半滑舌鳎骨形态发生蛋白2基因的克隆、表达分析及启动子活性分析

骨形态发生蛋白2（BMP2）在脊椎动物的骨形成、尤其是诱导成骨方面具有至关重要的作用。本研究克隆了半滑舌鳎（Cynoglossussemilaevis）BMP2基因的cDNA序列,分析其在半滑舌鳎成鱼的组织表达差异及其在早期发育阶段的定位和表达变化趋势,并检测了其启动子活性。研究结果表明,半滑舌鳎BMP2基因cDNA全长为2048bp,编码422个氨基酸。BMP2mRNA在半滑舌鳎成鱼的14个组织中具有广泛的分布,并在脊髓中表达量最高。此外,BMP2基因在早期胚胎发育阶段（原肠期）具有极高水平的表达,其表达量约为其他发育阶段表达量的10倍。整体原位杂交检测结果表明,BMP2mRNA在1日龄仔鱼主要在冠状幼鳍、心和肝表达,在脊索有微量表达;随后,3日龄仔鱼的BMP2mRNA主要表达于脊索。通过对BMP2基因5''上游调控区片段进行启动子活性分析,发现了-179～+109片段可能包含启动子活性增强原件,生物信息学预测该片段包含的锌指转录因子等可能参与了BMP2的转录调控。     

半滑舌鳎雌鱼基因组Fosmid文库构建及分析

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是我国的大型经济鱼类,其养殖发展迅速。有关半滑舌鳎的基因组文库构建和分析等方面的研究,目前尚未见报道。用流式细胞仪检测雌性半滑舌鳎基因组大小。从半滑舌鳎雌鱼肌肉提取基因组DNA,选取大小合适的DNA片段,经末端修复并回收后,再以Fosmid作为载体,构建半滑舌鳎雌鱼基因组文库。经检测,雌性半滑舌鳎基因组大小约为606.36 Mb。所构建的Fosmid文库含有49 920个克隆,重组率为96.88%;插入片段长度分布在33~45 kb之间,平均为39.2 kb;覆盖雌性半滑舌鳎基因组3.12倍;从文库中筛选得到单拷贝DNA序列的概率为95.6%。对培养第1天和第6天的克隆进行比较,结果表明文库稳定性高,培养过程中没有发生变化。     

雄性半滑舌鳎雄激素受体基因的克隆与表达分析

利用RT-PCR方法从半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)中克隆了雄激素受体(Androgen receptor,AR)基因cDNA的部分序列(434 bp),经BLAST比对与狼鲈(Dicentrarchus labrax)、花溪(Kryptolebias marmoratus)、三斑海猪鱼(Halichoeres trimaculatus)和三刺鱼(Gasterosteus aculeatus)的雄激素受体同源性分别为84%,82%,82%和81%.组织表达分析表明,AR基因在半滑舌鳎的性腺、肝、胃、脾、肾、头肾、肠、鳃、心、脑和肌肉这11种组织中均有表达,表达量有所差异.肾中表达量最丰富,鳃中最少.根据其他硬骨鱼类表达模式,推测半滑舌鳎可能只含有1种AR.     

半滑舌鳎促黄体激素受体基因片段的克隆及组织表达分析

采用巢式RT-PCR法克隆了半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis促黄体激素受体(Luteinizing Hormonene Receptor, LHR)基因部分序列,经过BLAST比对,认为该序列与庸鲽、牙鲆、黑鲷、尼罗罗非鱼、青鳉和红鳍东方鲀的LHR基因同源性分别为97%,94%,85%,83%,82%和80%.该基因片段长度为614 bp,编码204个氨基酸,含有典型的跨膜螺旋结构区域(TM helix),属于糖蛋白激素受体(GHR)家族.组织表达分析表明,LHR基因在半滑舌鳎的卵巢、精巢、肝脏、胃、肠、鳃、心、脾、肾、头肾和脑中均有表达,表达量有所不同,以脾和肾中表达量最丰富.     

