高效非损伤性扇贝DN A提取方法的建立及效果评价

本研究建立了一种高效、经济的非损伤性扇贝DNA提取方法,在不影响扇贝个体生存状态的前提下,采用擦拭法和室温裂解相结合的方式在20 min内即可获得个体基因组DNA。以虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)、栉孔扇贝(Chlamys farreri)和海湾扇贝(Argopecten irradians)为实验对象,研究了不同擦拭材料(棉签、滤纸)和不同擦拭部位(外套膜、鳃丝、内脏团)的核酸提取效果,评估了本方法在贝类基因分型领域应用的可行性。研究表明,用棉签、滤纸2种材料擦拭扇贝的鳃丝、内脏团或外套膜组织均能获得主带清晰完整的基因组DNA,且不影响扇贝的存活状态。在3种扇贝中采用棉签擦拭法的DNA得率均高于滤纸法,以这2种方式获得的DNA为模板进行SSR和SNP标记分析,能获得均一稳定的扩增条带,SSR标记分型结果准确可靠。本研究建立了简便、快速进行扇贝基因型分析的非损伤性DNA提取方法,为贝类全基因组选育和珍稀贝类资源的种质保护开发提供了新的技术手段。     

双壳贝类CK1基因家族的鉴定及表达分析

酪蛋白激酶1 (CK1)是一种重要的蛋白激酶家族,其在DNA损伤应答和修复、细胞增殖和凋亡、胚胎发育和稳态等重要的生物学过程中都具有复杂多样的调控作用。为了理解CK1基因家族在双壳贝类中的特征、进化及生物学功能,实验采用比较基因组学及生物信息学的方法对双壳贝类CK1基因家族进行了鉴定分析,通过虾夷扇贝高温应激实验,研究了CK1基因家族在高温应激时的表达规律。结果显示,在虾夷扇贝、栉孔扇贝、长牡蛎与侏儒蛤中均存在CK1α,CK1αlike,CK1δ,CK1γ3,并发现CK1ε,CK1γ1,CK1γ2在双壳贝类中发生了丢失。时空表达分析发现,双壳贝类CK1基因均在胚胎发育早期集中表达,并以多细胞/囊胚期为界呈现出母源/合子特异性表达模式。CK1为关键基因的基因共表达模块显著富集在错配修复、核苷酸剪切修复等相关通路上,暗示了CK1基因在双壳贝类胚胎发育过程中参与调控DNA损伤修复过程,从而维持早期胚胎发育时的基因组稳定性。双壳贝类CK1基因在成体中呈现组织特异的表达模式,主要在鳃和雄性性腺中具有相对较高的表达量。虾夷扇贝受到高温应激后,其鳃中PyCK1α, PyCK1αlike和PyCK1δ...     

企鹅珍珠贝非致死性DNA提取方法的研究

在企鹅珍珠贝遗传育种研究中,为保证在贝类存活的条件下获得其DNA信息,采用企鹅珍珠贝(Pteria penguin)贝壳边缘和足丝研究非致死性DNA提取方法。不同于贝壳获取过程中会对实验贝体产生一定损伤,足丝是无生命的细胞外纤维束,其获取方法简单且属于非损伤性取样,对实验贝几乎无伤害,是潜在的获取具足丝贝类基因组DNA的优良材料。本研究采用脱钙与未脱钙两种处理方式,并结合海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒法及有机溶剂萃取法(OSE)提取贝壳及足丝DNA,对获得的贝壳DNA及足丝DNA进行PCR扩增。结果显示,足丝有机溶剂法(OSE法)提取效率显著高于贝壳DNA提取方法,脱钙足丝与未脱钙足丝的DNA提取效率无显著差异,分别为(0.016 7±0.002 9)μg/mg和(0.016 1±0.003 1)μg/mg。未脱钙足丝的OSE法获得的DNA产物纯度最优, A260/280值为1.400 0±0.040 0,A260/230值显著高于贝壳DNA及足丝DNA的其他提取方法,为0.910 0±0.080 0。除脱钙贝壳OSE法外,其他所有DNA提取方法均可用于后续PCR扩增,测序结果表明...     

