利用除草剂Sandoz 9785筛选高EPA微拟球藻的研究

为研究使用除草剂Sandoz 9785筛选高EPA微拟球藻的有效性,用添加不同浓度除草剂Sandoz 9785的f/2固体培养基对海洋微拟球藻(Nannochloropsis oceanica)进行处理。当除草剂浓度为58μmol/L时,可抑制99.1%的藻细胞生长,在该除草剂浓度下,筛选获得2株抗除草剂藻株SA1和SA2。将抗性藻株在无除草剂f/2液体培养基中培养到指数期和平台期,分别测定其叶绿素荧光参数。研究显示,PSⅡ的最大光能转化效率(F_v/F_m)、PSⅡ的潜在活性(F_v/F_0)、PSⅡ的实际光能转化效率(ΦPSⅡ)、PSⅡ光合电子传递效率(ETR)等均高于出发藻株。其中,SA2的比生长速率达到0.199d~(-1),较出发藻株提高了2.31%;SA1的EPA含量较出发藻株藻提高了5.44%,占总脂肪酸含量的27.35%。研究结果表明,使用除草剂Sandoz 9785可有效筛选出EPA含量较高的微拟球藻藻株。     

微拟球藻原生质体制备与再生

综合考虑酶混合液处理时间和初始细胞密度两个因素,选取终浓度为4%半纤维素酶和2%崩溃酶的酶混合液对一株海洋经济微藻——微拟球藻(Nannochloropsis oculata)进行原生质体的制备与再生,Calcofluor White染料染色可在荧光显微镜下观察到完整的原生质体细胞。实验结果表明:同一初始密度藻细胞酶处理1～3 h制备率较高;酶处理相同时间较高初始密度(2×107～3×107cells/mL)的藻细胞制备率较高,并且原生质体在再生培养基上可再生,生长趋势与野生型细胞一致。考虑到酶处理时间过长或者密度过大会对原生质体的再生产生影响,本实验选择最适酶处理时间为1h,初始细胞密度为2×107cells/mL。     

微拟球藻的水产饵料效果研究

通过人工高密度培养微拟球藻(Nannochloropsis salina),对比研究了该藻作为直接饵料在栉孔扇贝(Chlamys farreri)育苗和间接饵料在牙鲆(Paralichthys olivaceus)育苗中的应用效果。结果表明,微拟球藻生长迅速、细胞颗粒小、富含EPA等不饱和脂肪酸、营养比较全面,同时具有较厚细胞壁的特点。通过不同的光生物反应器和高密度培养技术,可以比较容易地实现微拟球藻的高密度培养,藻液细胞密度维持在5~15亿个/mL的高密度水平,最高达到36亿/mL。藻体叶绿素和类胡萝卜素含量因培养条件不同而有差异,其中每个细胞内的叶绿素含量在8.60×10-13g±0.65×10-13g,类胡萝卜素含量在1.45×10-13g±0.12×10-13g。作为直接或间接饵料,微拟球藻在不同水产动物培育中的应用效果差异性很大。其中,微拟球藻作为饵料直接投喂栉孔扇贝幼虫,虽可被摄食但不容易消化,造成食物在栉孔扇贝幼苗胃内滞留盈胀,最后出现代谢性饥饿和营养不良现象进一步影响个体生长,该藻在栉孔扇贝幼虫培育中的饵料效果不很理想。相反,利用微拟球藻培育轮虫(Rotifer),然后再将后者投喂牙鲆仔鱼,作为间接饵料微拟球藻不仅大幅提高牙鲆的成活率,同时还明显增加牙鲆的生长速度,是培育仔稚鱼开口饵料轮虫的优质微藻。微拟球藻在不同水产动物育苗中应用效果明显差异的原因,主要在于该藻是否能够被充分消化吸收。因此,有效破碎微拟球藻细胞壁技术和提高消化吸收措施都将推动该藻在水产中的应用。     

一株分离微拟球藻LAMB0002的鉴定

微藻的分类鉴定是进一步应用的前提。微拟球藻属的6个种都是单细胞微藻,形态简单,难以用形态学方法进行准确鉴定。本研究分离了一株微拟球藻,结合光学显微镜和透射显微镜观察、脂肪酸和色素组成分析、18SrRNA基因和rbcL基因序列分析,将该藻株鉴定为Nannochloropsis oceanica LAMB0002。本研究进行了微藻分类系统的初步探索,为今后形成系统的微藻分类体系奠定了基础。     

