重金属在泥蚶体内的累积

实验通过测定泥蚶(Arca granosa Linnus)血液和软体组织中Cd,Pl和Cu的含量,讨论泥蚶对这三种金属的富集能力和体内分布,结果表明,金属在血液和软体组织中的浓缩系数高低顺序为:Cd>Cu>Pb,且Cu和Pb的浓缩系数值接近,体内分布相似,有别于Cd;血液浓缩系数可反映出软体组织的富集能力,由海水铅致毒实验表明,血液Pb浓度受环境海水Pb浓度的支配并随时间变化;海水铅致毒浓度1-100μg/l,泥蚶血液和软体组织中Pb含量随海水Pb浓度的增加而升高,三者之间具指数相关.     

铅(Pb)胁迫对泥蚶血液MT及Vg基因表达的诱导效应研究

为了解泥蚶金属硫蛋白基因(MT)和卵黄蛋白原基因(Vg)在重金属Pb胁迫下的表达响应模式,本文设置了1、3、6及9μg/L 4个浓度梯度的重金属Pb攻毒实验。在此基础上,利用qRT-PCR技术检测了0、7、14、21、28 d泥蚶血液MT、Vg的相对表达量。结果显示泥蚶MT基因在Pb~(2+)暴毒14 d时开始被显著诱导,在整个实验过程中基本呈现先增后降的态势。且在14 d和28 d时,6μg/L及9μg/L浓度组泥蚶MT相对表达量均高于1、3μg/L浓度组。由此可见,在Pb~(2+)胁迫下泥蚶血液MT基因的表达具有一定的时间依赖性和浓度依赖性。相比之下,泥蚶血液Vg基因的诱导表达情况较MT基因而言不明显。3μg/L浓度组泥蚶Vg mRNA较对照组在14、21 d时被显著诱导;9μg/L浓度组其在28 d时才开始被显著诱导。综上可见,泥蚶MT和Vg在应激重金属Pb过程中起到了一定的抗氧化及重金属解毒作用。     

地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)对镉胁迫下泥蚶(Tegillarca granosa)的抗氧化酶活性和免疫相关基因表达的影响

本文研究一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)对提高泥蚶耐受镉(Cd2+)胁迫的作用,实验分析了不同浓度地衣芽孢杆菌对Cd2+胁迫下泥蚶(Tegillarca granosa)的存活率及组织中Cd残留量的影响;同时比较了地衣芽孢杆菌作用前后,泥蚶体内两类抗氧化酶,超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性,进一步通过Real-time PCR分析了三类免疫相关基因金属硫蛋白(MT)、小热休克蛋白分子(sHSP)和铁蛋白(ferritin)的表达情况。研究结果显示,地衣芽孢杆菌能降低泥蚶组织中Cd残留量,提高其存活率。并能有效促进泥蚶体内SOD和GSH-Px酶活性的增加,同时降低MT、sHSP和ferritin在mRNA水平上的表达。数据表明该地衣芽胞杆菌可通过调节泥蚶的免疫系统,起到降低Cd2+对泥蚶毒害的作用。     

不同年龄泥蚶同工酶电泳的研究

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，对同一种群不同年龄的泥蚶过氧化物酶、酯酶、淀粉酶、苹果酸脱氢酶、过氧化氢酶、醇脱氢酶、苹果酸酶和超氧化物歧化酶等8种同工酶进行了分析比较。结果表明，不同年龄泥蚶的过氧化物酶、酯酶同工酶在酶谱带上有一定差异。淀粉酶、苹果酸脱氢酶、过氧化氢酶、醇脱氢酶、苹果酸酶和超氧化物歧化酶同工酶在酶活性上有一定的差异。     

乐清湾泥蚶血细胞周期和DNA含量

用流式细胞仪测定乐清湾泥蚶血细胞DNA含量，得出组方图中只有一个峰（G0/G1），表明了乐清湾泥蚶血液不存在合成期（S）、合成后期（G2）和分裂期（M）细胞，血细胞已失去分裂功能，不存在周期现象，以小鸡血细胞做标准对照物（DNA含量以2.3pg/N)，测得乐清湾泥蚶血细胞DNA含量为3.08pg/N。     

哈维氏弧菌对泥蚶的毒性及半致死浓度研究

为构建泥蚶感染弧菌标准技术体系,本研究采用哈维氏弧菌浸泡感染和注射胁迫两种攻毒方式对泥蚶进行了急性毒性实验,观察泥蚶在菌液胁迫下的存活情况,分析哈维氏弧菌对泥蚶的半致死浓度。浸泡感染实验结果表明,随着感染水体中弧菌升高,泥蚶死亡起始时间和最大日死亡率时间均有所提前,泥蚶死亡情况呈现上升趋势,当浸泡浓度超过2×10⁷CFU/mL,泥蚶15 d累计死亡率接近100%。注射胁迫实验结果表明,泥蚶死亡率与弧菌注射浓度呈显著正相关(r=0.964,P<0.01)。Probit回归分析结果显示,哈维氏弧菌浸泡感染泥蚶7 d后停止实验,15 d的半致死浓度(LC₅₀)为1.35×10⁷CFU/mL;注射胁迫下的96 h半致死剂量(96 h LD₅₀)为2.12×10⁷CFU/g,说明哈维氏弧菌对泥蚶有明显的毒害作用。研究结果为泥蚶对哈维氏弧菌耐受性提供数据参考,并且为泥蚶弧菌病防治提供了理论基础。     