6种海洋双壳类贝壳中碳酸钙、碳酸镁含量的测定

为了了解海洋双壳类的固碳能力,以紫脲酸铵-萘酚绿B、铬黑T为指示剂,采用络合滴定法对泥蚶(Tegillarca granosa)、四角蛤蜊(Mactra veneriformis)、文蛤(Meretrix meretrix)、缢蛏(Sinonovacula constricta)、虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)和紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)等6种海产双壳贝类贝壳中的碳酸钙含量、碳酸钙和碳酸镁总量进行了测定。6种贝类贝壳中的碳酸钙含量占干重比例介于93.99%~97.35%之间,其中虾夷扇贝的含量最多,紫贻贝的含量最少;碳酸镁含量介于0.61%~1.79%之间,其中紫贻贝的含量最多,虾夷扇贝的含量最少。目前的结果表明,六种贝类均具有较好的固碳能力,基于碳酸钙和碳酸镁总量估算,6种贝类单位湿重固碳力介于0.023 2~0.074之间。     

应用MSAP技术研究扇贝全基因组DNA甲基化水平

DNA甲基化作为真核生物基因组重要的表观遗传学修饰,对生物体基因的表达有重要的调控作用。为获得扇贝基因组DNA甲基化修饰水平及模式等表观遗传学信息,以栉孔扇贝(Chlamys farreri)、海湾扇贝(Argopecten irradians)、虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis)以及本课题组培育的"海大金贝"为材料,建立了甲基化敏感扩增多态性方法(Methylation-sensitive amplified polymorphism,MSAP)的反应体系,利用该方法对其基因组DNA CCGG区域的甲基化水平进行分析。结果表明,本研究筛选得到的引物组合可用于贝类DNA甲基化的研究,在栉孔扇贝、海湾扇贝、普通虾夷扇贝和"海大金贝"的甲基化比例分别为32.08%、25.99%、32.88%和34.97%。几种扇贝基因组CCGG序列中,胞嘧啶的全甲基化率要高于半甲基化率,推测扇贝基因组中主要的甲基化模式是CpG型。通过对"海大金贝"和普通虾夷扇贝闭壳肌甲基化谱进行比较,筛查得到46个差异位点,这些位点可能参与"海大金贝"闭壳肌积累类胡萝卜素的调控。     

玻璃质壳类底栖有孔虫卷转虫属Ammonia spp.的DNA保存方式和提取效能比较研究

对有孔虫的DNA进行有效保存及提取是开展有孔虫分子鉴定工作的前提。本研究以探索适合玻璃质壳类底栖有孔虫的DNA保存及提取方法为目的,以中国近海优势属——玻璃质类底栖有孔虫卷转虫属(Ammonia spp.)为模式生物,考察不同温度(20—120°C,间隔10°C)烘干、冷冻(–20°C、–80°C,有水、无水)以及脱氧胆酸钠裂解液(Na deoxycholate,简称DOC)处理(含和不含EDTA)保存有孔虫DNA方法,同时进行了DOC裂解液法和Guanidine裂解液法对Ammonia spp.DNA提取效能的比较。结果显示,烘干保存法中20°C组和30°C组显著优于40°C组(P0.05);冷冻保存法中无水组显著优于有水组(P0.05);DOC裂解液保存法各组间无显著差异(P0.05)。三种保存方法综合效果表现为冷冻组显著优于烘干组和裂解液组(P0.05);两种DNA提取方法的提取效果都很好,但DOC法更廉价且操作简便。本文给出了一套适用于玻璃质壳类有孔虫的DNA保存和提取的优化方案。     

壳寡糖钙、镁配合物对栉孔扇贝体内镉的脱除

如何减少鲜活贝类中重金属污染一直是水产品加工中亟待解决的问题。本文采用氧化水解法制备水溶性壳寡糖(COS),将其与钙、镁结合制备了壳寡糖钙(COS-Ca)、壳寡糖镁(COS-Mg)配合物,研究其对栉孔扇贝体内镉的脱除作用。结果发现,COS-Ca、COS-Mg对栉孔扇贝体内镉均有一定脱除作用,经COS-Ca、COS-Mg处理净化,3 d内栉孔扇贝体内镉含量分别降低了46%和41.8%,并且经净化处理后,栉孔扇贝体内金属钙、铁的含量有所提高。因此,所制备的COS-Ca、COS-Mg有望成为1种新型多功能性的脱除鲜活贝类体内重金属的饲料添加剂。     