微拟球藻硫脂酶基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

微拟球藻(Nannochloropsis oceanica)基因组序列注释的硫脂酶基因(NoTE)长1 314bp,其编码的硫脂酶长437氨基酸,与其他物种硫脂酶序列相似性较低。为验证其功能,将NoTE克隆到原核表达载体pET-30a上并在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了表达。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测到预期大小的蛋白质条带。气相色谱(GC)分析显示,表达NoTE未改变大肠杆菌脂肪酸种类,但改变了其总脂肪酸含量和脂肪酸比例,其C14∶1、C16∶0、C16∶1、C18∶1及总脂肪酸含量较不含重组质粒菌株分别提高了11%、18%、32%、49%和30%。研究结果证明了克隆的硫脂酶基因能在大肠杆菌中表达并具有相应的酶活性。     

6株高产油微拟球藻的中试培养评价研究

用50L密闭式吊袋光生物反应器,采用连续培养模式,对6株微拟球藻(Nannochloropsis oceanica)进行产油性能的中试筛选。从藻种的比生长速率、总脂含量、油脂产率,甘油三酯(TAG)含量和脂肪酸组成等方面评价藻种的产油性能。经过10d的连续培养,筛选到2株生长速率快、油脂产率高的优良能源微藻藻株:3-25和75B1,它们的总脂含量分别达到细胞干重的33.49%和29.36%;油脂产率分别为10.04和8.07mg·(L·d)~(-1);它们的C16与C18之和分别占到了总脂肪酸含量的72.71%和68.05%,且以饱和脂肪酸C16∶0及单不饱和脂肪酸C16∶1为主,适合生物柴油的生产。尽管藻株4-38的油脂产率较低,但其甘油三酯含量较高,C16和C18之和高达76.32%,其脂肪酸组成也非常适合生物柴油的生产。研究结果表明,3-25、75B1和4-38这3株微拟球藻有望作为生产生物柴油的候选藻株。     

吲哚乙酸对微拟球藻生长和脂肪酸含量的影响

研究不同浓度吲哚乙酸(Indole-3-Acetic Acid,IAA)对微拟球藻(Nannochloropsis oculata)生长和脂肪酸组成的影响。结果表明:在0.1 mg/L时,低于0.5 mg/L时IAA促进微拟球藻生长,但不影响叶绿素和不饱和脂肪酸合成;IAA促进生长作用最显著,最大比生长率为2.33 d-1。随浓度进一步增加,IAA促生长作用越来越小,并抑制叶绿素和不饱和脂肪酸合成;在5 mg/L时,IAA极显著抑制EPA合成。添加适当浓度IAA可促进藻细胞生长,缩短其生长周期。     

Fe对眼点拟微球藻的生长和脂肪酸组成的影响

研究了铁对眼点拟微球藻(Nannochloropsis oculata)的生长和脂肪酸组成的影响.结果表明: Fe2 浓度在0～0.5 mmol/L的范围内,细胞比增长速率随Fe2 浓度的升高而降低.与对照组相比,随着Fe2 浓度的升高,细胞中主要的饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸占总脂肪酸的比例有所降低,而多不饱和脂肪酸占总脂肪酸的比例则有较大的提高.另外,在一定范围内(0～0.3 mmol/L),Fe2 浓度的升高则会促使细胞内积累二十碳五烯酸(EPA).细胞生长和EPA积累的最适Fe2 浓度是0.05 mmol/L,在这一浓度下细胞比增长速率为0.236±0.020 d-1,细胞中EPA质量分数比对照组提高约24%.     

培养基限氮和添加钨酸钠对微拟球藻脂肪酸组成的影响

微藻的脂肪酸组成与环境条件密切相关.选取微拟球藻(Nannochloropsis oculata)为对象,比较研究了对培养基限氮和添加钨酸钠时,其脂肪酸组成的变化.结果表明:培养基限氮时,16∶0、16∶1、和18∶1占总脂肪酸的比例均显著提高,其中16∶0和18∶1均在限制96h达到最高值,分别提高了24.77％和95.27％,而20∶4和20∶5则显著降低.添加钨酸钠培养时,16∶0、16∶1、和18∶1占总脂肪酸的比例均显著提高.在钨酸钠浓度为0.1mmol/L时,与对照组相比,18∶1含量提高了1.13倍.该结果与培养基限氮培养时一致.因此,添加钨酸钠可实现氮限制.本研究旨在通过改变培养条件,探索微藻生物量积累后富集油脂的可能性,为微藻生物柴油大规模生产提供理论基础.     