不同种群泥蚶的5种同工酶研究

应用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,对韩国自然种群、广西自然种群、乐清自然种群、山东自然种群和乐清养殖种群泥蚶的苹果酸脱氢酶(MDH)、过氧化氢酶(CAT)、醇脱氢酶(ADH)、苹果酸酶(ME)和超氧化物歧化酶(SOD)等5种同工酶进行分析比较。结果表明,不同种群泥蚶的ME同工酶无差异;ADH和SOD同工酶除韩国自然种群泥蚶外,其它4个种群泥蚶无差异;MDH同工酶除乐清自然种群和养殖种群泥蚶外,其它3个种群泥蚶均有差异;CAT同工酶在广西自然种群泥蚶中没有表达,在韩国自然种群泥蚶与山东自然种群、乐清自然种群和乐清养殖种群泥蚶中有一定差异。     

Cd~(2+)、Pb~(2+)、Hg~(2+)对泥蚶鳃及消化腺显微结构和超微结构的影响

研究了9μg/L暴毒浓度的镉(Cd2+)、铅(Pb2+)和1.08μg/L暴毒浓度的汞(Hg2+)对泥蚶鳃和消化腺组织显微结构和超微结构的影响。实验处理时间为28d。3种重金属胁迫下鳃组织显微结构观察显示鳃丝排列混乱,血细胞堆积现象严重;超微结构观察发现,Cd2+和Hg2+胁迫下鳃细胞发生细胞核皱缩,有大量的线粒体和溶酶体。Pb2+攻毒组的鳃细胞中聚集大量的嗜锇性物质。3种重金属胁迫下消化腺组织显微结构显示消化腺细胞破碎,完整度变差;从超微结构来看,在Cd2+和Pb2+的胁迫下,消化腺细胞中出现嗜锇性物质;另外在Pb2+胁迫下,消化腺细胞中有溶酶体;然而在Hg2+胁迫下,泥蚶消化腺细胞受到的影响不明显。本研究推测在重金属胁迫下,泥蚶可能会通过溶酶体和重金属形成不溶性颗粒,从而将重金属隔离进行解毒作用;大量产生的线粒体可能对重金属引起的氧化胁迫进行呼吸补偿反应。     

泥蚶(Tegillarca granosa)血红蛋白基因(Tg-HbIIA)克隆、分析及免疫表达研究

通过已构建的泥蚶血液cDNA文库,克隆得到泥蚶Tg-HbIIA基因全长cDNA序列,对其进行生物信息学、组织表达及免疫相关分析。结果表明,泥蚶Tg-HbIIA cDNA全长731bp,包含63bp5′非编码区(5′-UTR),246bp3′非编码区(3′-UTR),开放阅读框450bp,编码150个氨基酸;其氨基酸序列与毛蚶(Scapharca kagoshimensis)和不等壳毛蚶(Scapharca inaequivalvis)的序列有较高的同源性,分别达到89%和88%;对其结构预测显示该蛋白具有血红蛋白功能域,含有10个潜在血红素结合位点。qRT-PCR检测结果显示:泥蚶不同组织部位中,Tg-HbIIA mRNA在血液表达量最大,其次为外套膜和鳃,表达量最低的是肝胰脏;在副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticu)、脂多糖、肽聚糖刺激后,泥蚶血液Tg-HbIIA mRNA表达量显著上调,表明Tg-HbIIA在贝类抗菌免疫防御中可能起重要作用,而Tg-HbIIA对不同致病因子免疫反应的灵敏度和表达时序存在一定差异。     

泥蚶同工酶谱在不同组织的差异研究

用聚丙烯酰胺电泳法对泥蚶5种组织中的19种同工酶进行检测分析,发现除其中4种酶未显示任何有活性的区带,两种酶只显示极微弱且不稳定的区带外,其他种酶类在各个组织中都显示出清晰稳定的图谱,且这些酶在分布和活性上均表现出高度的组织特异性,说明泥蚶组织中已存在相当丰富和完整的酶系统,基本具备了与高等动物相类似的机体代谢方式,而且这些酶基因的表达存在着组织分布上的自我调控机制.同时与其他贝类和高等动物相比,泥蚶的同工酶基因的表达既表现出了与其分类地位相一致的特征,又反应出在分类阶元上的特殊性.     