流式细胞术比较研究4种双壳贝类血细胞的分群

应用流式细胞术对太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)、海湾扇贝(Argopecten irradians)、虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)和毛蚶(Scapharca subcrenata)4种双壳贝类的血细胞分类进行了比较。根据其血细胞的前向角散射光(FSC)和侧向角散射光(SSC)特性的不同将血细胞分群,FSC和SSC二维图分析发现太平洋牡蛎、海湾扇贝和虾夷扇贝的血细胞都可分为3个亚群,即透明细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞,而毛蚶的血细胞只可区分为透明细胞和颗粒细胞2个亚群。同时还对这4种双壳贝类各种血细胞所占比例进行了比较研究,发现各亚群细胞所占比例差异很大。     

纤毛虫单细胞基因组DNA微量提取方法的比较及优化

在纤毛虫的分子生物学研究中,单细胞基因组DNA的微量提取是后续基因分析的关键。本研究以海洋纤毛虫红色伪角毛虫为材料,采用直接取完整虫体、裂解法以及3种改良后的试剂盒微量提取DNA方法,分别提取了新鲜样品与4种不同方法保存样品的基因组DNA,比较了9种组合在PCR产物质量、提取所需时间、成本及便捷性方面的优劣,并进一步比较、讨论和探索了4种样品保存方法和5种DNA微量提取方法在纤毛虫单细胞基因组PCR扩增中的可行性。本工作旨在为后续的纤毛虫分子生物学研究提供可资借鉴的技术路线和方法。     

一种电转染华贵栉孔扇贝基因编辑的应用方法

目前,CRISPR/Cas9基因编辑技术已成为动植物遗传育种领域研究的热点。为解决CRISPR技术在贝类生产实践中应用难的问题,本文探究了一种电转染的双壳贝类基因编辑方法。利用本方法分别对华贵栉孔扇贝受精卵的SRB-like-3和MSTN进行编辑,并成功地将编辑后的幼虫培养到稚贝。在编辑后5 d和10 d的D-型幼虫及40 d的稚贝中都检测到了荧光,并且编辑MSTN后的10 d幼虫,其壳长显著大于编辑SRB-like-3组和对照组。本研究表明：电转染基因编辑技术在贝类中具有可行性。本方法具有成本低、操作简单、易推广等优点,可以广泛应用于贝类的遗传育种领域。     

海洋沉积物中微生物基因组DNA提取方法的比较研究

沉积物成分复杂,腐殖酸等物质含量较高,这些杂质在DNA提取过程中不易除去,可能会对后续的PCR扩增等产生抑制作用。因此,高质量DNA的获得是海洋微生物分子生态学研究的基础和前提。本研究采用6种不同的方法,分别提取同一来源海洋沉积物样品中的微生物基因组DNA。对DNA纯度、得率、16SrRNA基因拷贝数和微生物群落特征等多方面进行比较,结果表明:方法1(QIAamp DNA Stool Mini Kit)、方法2(PowerSoil~DNA Isolation Kit)和方法3(RNA PowerSoil~DNA Elution Accessory Kit)得到的DNA产量较低,纯度却较高,可以直接用于后续分子生物学分析;与方法2相比,方法3得到的细菌16SrRNA基因拷贝数和单位质量DNA中可扩增细菌16SrRNA基因模板量较低;方法4(SDS高盐法)得到的DNA虽然产量高,但杂质含量也高,抑制了后续PCR反应的进行;方法5(方法4得到的DNA经QIAamp DNA Stool Mini Kit纯化)和方法6(方法4得到的DNA经PowerSoil~DNA Isolation Kit纯化),虽然纯度有所提高,但DNA大量损失,且耗时长,花费高。另外,方法2在提取过程中可以最大程度裂解菌体细胞壁,能更好反映微生物群落特征。综合以上结果,方法2(PowerSoil~DNA Isolation Kit)提取海洋沉积物微生物基因组DNA效果最佳。本研究可为海洋微生物分子生态学研究提供一种有效的技术手段。     

双壳贝类血淋巴中儿茶酚胺的检测方法初步研究

研究的目的是探索一种检测双壳贝类血淋巴中儿茶酚胺含量的方法。以栉孔扇贝(Chlamysfarreri)和长牡蛎(Crassostreagigas)为实验对象,研究了取样、抗氧化剂、氧化铝用量以及Tris缓冲液用量等对实验结果的影响。结果表明,高效液相色谱电化学检测器法(HPLC-ECD)可以灵敏高效地对双壳贝类血淋巴中儿茶酚胺进行定性、定量检测。实验表明,取样时间最长不超过1.5min;还原性谷胱甘肽作抗氧化剂效果较好;前处理各试剂与血样量的最适配比为血样量1.5mL,Tris缓冲液(1.5mol/L,pH8.6)1mL和氧化铝25mg;水洗后离心并尽可能吸干氧化铝中的水分。去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺的回收率分别为53%~69%、47%~73%和48%~56%。     