半滑舌鳎的一种细胞凋亡抑制因子的克隆、鉴定与分析

克隆半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的1种细胞凋亡抑制因子survivin基因,并对其序列及表达模式进行分析.结果表明,该基因cDNA 序列全长704 bp(GenBank登录号为EU499314),包括86 bp5'非翻译区,444 bp开放阅读框以及含 poly(A)信号的174 bp的3'非翻译区,编码147个氨基酸.氨基酸序列同源性分析表明,半滑舌鳎survivin氨基酸序列与斑马鱼、非洲爪蟾、鸡、小鼠和人survivin氨基酸序列的同源性分别达到了63.3%,49.0%,43.7%,43.6%和41.5%.RT-PCR分析表明,survivin基因在半滑舌鳎成体雌鱼卵巢中大量表达,在雌鱼的肾脏中微量表达,在其它雌鱼的组织中无表达,在雄性的任何组织中均无表达.该基因在受精卵、多细胞和囊胚3个胚胎发育的早期阶段,大量表达,而随着胚胎发育的进程,survivin基因的表达逐渐减少,在孵化前尾芽期胚胎中只有微量表达,在孵化后5 d的仔鱼中,几乎检测不到survivin基因的表达.表明该基因可能参与卵子形成和胚胎的早期发育.     

半滑舌鳎性别决定和性别控制育种研究进展与展望

半滑舌鳎是中国重要的经济鱼类,有较高的经济价值。该物种雌雄个体差异巨大,其性别控制育种具有重大现实意义。同时,半滑舌鳎拥有ZW型性染色体,其性腺分化较容易受到温度等环境因素的影响,因此是研究鱼类性染色体进化、性别决定和性别分化的良好模型。近年来,随着细胞工程育种技术的发展、半滑舌鳎性别特有分子标记的开发、基因组的测序完成、全基因组关联分析技术和基因编辑技术的应用等,在半滑舌鳎性别决定相关基因的鉴定、表观遗传效应分析、性别控制育种等诸方面取得很多突破,半滑舌鳎性别决定和性腺分化的遗传基础和环境效应被逐步揭示。本文就相关研究领域的研究进展,结合本研究团队的工作积累进行总结,以期为半滑舌鳎性别决定及性别控制育种相关研究提供方向和目标性思考。     

半滑舌鳎稚鱼脂肪分解关键酶基因的克隆及饲料中脂肪水平对其表达的调控

克隆了半滑舌鳎脂肪分解关键酶基因即激素敏感脂肪酶(Hormone-sensitive lipase,HSL)和脂肪甘油三酯脂肪酶(Adipose triglyceride lipase,ATGL)cDNA部分序列,并探讨了饲料中脂肪水平对半滑舌鳎稚鱼HSL及ATGL基因表达的影响。克隆所得到的HSL和ATGL片段长度分别为589bp和581bp,序列和系统进化分析表明半滑舌鳎的HSL和ATGL与大部分鱼类具有较高的同源性。采用不同水平的鱼油配制成5种不同脂肪水平(6.68%、9.84%、13.47%、17.89%和21.88%干物质)的等氮饲料,饲养35日龄半滑舌鳎稚鱼30d,养殖过程中每天饱食投喂5次,养殖实验结束后采用实时荧光定量PCR分别测定各处理稚鱼内脏团的HSL及ATGL mRNA相对表达量。结果表明,高脂饲料组(21.88%)显著促进了半滑舌鳎稚鱼内脏团HSL基因的表达(P0.05),但饲料脂肪水平对于半滑舌鳎稚鱼内脏团的ATGL表达量未产生显著影响(P0.05)。     

