真鲷精子的超低温保存研究

对真鲷精子超低温保存技术进行了初步探讨，在液氮中保存真鲷（Pagrosomus major)精子时发生冷冻伤害的温域为－30－60℃，适宜的降温速率为20℃／min；使用抗冻剂DMSO的适宜浓度为20％；采用低盐度或高pH值的溶液激活冻精的效果不如自然海水。真鲷冻精的复苏率和存活率最高可达到50．73％和62．5％；以20℃/min和20％DMSO处理真鲷精子，保存在液氮中46d徨冻精复苏率和存活率为50．63％和61．02％。     

鱼类精液超低温冷冻保存的研究展望

精液的超低温冷冻保存是从上世纪50年代开始的，此项技术发展至今已取得很大成就。国外学者的工作主要集中在冷水性鲑鳟鱼类及某些海水鱼上，而国内以研究四大家鱼及其他淡水鱼类精液的超低温保存居多，只有少数学者研究如真鲷、黑鲷、花鲈、大弹涂鱼等海水鱼类精液的超低温保存。本文就开展鱼类精液冷冻保存研究的意义、鱼类精子超低温保存的基本生物学原理，及有关鱼类精液冷冻保存的研究现状等作一综合评述。     

扇贝精液超低温冷冻保存技术的研究

于１９９７年３月￣１９９７年５月,取山东长岛和青岛太平角海区的虾夷扇贝和栉孔扇贝,采用自然排放法和解剖法取精液,用自然海水作基础溶液,采用不同的抗并保护剂、冷冻速度、平衡时间,对精子的存活率、受精率和孵 进行了研究。结果表明,两种扇贝的精子以自然海水为基础溶液,加８￣１０％的ＤＭＳＯ作为抗冻保护剂,距液氮表面２５ｃｍ、２０ｃｍ、１０ｃｍ各停留８ｍｉｎ,移入液氮中保存;解冻时,距液氮表面１０ｃｍ、１     

黑鲷精子的超低温保存研究

对黑鲷精子的超低温保存技术进行了初步探讨，黑鲷（Sparus macrocephalus)精子经过超低温保存后复苏率，存活率最高可以达到61．37％和61．4％，保存黑鲷精子时发生冷冻伤害的温度范围是－21－－60℃，适宜的降温速率为20度／min；使用抗冻剂DMSO的适宜浓度为20％，样品体积对保存效果有相关性；利用自然海水激活冻精效果好于低盐度或高pH值的溶液；使用20％DMSO和20℃/min降温速率处理，在液氮中保存黑鲷精子66d后解冻，其复苏率和存活率分别为59．81％和58．45％。     

日本蟳精子结构及环境因子对精子存活率的影响

以光镜和电镜观察了日本蟳精子的形态结构,对雄体贮精囊和雌体纳精囊中的精子结构进行了比较,并研究了pH,盐度对日本蟳精子存活率的影响规律,结果表明:日本蟳精子为非鞭毛型,主要由顶体、核杯、膜复合体和辐射臂等组成,其中顶体呈球形或近球形,可分成头帽、顶体管和顶体囊三部分。核杯包裹整个顶体外围,染色质呈细丝状或颗粒状。辐射臂向精子四周发出,内含核质,没有运动能力。雄体贮精囊中的精子包裹在椭球形精荚中,而雌体纳精囊中的精子呈弥散状,精子顶体管中有囊泡状结构、中心体位置前移、胞质透明区扩大,而且有些精子已崩解。精巢表面pH为6.5±0.2,精液pH为7.0±0.2,精子密度平均为(3.47×109±0.42×109)个/cm3。精子的适宜pH为7～9,最适pH为8;适宜盐度为20～30,最适盐度为25。     

日本蟳精子结构及环境因子对精子存活率的影响

以光镜和电镜观察了日本蟳精子的形态结构,对雄体贮精囊和雌体纳精囊中的精子结构进行了比较,并研究了pH,盐度对日本蟳精子存活率的影响规律,结果表明:日本蟳精子为非鞭毛型,主要由顶体、核杯、膜复合体和辐射臂等组成,其中顶体呈球形或近球形,可分成头帽、顶体管和顶体囊三部分。核杯包裹整个顶体外围,染色质呈细丝状或颗粒状。辐射臂向精子四周发出,内含核质,没有运动能力。雄体贮精囊中的精子包裹在椭球形精荚中,而雌体纳精囊中的精子呈弥散状,精子顶体管中有囊泡状结构、中心体位置前移、胞质透明区扩大,而且有些精子已崩解。精巢表面pH为6.5±0.2,精液pH为7.0±0.2,精子密度平均为(3.47×10⁹±0.42×10⁹)个/cm³。精子的适宜pH为7~9,最适pH为8;适宜盐度为20~30,最适盐度为25。     