几种海洋微藻基因组DNA的分离提取及PCR检测

用改良CTAB法分别提取6种海洋微藻的基因组DNA,发现提取的DNA纯度、产率高(>100μg.g-1鲜重),DNA完整性好。以6种海洋微藻的基因组DNA为模板,并以5'TTCGAGCCAG3'(OPC-01)为随机引物,对PCR反应条件进行研究。结果表明,25μl反应体系中,Mg2 、Taq DNA聚合酶、引物、模板DNA和dNTP 5种主要成分的适宜浓度或用量分别是:2.0mmol.L-1、1.6U、20pmol.L-1、50ng和2.5mmol.L-1。扩增程序优化为:94℃预变性5min,94℃变性1min,36℃退火1min,72℃延伸2min,循环45次,最后于72℃再延伸10min。酶切实验结果表明,6种海洋微藻的基因组DNA都能被EcoRⅠ酶切,酶切图谱呈弥散状,满足分子水平操作的要求,可直接应用于进一步的分子生物学实验。     

双壳纲八种贝类的核DNA定量分析及其与进化地位关系的初步探讨

运用流式细胞仪测定了双壳纲8种贝类的细胞核DNA含量。结果显示,测定贝类的DNA含量分别为(pg):太平洋牡蛎,2.06±0.03;东方海笋,2.11±0.07;近江牡蛎,2.18±0.13;结蚶,2.59±0.10;青蚶,3.08±0.23;砂海螂,3.24±0.28;缢蛏,3.85±0.10;日本镜蛤,5.00±0.20。双因素方差分析表明,同种贝类个体间DNA含量的差异不显著(p>0.05),仅占总差异的0.12%;而种间差异极为显著(p<0.01),比例高达97.45%。本实验所测8种贝类的DNA含量与其进化地位间未呈现出明显的相关性。     

海水双壳贝类的生物沉积及其生态效应

在沿岸自然环境 ,双壳贝类经常达到很高的丰度 ,在生态系统的物质循环和能量流动中起着重要作用。双壳贝类作为滤食性动物具有很强的滤水能力 ,如扇贝、贻贝、蛤和牡蛎的滤水率均可达到５Ｌ／（ｇ·ｈ） ;它们能够过滤大量细小的颗粒物质 ,包括浮游物、浮游藻类、微生物、贝类幼虫和中型浮游动物等 ,还包括来源于双壳贝类以及其它动物 (如鱼 )粪粒的碎屑 ［１，２］。双壳贝类通过过滤大量的水体摄取浮游植物和有机颗粒 ,同化一部分有机质 ,其它则以粪的形式排出 ,进而影响生态系统的结构和功能。对于养殖生态系 ,目前的研究还比较少 ,但已…     

栉孔扇贝高多态基因筛查及其表达特征分析

双壳贝类经历了几亿年的进化过程,在复杂多变的海洋环境中展现出了非凡的环境适应能力,而基因组的高多态性被认为与其环境适应性有关。本研究利用栉孔扇贝基因组重测序数据、早期发育及成体转录组数据分析了基因的多态性与表达特征。在栉孔扇贝基因组中共鉴定到了1 186个高多态基因,这些基因在染色体上呈现非均匀分布,并且在胚胎发育时期和成体组织中呈现出独特的表达特征。功能富集分析显示这些多态基因可能为扇贝胚胎发育的可塑性和成体的环境适应性提供了分子基础。研究还发现2个多拷贝基因——mucin和C1qDC具有显著的高多态性,可能在免疫系统防御和清除病原的过程中发挥了重要作用。本研究对高多态基因的表达特征和多态性进行了联合分析,为解析扇贝适应性进化的分子机制提供了线索。     