10 个半滑舌鳎家系 MHC IIB 基因多态性初步研究

为检测10个半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)家系MHCⅡB(Cyse-DAB)基因的多态性水平、MHCⅡ类B位点数目以及平衡选择的作用,作者利用多聚酶链式反应(PCR)和直接测序的方法对10个半滑舌鳎家系MHCⅡB基因位点遗传变异和平衡选择进行了研究。用特异性引物和PCR扩增的半滑舌鳎MHCⅡB基因片段大约397 bp,包含一部分第一外显子,全部第一内含子和全部第二外显子。10个半滑舌鳎家系中,每家系选取5个体,每个体5个克隆序列分析发现60个不同序列,代表60个等位基因,其中有28个是新发现的,已提交到Gen Bank。同源分析表明60个等位基因相似性为89.36%。共50个个体中,有6个存在5个不同等位基因,表明在半滑舌鳎至少存在3个座位。有9个家系的MHCⅡB序列多肽结合区(PBR)的非同义替换(dN)显著高于同义替换(dS)。     

程序化设计的简并引物克隆半滑舌鳎CYP17基因

采用1种新的简并引物设计方法--CODEHOP法来克隆半滑舌鳎CYP17基因.该法结合NCBI、Blastp、BlockMaker、CODEHOP等生物信息学资源和DNAMAN、Oligo6.0等生物软件,程序性设计半滑舌鳎CYP17基因的CODEHOP引物,从半滑舌鳎卵巢组织中成功克隆了CYP17基因,该基因片段与其它物种的CYP17家族具有较高的同源性,经鉴定,该基因属于整个脊椎动物的CYP17基因群,尤其是鱼类亚群.实验结果表明,程序性设计的简并引物较传统简并引物特异性更高,假阳性率少,更有利于实验成功.     

半滑舌鳎雌性特异fosmid克隆的筛选及FISH定位

通过对半滑舌鳎雌鱼fosmid文库进行有序混合,成功构建了两步-三维PCR筛选体系,为后续的基因筛选奠定了基础。通过对半滑舌鳎W染色体文库序列进行引物设计,并分别在雌、雄鱼基因组DNA中筛选,获得1对雌鱼特异性引物。使用该引物对fosmid文库进行筛选,得到1个雌鱼特异性克隆,并通过荧光原位杂交技术将克隆定位到了W性染色体上,证实了使用该体系进行文库筛选的有效性以及雌鱼引物的特异性,建立了半滑舌鳎遗传性别的分子及细胞遗传学鉴定方法,为后续半滑舌鳎基因组及性染色体的研究奠定了基础。     

性类固醇激素及其受体在半滑舌鳎性腺分化发育过程中的表达与生理功能

首次用17β-雌二醇(E_2)及其受体(ERα)、睾酮受体(AR)的多克隆抗体在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevisG(u|¨)nther)性腺分化发育过程中进行免疫细胞化学定位研究。结果表明:在半滑舌鳎原始性腺中已有E_2、ERα和AR的分布和表达;卵原细胞、初级卵母细胞、精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞对E_2及ERα、AR抗体均呈现不同程度的阳性反应,在精细胞和精子中对E_2和ERα呈免疫阴性反应,而AR则一直保持较强表达,揭示了半滑舌鳎性腺中类固醇激素可能通过旁分泌调控机制刺激卵子和精子发育和成熟。性类固醇激素及其受体免疫阳性物定位在生殖细胞的胞质、胞膜和核膜等广泛部位并有表达,在性腺分化和不同发育时期的表达强度有所不同,表明其在性腺分化发育过程各阶段所起生理功能不同。这些结果为证明性类固醇激素及受体参与调节半滑舌鳎性腺分化发育提供了重要形态学新证据。     