三种抑制剂对眼点拟微球藻的生长及脂肪酸组成的影响

研究了 DCMU、氟哒酮及亚油酸对眼点拟微球藻的生长、总脂含量及不饱和脂肪酸组成的影响。结果表明 :(1)当 DCMU的浓度在 0 .8μmol/ L以上时 ,眼点拟微球藻的生长抑制率达80 % ,其总脂占干重的百分含量减少了近 30 % ;在 1.0 μmol/ L 时 ,EPA占其总脂肪酸的相对百分含量增加了 10 8.6 1%。 (2 )当氟哒酮的浓度在 8.0μmol/ L以上时 ,眼点拟微球藻的生长抑制率为82 .9% ,其总脂占干重的百分含量下降了 2 1% ,而 EPA占其总脂肪酸的相对百分含量增加了6 0 %。(3)当亚油酸的最终浓度在 4 0 0 μmol/ L 以上时 ,眼点拟微球藻的抑制率达 6 4 %以上 ;大于30 0 μmol/ L、4 0 0 μmol/ L 时 ,EPA占其总脂的相对百分含量在 4 .77%以下 ;在 5 0 μmol/ L 以下时 ,EPA占其总脂肪酸的相对百分含量从对照组的 2 0 .96 %下降到 19.4 9%以下。结果表明 ,眼点拟微球藻在养殖中 ,当生物量增加到一定的程度时 ,可以用加入一定浓度的 DCMU或氟哒酮的方法来大幅度提高 EPA的含量。     

微拟球藻优化培养模式及其在光生物反应器高密度培养中的应用

微藻是水产养殖动物终生或特定发育阶段的饵料(或饵料的饵料)作为重要基础之一,很大程度上支撑着水产养殖产业。目前,在水产育苗过程中,由于生物污染和气候等原因,时常出现饵料微藻数量不足现象,人们不得不选用人工饲料代替,这在很大程度上限制了水产养殖业发展。同时,微藻饵料质量的优劣也直接影响着水产动物孵化率、成活率及生长率等,也决定着水产养殖的成败。因此选择生长快、颗粒大小适宜并富含营养物质的饵料微藻是水产养殖的基础。 科学家们研究发现,水产饲料中多不饱和脂肪酸[如二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等]对海鱼和对虾影响效果明显(陈晓林等,2004刘镜恪等，1997，2002，2004，2005，2001； Liu et a12002，2004；邱小琮等,2004)多数海洋微藻具有增加ω3和ω6系列脂肪酸链长和去饱和能力,是多不饱和脂肪酸含量最多的 生物类群(樊云真等，1998；李文权等,2003；刘建国等,2002),在水产中,微藻饵料的缺乏常常成为限制水产动物育苗的关键因素,因此提供优质海洋微藻饵料是促进水产业发展的重要措施。微拟球藻是海洋微藻大眼藻纲中的主要种群(Hibbeed,1981),能高产不饱和脂肪酸(特别是EPA)(Zou et al,1999；魏东,2000；王秀良,2002)并具有生长迅速、细胞颗粒小(Hu et al,2003)的特点。作者利用微拟球藻培养轮虫,投喂牙鲆幼苗的实验数据显示,该藻培育的轮虫对牙鲆幼苗生长有明显促进作用,也有利于提高幼苗的成活率(刘建国等,2007)。 本文作者利用微拟球藻在天然海水中的人工优化配方以及光温等重要参数、总结出优化培养模式，利用不同光生物反应器对优化模式进行了高密度培养验证,并研究了比生长速率与生物产量等问题,为该藻的海水饵料培养和水产应用提供基础。     

微拟球藻优化培养模式及其在光生物反应器高密度培养中的应用

微藻是水产养殖动物终生或特定发育阶段的饵料(或饵料的饵料),作为重要基础之一,很大程度上支撑着水产养殖产业。目前,在水产育苗过程中,由于生物污染和气候等原因,时常出现饵料微藻数量不足现象,人们不得不选用人工饲料代替,这在很大程度上限制了水产养殖业发展。同时,微藻饵料质量的优劣也直接影响着水产动物孵化率、成活率及生长率等,也决定着水产养殖的成败。因此选择生长快、颗粒大小适宜并富含营养物质的饵料微藻是水产养殖的基础。科学家们研究发现,水产饲料中多不饱和脂肪酸[如二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等]对海鱼…     

温度逆境处理提高拟微球藻(Nannochloropsis oculata)EPA含量的研究

二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)是一种长链多不饱和脂肪酸,是水产养殖动物幼体发育必需脂肪酸之一.富含EPA鲜活微藻、干燥微藻和冷冻微藻是水产养殖动物幼体重要的饵料[1].同时,EPA还能增强水产养殖动物免疫系统功能,提高成活率和抗病力[1～3].由于EPA含量是饵料藻品质的决定因素之一,品种选育、生态调控等提高EPA含量的措施均能提高微藻饵料价值.低温能提高微藻脂肪酸不饱和度,以维持生物膜流动性,抵抗低温伤害[4].另外,我们推测长链脂肪酸有可能提高微藻适应高温环境的能力.     