两种扇贝杂交和自交家系早期生长及甲基化的比较分析

运用杂交和自交方法建立虾夷扇贝♂(A)×栉孔扇贝♀(B)、栉孔扇贝♀(B)×栉孔扇贝♂(C)、栉孔扇贝♂(C)×栉孔扇贝♀(D)3 种组合家系, 每个组合3 个平行, 共9 个家系。对各家系卵径大小、胚胎孵化率、幼虫浮游阶段壳长生长速度等生物学参数进行比较, 建立了幼虫浮游期壳长与日龄的线性回归方程; 运用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)分析了基因组DNA 胞嘧啶甲基化水平, SPSS 分析了DNA 甲基化与壳长生长的相关性。结果表明, 杂交家系的卵径大小、胚胎孵化率与自交组没有显著差异, 但壳长生长速度显著高于自交组, 这种优势可能主要来自于父本的影响; 家系AB、BC、CD 的平均DNA甲基化率分别为18.672%、22.661%和22.303%, 杂交使后代DNA 甲基化水平降低, 生长速度与DNA甲基化水平相关系数为?0.934, 相关水平极显著(P<0.01), DNA 甲基化与杂种优势具有一定的关系。     

中国扇贝科的研究 Ⅲ.栉孔扇贝亚科(薄齿扇贝属)

薄齿扇贝属(Bractechlamys)是栉孔扇贝亚科(Chlamydinae)中的一个暖水性属。其主要特征是贝壳较小、近圆形,壳两侧不等,左壳平,右壳凸。两耳不等,前耳大,后耳小。贝壳表面宽放射肋上具有数条圆形细肋,肋上有各种生长小鳞片。放射肋及生长鳞片细致、规则。壳色鲜艳美丽。以足丝营附着生活,栖息在潮间带和潮下带浅海底的岩石或珊瑚礁上。这一属在我国的种类不多,Kuroda(1941)和波部忠重(1977)曾报道台湾省有两种,其中方薄齿扇贝(Bractechlamys quadrilirata Lischke)我们在广东省的海南岛也有发现。此外,作者又发现1个新种(秀丽薄齿扇贝B.elegans sp.nov.)和1个新记录(彩薄齿     

几种海水贝类甲醛浸渍标本DNA的提取及rRNA基因ITS序列的扩增

从中国科学院海洋生物标本馆收藏的8种甲醛浸渍的海水贝类标本中提取DNA并对其rRNA编码基因的ITS序列进行特异性扩增,在牡蛎Crassostrea sp．、长肋日月贝Amussium pleurondectes (Linnaeus)、扇贝Volachlamys ringaporinug(Sowerby)与华贵栉孔扇贝Chlamys nobilis(Reeve)等4个物种的标本中成功获得扩增产物。利用图片分析软什得出牡蛎标本的ITS-1和ITS-2扩增片段分别为408bp和524bp,长肋日月贝标本分别521bp和537bp,而扇贝Volachlamys ringaporinug(Sowerby)与华贵栉孔扇贝标本只获得ITS-1扩增片段,长度均为545bp。     

不同养殖海域栉孔扇贝(Chlamys farreri)混合家系的通径分析

为了深入认识栉孔扇贝(Chlamys farreri)壳尺寸性状和体重之间的关系,达到通过直观可见形状判断非直观性状,在栉孔扇贝苗种培育中指导种贝挑选工作的目的,本实验将600余只扇贝分别于三个不同纬度养殖环境(山东青岛、山东荣成和辽宁大连)下养殖一年后测量其性状数据,包括壳长、壳高、壳宽、体重,进行壳尺寸性状对体重性状的通径分析。偏回归系数统计表明,除大连海域壳长对体重的偏回归系数为0.266,差异不显著(P0.05)外,其它参数对体重均极显著(P0.01),表明大多数自变量和因变量之间都有极显著的共线性关系。对各个海域建立以壳尺寸为自变量,体重为因变量的回归方程,得出通径系数、各性状间的相关性指数以及各参数对体重的决定系数,计算出了不同养殖地点的栉孔扇贝壳尺寸性状和体重之间关系的回归方程。通径分析显示,对青岛海域栉孔扇贝体重直接作用最大的是壳高,对荣成海域栉孔扇贝体重直接作用最大的是壳长,而对大连海域栉孔扇贝体重直接作用最大的是壳宽。因此,以体重为目标挑选青岛海域的种贝时,应以壳高为优先选择指标;挑选荣成海域的种贝时,优先选择壳长;挑选大连海域的种贝时,优先选择壳宽。不同养殖海域栉孔扇贝的通径分析为栉孔扇贝亲贝的挑选提供了理论支持。