温度和盐度对半滑舌鳎幼鱼消化酶活性的影响

以半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)幼鱼为实验对象,分别设置3个盐度水平(22、26和30)和4个温度水平(18,21,24和27 ℃),采用酶活性分析的方法比较研究了在不同温度和盐度的养殖环境下,半滑舌鳎肝胰脏和肠道内不同部位蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶3种消化酶活性的差异.结果表明,盐度和温度对半滑舌鳎消化酶活性影响均显著 (P<0.05).不同温度和盐度组合下,3种消化酶活性变化有所差异.总体比较,肝胰脏和肠道内3种消化酶比活力均以盐度26、温度21和24 ℃组合下活性较高.在相同温度和盐度下,肝胰脏和肠道的不同部位的3种消化酶活性有所差异,其中,蛋白酶比活力以肝胰脏和后肠最高,显著高于前肠和中肠(P<0.05);淀粉酶比活力以肝胰脏内最高,各肠段之间淀粉酶比活力差异不显著(P>0.05);淀粉酶比活力也以肝胰脏内最高,其次分别为前肠、后肠和中肠,各部位脂肪酶比活力差异显著(P>0.05).本研究发现半滑舌鳎幼鱼体内淀粉酶比活力相对比较高,说明半滑舌鳎幼鱼对淀粉具有较强的消化能力,建议在配制半滑舌鳎幼鱼饲料时可适当提高淀粉比例,以降低饲料成本.     

大头鳕和半滑舌鳎RAPD分析条件的优化

大头鳕和半滑舌鳎是我国重要的两种经济鱼类,本论文以大头鳕和半滑舌鳎基因组DNA为模板,对RAPD分析中的DNA模板浓度进行了优化,确定最适浓度。并分别筛选出20条和18条扩增结果稳定性好、多态性强的随机引物用于大头鳕以及半滑舌鳎的RAPD遗传变异分析。     

促激素及其受体在雄性半滑舌鳎脑垂体和精巢中的定位

应用兔抗血清对抗鱼类和哺乳类促激素及其受体的多克隆抗体对雄性半滑舌鳎脑垂体和精巢进行了免疫组织化学定位.其结果显示GnRHR、LHR和GtH免疫活性定位在不同发育时期的腺垂体和精巢中.GtH免疫阳性细胞的数量和免疫强度随着精巢发育成熟而明显增强.同时还发现睾酮（T）和雄激素受体（AR）在半滑舌鳎精巢中的定位有别于其他鱼类,尤其是雄激素受体（AR）免疫活性在精原细胞中的数量很少.依据这个特点文中还讨论了其可能与精巢发育的关系,同时证明了半滑舌鳎精巢发育像其他硬骨鱼类一样受激素的调控.     

半滑舌鳎和塞内加尔鳎养殖群体遗传变异的RAPD分析

采用RAPD方法对半滑舌鳎和塞内加尔鳎的养殖群体进行遗传变异分析。从78条随机引物中筛选出20条用于群体遗传学分析,2个群体共扩增出260条DNA片段,其中半滑舌鳎187条,塞内加尔鳎180条,片段大小为200-2 000 bp。半滑舌鳎和塞内加尔鳎养殖群体的多态片段比例分别为63.10%和60.56%,Nei的多样性指数和Shannon的信息指数分别为0.266 4和0.237 5,0.385 2和0.349 8。与其它鲆鲽鱼类养殖群体相比,半滑舌鳎和塞内加尔鳎养殖群体的遗传多样性水平略低;2种鱼群体间的遗传相似性系数和遗传距离分别为0.458 3和0.723 1,它们的遗传变异主要来自群体内。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)GnRHR基因全长cDNA 的克隆与组织表达分析

采用同源克隆和末端快速扩增(RACE)方法, 克隆了半滑舌鳎中 GnRHR 全长 cDNA。通过基因全长以及推断的氨基酸序列分析, 得知该序列包含一个 7tm-1 保守结构域, 为 G 蛋白偶联受体家族成员。利用 PHYLIP 3.5c 邻位相连法以及 DNAstar 中的 CLUSTAL W 方法对相应的氨基酸序列进行了聚类分析和序列相似度分析。结果表明, 半滑舌鳎 GnRHR 鳉 与鲈鱼、琥珀鱼、虹鳟以及青 等鱼类中的 GnRHR聚为一支, 亲缘关系较近, 且相似度较高, 分别为 90.1%、 89.7%、 79.0%以及 78.3%, 而与高等哺乳动物人、小鼠相似性仅分别为 18.8%和 16.2%, 亲缘关系较远。应用半定量 RT-PCR 技术分析其组织表达, 发现 GnRHR 广泛表达于各个组织, 但表达量差异较大, 在性腺、脑和肾中表达量较高, 其它组织较弱。     