中国对虾精子超低温保存的研究

于1991年11月-1993年5月对中国对虾纳精囊中精子进行超低温保存研究。结果表明，以自然海水或人工海水作基础液添加10％DMSO（V／V）及5％－10％的甘油配制成抗冻稀释液，稀释中国对虾精子进行超低温保存最有效，存活率在60％以上；保存94-138d，解冻后作人工授精，受精率最高达59％；稀释液中Mg2+，K+，Ca2+为超低温保存所必需，但Ca2+浓度过高则不利于精子的保存。光镜及电镜观察表明。冷冻对中国对虾精子的损伤主要表现为“棘突”的折断，严重时须体脱落仅剩精核；冻伤的精子不发生正常项体反应，不形成项体丝。     

日本蟳的性腺发育和生殖周期

对日本蟳(Charybdis japonica)的性腺发育、生殖周期、繁殖习性和性比等进行了研究。根据其性腺的组织学和外部形态特征,将卵巢发育分为6个发育期:形成期、小生长期、大生长期、成熟期、排放期和恢复期;将精巢发育分为5个发育期:形成期、生长期、成熟期、排放期和恢复期。根据成熟系数的周年变化规律并结合性腺组织切片的观察结果,认为在连云港海区的日本蟳性腺发育为1年1个周期,繁殖期为5～9月,交配产卵盛期在5月中旬～6月下旬(水温17.5～23.5℃)。日本蟳为分批产卵类型,但第二批卵的数量远少于第一批卵。雌、雄性腺发育基本同步,雄性发育略快,雌雄比约为1∶1。     

3种对虾精子超低温冷冻保存技术研究

作者以日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)、中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)和南美白对虾(Penaeus vannamei)作为实验材料,研究3种稀释液(天然海水,人工无钙海水,Hank’s平衡盐溶液)、3种抗冻剂(二甲基亚砜、丙二醇和丙三醇)、3种稀释比例(5%、10%和15%)、3种不同的降温程序对3种对虾精子超低温冷冻保存效果的影响。冻精解冻后通过台盼蓝染色的方法计算其存活率。结果显示,对于3种对虾,以天然海水作为稀释液,10%PG作为抗冻剂,4℃平衡20 min,以–2℃/min降温至–40℃,–40℃平衡10℃,以–15℃/min降温至–150℃,然后投入液氮作为降温程序进行超低温冷冻保存效果最好,冻精解冻后存活率分别为75.33%±2.56%、69.00%±3.00%和23.33%±8.55%。     

日本蟳人工育苗及养殖技术研究

日本虫寻［Ｃｈａｒｙｂｄｉｓ（ｃｈａｒｙｂｄｉｓ）ｊａｐｏｎｉｃａ］是一种肉质丰满、嫩而鲜美 ,经济价值高的大型海产蟹类 ,遍布我国沿海 ,历来为我国的主要捕捞对象之一。日本虫寻属近岸种类 ,移动性小 ,生长快 ,且繁殖期长 ,可多次产卵 ,亲蟹容易获得 ,适合养殖和放流增殖。在目前养虾业受到严重挫折的情况下 ,日本虫寻的养殖越来越受到重视。但因对其资源的过度捕捞 ,自然苗种的生产很不稳定 ,规格也大小不一。因此进行日本虫寻人工育苗及养殖技术的研究 ,对促进水产养殖业的多样化和高效化具有重要意义。阎愚等１９８９年和１９９…     

美洲黑石斑精子超低温保存研究

作者采用2 mL 的冷存管和程序降温仪高效超低温保存美洲黑石斑(Centropristis striata L.)精子.分析比较了4种不同浓度抗冻剂15%DMSO(二甲基亚砜)、15%EG(乙二醇)、15%PG(丙二醇)和10%Meth(甲醇),5种降温速率(10,15,20,25,30℃/min)和5种解冻温度(30,35,40,45,50℃)对美洲黑石斑精子超低温保存效果的影响.实验结果表明,采用 Hanks’作为稀释液,15% DMSO、15% EG、15% PG 作为抗冻剂,30℃/min 的降温速率对精液进行超低温保存35℃水浴解冻,冻精激活后获得理想的运动率(>60%).通过对抗冻剂、降温速率、解冻温度的筛选,作者建立了美洲黑石斑精液高效超低温保存的方法,并对冻精进行长期保存.美洲黑石斑精子超低温保存方法的建立对于海水鱼类精子库的建立以及种质资源的保存和生物多样性的保护具有重要意义.     