迦得拟微球藻在不同硝酸钾浓度下的生长和生理生化特征

迦得拟微球藻(Nannochloropsisgaditana)具有较高的开发价值,但对于其活性物质定向积累的研究相对较少。本文以迦得拟微球藻为研究对象,设置3.0、5.0、7.5和14.9mmol/L (对照组,ASW培养基的硝酸钾浓度)四种硝酸钾组,探究氮素水平调控迦得拟微球藻总脂、多糖、可溶性蛋白和多不饱和脂肪酸等物质定向积累的可行性,以及此过程藻细胞的光合生理响应规律。结果表明:与对照组相比,硝酸钾浓度降低,迦得拟微球藻的生物量降低、总脂含量增加、可溶性蛋白质含量和多糖含量降低,然而其总脂、多糖与可溶性蛋白产率的最大值却在对照组条件下获得,分别为0.150、0.170和0.053g/(L·d);与对照组相比,3.0、5.0和7.5mmol/L处理组的C20:5相对含量分别降低73.1%、49.1%和23.9%;迦得拟微球藻的主要色素(堇菜黄素、无隔藻黄素、β-胡萝卜素、叶绿素a)随氮浓度降低呈减少趋势;PSⅡ最大光量子产量(Fv/Fm)、相对电子传递效率(rETR)和光合放氧速率随氮浓度降低而显著降低。综上所述,调控氮浓度可以实现迦得拟微球藻总脂、可溶性蛋白、多糖和C20:5的定向积累,但上述物质的产率却受到生物质浓度的影响,14.9mmol/L氮浓度条件下高光合效率是迦得拟微球藻获得较高活性物质产率的主要原因。     

海洋微拟球藻对共培养三角褐指藻的分子生理学响应机制

本研究运用多物种混合转录组测序(msRNA-seq)法分析了对数生长期海洋微拟球藻响应相同细胞数指数末期三角褐指藻共培养的生理机制。两种藻的细胞总数在8 d内基本不变。三角褐指藻转录组结果中存在与生长有关的基因的表达,且难以与响应共培养的生理过程区分。因此,我们只分析微拟球藻响应共培养的转录组变化及其揭示的生理学机制。分析发现在共培养的初始24 h内共有8 235个基因表达,其中,809个为显著差异表达基因,351个下调表达,458个上调表达。这些差异基因被富集到7条KEGG通路中。其中,在DNA复制和同源重组通路上所富集的基因呈下调表达,而在氨基和核苷酸糖代谢通路、Focal adhesion、PI3K-Akt、cAMP、ErbB信号通路上所富集的基因呈上调表达。结果表明海洋微拟球藻响应三角褐指藻共培养时发生了一系列生理学变化。这是应用多物种混合转录组测序分析微藻间互作的初步尝试,建立的方法也适用微藻和其它微生物的互作机制研究。     

氮源和N/P对眼点拟微球藻的生长、总脂含量和脂肪酸组成的影响

报道了ＮａＮＯ３,ＮＨ４Ｃｌ和ＮＨ４ＮＯ３种氮源及Ｎ／Ｐ对海洋微藻眼点拟微球藻（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｏｃｕｌａｔａ）的生长、总脂含量和脂肪酸组成的影响。结果表明,Ｎ／Ｐ从１０增加到９０,对细胸生长的影响不大,总脂含量最终都稳定在干重的２０％左右。１６：０、１６：Ｉｎ－９和２０：５ｎ－３（ＥＰＡ）是脂肪酸的主要组成,三者之和占总脂肪酸的７０％～８０％。在培养基Ｎ／Ｐ〉２０时,２０：５０ｎ     