适宜浓度的维生素E促进半滑舌鳎生长激素基因的表达

本实验旨在探究维生素E对半滑舌鳎垂体组织中生长激素基因表达的影响。作者在每千克等氮等能的基础饲料中分别添加0、400和1 600mg的DL-α-生育酚乙酸酯(维生素E)投喂半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)成鱼(464±2.6) g,进行为期8周的养殖实验;另外,在L-15培养基中添加0、18和54μmol/L的维生素E,对半滑舌鳎成鱼(464±2.6) g的垂体细胞进行为期3 d的体外原代培养实验。分别取垂体组织和原代细胞,通过荧光实时定量PCR分析其gh mRNA的相对表达量。实验结果表明:垂体组织中gh mRNA的相对表达量随着饲料中维生素E含量的增加而呈现先升高后下降的变化趋势,在400 mg/kg组时显著高于其他各组(P0.05);随着细胞培养液中维生素E浓度的升高, gh mRNA的相对表达量显著增加(P0.05)。由此可见,适宜浓度的维生素E能够促进半滑舌鳎垂体组织中生长激素基因的表达。     

半滑舌鳎精子发生的组织学研究

本文应用组织学方法对半滑舌鳎雄鱼精巢结构和精子发生过程进行了详细地研究．观察结果表明,它的精巢结构特点是随着精巢的发育可见它的精巢外面有一条管状贮精囊与输出管相连,在精巢发育成熟过程中,贮精囊中逐渐充满精子,这个特点有助于了解半滑舌鳎的受精生物学的复杂性．另外,从半滑舌鳎精子发生过程分析,它的精巢属于小叶型,精巢发育分为6期．精子发生经历精原细胞、精母细胞、精子细胞及精子．最后,文中还讨论了半滑舌鳎精巢中非生殖细胞（间质细胞和Sertoli细胞）的分布及其可能的生理作用．     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)生长激素体外重组表达及活性分析

根据半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)生长激素(GH)基因的c DNA全长序列设计引物克隆得到其全长552个碱基成熟肽序列。利用RT-PCR方法将扩增片段克隆到原核表达载体p ET-28a上,实现了GH成熟肽在大肠杆菌BL21(DE3)中的融合表达。融合蛋白分子量为26 k Da,在IPTG诱导4h时目的蛋白表达量最高,占细菌总蛋白的41.5%,主要以包涵体形式存在。Western-blotting分析表明GH融合蛋白可特异性地被6×His抗体识别。诱导表达后的菌液沉淀经纯化和复性后,获得大小为26 k Da的纯化GH融合蛋白。以ELISA方法检测纯化后的GH融合蛋白显示其具有免疫学活性。本研究为认识半滑舌鳎生长轴的调控机制提供了基础资料。     

半滑舌鳎仔稚鱼消化酶活性的变化

对半滑舌鳎不同发育阶段主要消化酶（酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶）以及与消化吸收相关的碱性磷酸酶的活性变化进行了测定。结果表明，半滑舌鳎在仔鱼发育早期即可检出酸性蛋白酶和碱性蛋白酶的活力，碱性蛋白酶的2个极低值分别出现在仔鱼开口期和仔稚鱼的转交期，从孵化后23d左右胃腺出现时，酸性蛋白酶的活性开始明显升高。早期仔鱼体内表现出较强的淀粉酶活性，孵化后12d其活性急剧下降，并一直保持较低的比活力状态。脂肪酶的活性在半滑舌鳎早期仔鱼体内一直较低，进入稚鱼期后开始缓慢上升。碱性磷酸酶活性在变态结束后出现大幅度的升高，这标志着肠组织结构和肠道消化功能的完善。