点带石斑鱼精子超低温冷冻保存研究

为建立点带石斑鱼(Epinephelus malabaricus)精子冷冻保存技术,保存点带石斑鱼种质资源,作者通过选用TS-19、TS-2、Hank’s、MPRS、Cortland、0.75%NaCl等作为稀释液及10%~25%二甲亚砜、甘油、甲醇作为抗冻液,对繁殖季节中3个不同时期的点带石斑鱼精液进行超低温冷冻保存研究。研究结果表明:(1)Hank’s溶液为点带石斑鱼精子冷冻保存最适冷冻稀释液;(2)Hank’s溶液与10%~15%DMSO溶液为点带石斑鱼精子保存的最适冷冻保护液组合,可以获得60%以上的冻精成活率,而使用不同浓度的MeOH作为抗冻液时,冻精成活率均为0%;(3)以10%~25%Gly作为抗冻液时,冷冻前未加天然海水时均能激活点带石斑鱼精子正常运动,其效果与天然海水相似,加入天然海水后精子运动效果急剧下降,精子冷冻保存后也存在同样现象;(4)为保证获得更高的冻精成活率,点带石斑鱼精液冷冻保存样品的最佳获取时期是在亲鱼自然繁殖期前进行为宜。     

中国对虾精子超温保存的研究

于１９９１年１１月－１９９３年５月对中国对虾纳精囊中精子进行超低温保存研究。结果表明，以自然海水或人工海水作基础液添加１０％ＤＭＳＯ（Ｖ／Ｖ）及５％－１０％的甘油配制成抗冻稀释液，稀释中国对虾精子进行超低温保存最有效，存尖率在６０％以上；保存９４－１３８ｄ，解冻后作人工授精，受精率最高达５９％；稀释液中Ｍｇ＾２＋，Ｋ＾＋，Ｃａ＾２＋为超低温保存所必需，但Ｃａ＾２＋浓度过高则不利于精子的保存。光镜及     

点带石斑鱼的精子活力及超低温冷冻前后精子超微结构的比较

研究了盐度、pH对点带石斑鱼(Epinephelus malabaricus)精子活力的影响;同时对超低温冷冻前后点带石斑鱼精子的超微结构进行了比较观察。研究结果表明:(1)该鱼精子活力的适宜盐度范围为15-35,盐度为15时,精子寿命最长为26 min;最适pH值范围为6.5-8.0,当pH值为7.5时,精子的寿命最长为4 min;(2)超低温冷冻保存前,正常的点带石斑鱼精子由头部、中段和尾部3部分组成,精子头部呈球圆形或近圆形,直径约1.8 m;中段不明显,可见线粒体;鞭毛细长,约15 m,尾部主要结构是轴丝,为典型"9+2"微管结构;(3)超低温冷冻保存后,点带石斑鱼精子的形态结构损伤明显,主要表现为质膜褶皱、破裂,细胞质外漏,线粒体膨胀破损,脱落和鞭毛断裂等特征。     

日本蟳繁殖生物学的初步研究Ⅱ.雄性繁殖习性及胚胎发育

根据精巢形态、切片组织学观察及扫描电镜观察,可将日本蟳的精巢发育划分三期:未发育、发育期与成熟期.通过扫描电镜观察可知,它的精子为无鞭毛精子,呈圆球形,大小为30μm.并运用实地调查、解剖、分析样本及光镜观察等手段,对其性腺形状、交配行为及胚胎发育等作了初步的描述.     

日本蟳线粒体16SrRNA和COI基因序列比较分析

对采自莱州湾和胶州湾的日本蟳野生群体的线粒体16S rRNA和COI基因片段进行了PCR扩增和测序,分别得到长度为519和658 bp的碱基序列.研究结果显示这2个基因片段在种内的变异都较低,对2个基因同源序列分析表明,在线粒体16SrRNA基因片段中共检测到7个变异位点(包括6个单一变异位点,1个简约信息位点)和7种单倍型;在COI基因中共检测到8个变异位点(包括6个单一变异位点,2个简约信息位点)和7种单倍型.通过统计变异位点、平均核苷酸差异数和核苷酸多样性指数,分析比较了两群体间的序列差异和遗传多样性水平.结果显示2个日本蟳野生群体的遗传多样性比较丰富.用MEGA4.0软件构建了NJ和UPMGA系统树,基于16SrRNA基因片段的系统树显示梭子蟹科的4个属聚为两大支:日本蝇不同的单倍型先聚在一起,然后与青蟹属的3种蟹聚为一支;梭子蟹属的三疣梭子蟹、远海梭子蟹及塞氏梭子蟹聚在一起;再与美青蟹属的美洲蓝蟹、巴西蓝蟹等聚为一支.基于COI基因显示日本蟳不同的单倍型先聚在一起,再与其他3种蟳聚为一支;梭子蟹属的远海梭子蟹和三疣梭子蟹相聚,然后与美青蟹属的2种蟹相聚为一支.该结果与传统分类一致.这些数据为我国日本蟳的种质资源保护和利用提供了基础的分子生物学依据.     