一种提取眼点拟微球藻(Nannochloropisis oculata)DNA的简便方法

用氯化锂法从眼点拟微球藻(Nannochloropisis oculata)中提取DNA并对其提取条件进行了优化。新鲜藻细胞在提取液(0．6mol／L LiCl，0．8％Sakosyl，20mmol／L EDTA(pH8．0)，0．4％PVP，10mmol／L Tris-HCl(pH8．0)，5％β—巯基乙醇)中经过55℃温育30min，每mg鲜藻可提取20—40mg DNA，提取的DNA分子量在23kb左右，可用于PCR、限制性酶切等。     

海洋富油微拟球藻Nannochloropsis gaditana CCAP849/5的转化及外源基因整合方式

微拟球藻Nannochloropsis被认为是具有作为生物柴油原料开发潜力的微藻。为了能够实现工业化生产,有效地利用基因工程或遗传操作手段改造微藻,提高产量,建立稳定有效的遗传转移方法十分必要。本研究以微拟球藻本源β-tublin基因启动子和三角褐指藻Phaeodactylum tricornutm fcpA终止子驱动和终止来源于细菌的sh ble抗性选择基因,构建了一个转化载体pHB4857。将pHB4857以电转移的方法转化海洋富油微拟球藻Nannochloropsis gaditana CCAP849/5。结果显示,转化子可以在3μg·mL-1 zeocin的抗性培养基中生长,PCR检测sh ble基因为100%插入率,转化效率为1.25×10-6。DNA印迹杂交结果表明,外源基因是以随机整合的方式一个或多个拷贝插入到宿主核基因组中的,大多数转化子中的外源基因的整合是完整的。转化子在抗性培养基中每10天传一代,连续传代7个月以上,未检测到抗性基因丢失现象,外源抗性基因可以在宿主细胞中稳定存在。     

不同温度和N,Fe3+质量浓度对微拟球藻脂肪酸组成及SCD基因表达的影响

为了研究不同温度和N、Fe3+质量浓度对微拟球藻脂肪酸组成的影响,采用气相色谱-质谱联用仪,测定了不同处理条件下微拟球藻脂肪酸的组成。并利用荧光定量PCR技术,监测了在不同处理条件下微拟球藻硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)基因的表达差异。结果表明:在缺N的条件下,微拟球藻中的不饱和脂肪酸的比例如C18∶2、C18∶1和C20∶4明显降低;在富N条件下C18∶2、C20∶4和C20∶5等不饱和脂肪酸的比例明显提高;在高温处理下,微拟球藻中C16∶1和C18∶1等单不饱和脂肪酸占总脂肪酸的比例有显著提高,而C20∶4和C20∶5等多不饱和脂肪酸则有明显的降低趋势;在低温处理组中,多不饱和脂肪酸如C18∶2和C20∶4在微拟球藻总脂中的比例明显提高;在富Fe条件下,多不饱和脂肪酸尤其是C20∶4和C20∶5发生积累;在缺Fe条件下,不饱和脂肪酸如C18∶1、C20∶5等占总脂肪酸的比例明显下降。与此同时,在富N、低温、高温和富Fe的条件下,SCD基因的表达量有显著的提高;在缺N和缺Fe的条件下,SCD基因的表达量下降。这揭示了SCD基因在不饱和脂肪酸形成途径中所起的重要作用,同时也证明了基因的表达与产物的合成有着密切的联系。     

微拟球藻Ⅰ型脂酰辅酶A:二脂酰甘油酰基转移酶编码基因NoDGAT1A的功能分析

从微拟球藻高产油藻株IMET1的cDNA中,克隆出一个I型脂酰辅酶A:二脂酰甘油酰基转移酶的编码基因NoDGAT1A,该基因共编码437个氨基酸,与拟南芥I型DGAT的氨基酸序列相似度为38%,且含有至少9段高疏水区。随后,NoDGAT1A被转化入营养缺陷型酿酒酵母三脂酰甘油合成突变株H1246中进行诱导表达。结果表明,在外加二十碳五烯酸(EPA)时,表达No DGAT1A的H1246能够产生三脂酰甘油(TAG),针对其TAG的分析表明,与酵母DGAT相比,表达NoDGAT1A的H1246产生的TAG中含有更多的EPA,说明NoDGAT1A具有更强的合成含EPA的TAG之能力。此外,16:0(63.82%)和18:0(27.98%)是其TAG中主要的脂肪酸链成分,说明NoDGAT1A合成的TAG侧链仍以长链饱和脂肪酸为主。NoDGAT1A对微拟球藻中TAG的合成具有重要作用,也为以微拟球藻为模式的产油微藻TAG和EPA代谢网络提供参考。