表明,连续的人工选育过程,群体的遗传多样性仍然比较高,但选育过程对群体的遗传多样性和遗传分化有一定程度的影响。     

泥蚶血红蛋白异源四聚体酶解多肽抗菌活性及其机理研究

采用凝胶层析技术从泥蚶血细胞裂解物中纯化得到两种血红蛋白Tg-HbⅡ(异源四聚体)和TgHbⅠ(同源二聚体),回收率分别为48.15%和24.91%。胰蛋白酶酶解Tg-HbⅡ,酶解液经反相C-18色谱柱分离纯化得7种血红蛋白源多肽F1~F7。通过琼脂扩散法检测酶解多肽抑菌活性,结果发现7种多肽对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、恶臭假单胞菌、枯草芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌均无抑菌作用,但多肽F2~F7对副溶血弧菌、溶藻弧菌和哈维氏弧菌具有明显抗菌活性,且多肽F2~F7对副溶血弧菌、溶藻弧菌和哈维氏弧菌的MIC值在0.012~0.200mg/mL范围内。荧光显微镜观察酶解多肽杀菌效果发现多肽杀菌迅速,5min内弧菌细胞几乎全部死亡。利用透射电子显微镜观察正常的和经抗菌肽处理后的溶藻弧菌和哈维氏弧菌细胞的超微结构,结果显示,对照组正常细胞内部结构完整,而经抗菌肽处理过的细胞其细胞壁完整,但因缺乏细胞内容物支持导致局部区域内陷,细胞质膜明显收缩,细胞内物质外流形成许多空泡从而导致细胞死亡。研究结果表明血红蛋白源抗菌肽对泥蚶致病菌弧菌有明显的抗菌活性,其通过破坏细胞内部结构而起到杀菌作用,这些发现为血红蛋白抗菌机制的研究奠定了基础。     

泥蚶HDAC1基因cDNA全长、内含子克隆及时空表达特征分析

HDAC1作为HDACs家族中重要成员,可使组蛋白去乙酰化进而调节基因表达,在细胞分化和胚胎早期发育中起重要作用。本文利用SMART RACE技术克隆得到泥蚶HDAC1(Tg-HDAC1)基因的cDNA全长序列,并对其内含子进行扩增及不同组织、不同发育时期的定量表达。结果发现:Tg-HDAC1基因的cDNA序列全长为2275 bp,开放阅读框(ORF)1587 bp,编码528个氨基酸;Tg-HDAC1蛋白序列与斑马鱼、鸡、小鼠等的相似性都在80%以上,表明该蛋白氨基酸序列在物种进化过程中具有保守性;在Tg-HDAC1基因中扩增出13个内含子,均存在于开放阅读框中,且都遵循GT-AG原则;荧光定量PCR(qRT-PCR)分析结果显示,Tg-HDAC1基因在成体血液、内脏团、外套膜、鳃、斧足和闭壳肌6个组织中均有表达,而在足中的表达量最高,且与其余5组织中的表达量有极显著差异(P<0.01),说明它对该组织生长具有重要作用。不同发育时期的表达差异结果表明,Tg-HDAC1基因在担轮幼虫期表达量最高,显著高于其他发育时期(P<0.05)。     

泥蚶低氧胁迫后血细胞转录组及耐低氧相关基因的筛选与分析

泥蚶(Tegillarcagranosa)是一种比较特别的具有较强耐低氧能力的贝类,但目前其耐低氧分子调控机理尚不知。为探究泥蚶耐受低氧的分子调控机理,本研究对低氧胁迫下的泥蚶(Tegillarca granosa)血细胞转录组中富集的信号通路及生物学过程进行分析,并初步筛选分析耐低氧基因。对低氧(DO=0.5 mg/L)胁迫6、24、72、120 h的泥蚶血细胞进行转录组测序(RNA-seq)并开展生物信息学分析,筛选出差异基因集,并对胁迫72、120 h的DEGs进行GO富集分析、KEGG通路分析,采用qPCR方法检测7个DEGs的表达量并与转录组比较。结果显示从6 h开始到120 h的4个时间点的DEGs数量呈增多的趋势, GO功能分析主要富集在JUN激酶活性的负调控、蛋白质水解的负调控及免疫系统进程等主动抗凋亡、抗逆进程; KEGG通路分析主要富集在胰岛素及胰腺分泌的信号通路、HIF-1通路、钙信号相关通路和细胞凋亡相关通路。qPCR检测结果显示, 7个基因的表达上调/下调趋势与转录组测序一致,证实了转录组测序结果的可靠性。本研究推测胰腺分泌信号通路、钙信号通路及凋亡通路在泥蚶...