四种免疫促进剂对日本蟳酚氧化酶和血细胞的影响

为查清免疫促进剂对日本蟳（Charybdis japonica）（俗称石蟹）自身免疫力的增强作用及机理,对脂多糖（LPS）、β葡聚糖（β—1,3-glucan）、灭活鳗弧菌和灭活哈维氏弧菌对日本蟳酚氧化酶（po）的产量与活性以及血细胞的数量与超微结构的影响进行了研究。结果表明,经4种免疫促进剂处理后,日本蟳PO产量和总酶活性都有显著增加,但PO的比活性与对照相比没有显著差异。日本蟳血细胞超微结构观察显示,多糖处理组小颗粒细胞和大颗粒细胞的糙面内质网和线粒体数量增加,颗粒数量减少、体积增大,而透明细胞的超微结构没有显著变化;灭活弧菌处理组小颗粒细胞中的颗粒数量明显减少,透明细胞中线粒体的数量显著增加。由此可见。多糖类和灭活弧菌类免疫促进剂对日本蟳非特异性免疫系统的影响不同,多糖类免疫促进剂主要提高酚氧化酶原激活组分PO的产量,进而提高PO总酶活性,而灭活弧菌类免疫促进剂主要提高透明细胞和小颗粒细胞的吞噬活性。     

日本蟳繁殖生物学的初步研Ⅱ.雄性繁殖习性及胚胎发育

根据精巢形态、切片组织学观察及扫描电镜观察 ,可将日本虫寻的精巢发育划分为三期 :未发育期、发育期与成熟期。通过扫描电镜观察可知 ,它的精子为无鞭毛精子 ,呈圆球形 ,大小为 30 μm。并运用实地调查、解剖、分析样本及光镜观察等手段 ,对其性腺形状、交配行为及胚胎发育等作了初步的描述。     

日本蟳雌性越冬期各组织蛋白质和脂肪含量的变化研究

对日本蟳雌性越冬期肝胰腺、肌肉和卵巢中的蛋白质和脂肪含量的变化进行研究。结果表明:(1)越冬期肝胰腺指数(HIS)明显下降,卵巢指数(GSI)显著性增加(P0.05),HIS和GSI的变化呈显著负相关性。(2)卵巢中蛋白质和脂肪占干重的百分比在越冬期均有极显著性增加(P0.01),与GSI均呈显著负相关性,而与肝胰腺中蛋白质和脂肪占干重的百分比分别呈显著负相关,这说明肝胰腺中的部分脂肪和蛋白可能转移到卵巢中参与其发育。(3)肝胰腺中蛋白质和脂肪占干重的百,脂肪占干重百分比在越冬后期下降幅度显著,且脂肪占干重百分比与HIS呈极显著性正相关,蛋白质占干重百分比与HIS无显著相关。(4)肌肉中蛋白占干重百分比在越冬期间略有上升(P0.05);而其脂肪占干重百分比较低,与肝胰腺中的脂肪占干重百分比相差较大,越冬期间略有下降(P0.05)。(5)日本蟳在越冬前期消耗的能量主要来源于蛋白质,随着越冬时间延长,脂肪作为稳定的能源物质逐渐取代了蛋白质,成为主要的代谢能源。     

赤点石斑鱼精子的超低温冷冻及短期保存

对赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)精子的激活特点、超低温冷冻方案筛选、短期保存、受精实验等方面进行了研究。结果表明：水温25℃、比重为1.018的海水对赤点石斑精子具有最佳的激活效果,活力为(82.50±4.18)%;在进行超低温冷冻时,选择距离液氮面7 cm的高度进行降温,获得冻后活力为(65.83±3.76)%,显著高于1、3、15 cm 的处理组(P<0.0001),利用冻存液 B(含30 g/L 海藻糖、10%DMSO 的生理盐水)冻存赤点石斑精子,冻精活力为(67.92±3.96)%,显著高于另外两种冻存液(P<0.05);通过优化的方案(冻存液B,7 cm高度)冻存得到精子可获得较好的受精效果,受精率为(74.55±4.31)%,而相应的鲜精受精率可达(87.42±4.63)%,二者间的差异具有显著性(P=0.017);短期保存的结果表明,赤点石斑鱼精子在4℃环境中保存约两周后活力降低为0。