泥蚶(Tegillarca granosa)个体发育过程中同工酶基因表达与调控的研究

采用不连续垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳法，对泥蚶(Tegillarca granosa Linnaeus)19个发育阶段的ADH、LDH、EST、IDH、ALP、MDH、GDH、POD、ATPase和ME等10种同工酶的基因表达进行检测分析。结果表明，泥蚶在个体发育过程中随着机体分化和生理活动的改变，同工酶基因的表达呈现出显著的时序变化。在10种酶中，LDH和ATPase两种酶的所有酶带及EST、MDH和ME等的部分酶带在各个发育阶段持续表达，其他酶带只出现在发育阶段的某一或某些阶段，并且表现出了与泥蚶营养方式、代谢形式等生理活动的关联性。在泥蚶的个体发育阶段过程中，IDH、MDH、GDH、ME、ALP等5种酶在32细胞期表达的酶带数剧增，因此32细胞期可能是合子基因表达启动的时间；ADH、EST、LDH、MDH、GDH、ME等6种酶在泥蚶的附着变态期酶带大幅减少或产生新酶带，可能与泥蚶附着期运动方式、代谢强度及生活环境的改变有关。     

Cd2+和Cu2+对泥蚶的急性毒性和联合毒性试验

为了解重金属Cd2+和Cu2+对泥蚶的毒害程度和泥蚶对重金属Cd2+和Cu2+的解毒能力,用毒理学实验方法研究了Cd2+和Cu2+对泥蚶(Tegillarca granosa)的急性毒性和联合毒性效应。结果表明:Cd2+、Cu2+对泥蚶的96 h半致死质量浓度分别为6.189、0.460 mg/L;安全质量浓度分别为0.062、0.005 mg/L;相对毒性Cu2+Cd2+。在1︰1毒性单位的联合作用下,Cd2+和Cu2+对泥蚶96 h的半致死质量浓度分别为1.984、0.147 mg/L;安全质量浓度分别为0.020、0.001 mg/L。2种重金属离子的联合毒性大于任一重金属离子的毒性,联合毒性表现为协同作用。     

单一与混合重金属在泥蚶体内的累积特征

通过室内半静态暴毒实验, 在铜、铅、镉三种重金属的单一胁迫与两两联合胁迫条件下, 研究了繁殖期泥蚶(Tegillarca granosa)对重金属的富集规律。结果表明: 泥蚶对单一Cu²⁺、Pb²⁺、Cd²⁺的生物富集系数(BCF)分别为210.16～1 178.66、128.15～603.84 和198.84～659.37; 联合重金属胁迫条件下, Cd²⁺对Cu²⁺的富集具有一定的拮抗作用; Cd²⁺和Cu²⁺在泥蚶体内以可溶形式存在, 而Pb²⁺以不溶形式存在;Cu²⁺和Cd²⁺对泥蚶富集Pb²⁺有一定的协同效应; 砂滤海水中的暂养的泥蚶, 其体内的重金属含量除Cu²⁺外都较为稳定。     

泥蚶(Tegillarca granosa)肉质的蛋白组学研究

采用双向电泳技术,对广东阳江和浙江乐清两地的泥蚶肌肉全蛋白进行了研究,并利用质谱和软件对差异蛋白进行了分析.研究结果表明,阳江和乐清两地样品平均检测到的蛋白点数分别为674±25和746±34个,平均匹配率为78.6%.差异表达蛋白质点数为26个,其中3个点仅在阳江泥蚶中表达,5个点仅在乐清泥蚶中表达;6个点在阳江泥蚶中为高表达,12个点在阳江泥蚶中为低表达.选择其中6个具有代表性的蛋白点进行肽指纹图谱分析.结果显示,乐清泥蚶中高表达的4个蛋白确定为肌动蛋白、PRKA激酶锚定蛋白9、烯醇化酶.这些物质与泥蚶的肉质特性有一定关联.乐清地区出产的泥蚶在营养、肉质和鲜美度方面均优于阳江地区的泥蚶.     

重金属胁迫对泥蚶(Tegillarca granosa)能量代谢酶转录水平的研究

利用PCR扩增技术,从泥蚶的cDNA文库中克隆出了ATP合酶F1-β亚基基因。FOF1-ATP合酶是生物体能量代谢的重要合成酶,ATP合酶F1-β亚基是其重要组成部分。序列分析结果表明,泥蚶的ATP合酶F1-β亚基全长1944bp,包括5′端非翻译区(5′-UTR)序列246bp,3′端非翻译区(3′-UTR)序列126bp和1572bp的开放阅读框序列(ORF),编码523个氨基酸,预测分子量大小和等电点分别为54.13kDa和4.73。在重金属镉、铜、铅胁迫下,检测ATP合酶F1-β亚基和精氨酸激酶基因在转录水平的调控变化。     

泥蚶幼虫滤水率和摄食率的研究

于１９９６年８月在胶南市棋子湾海珍品育苗采集已孵化５天,在壳长达到１４５μｍ的泥蚶面盘幼虫,利用Ｃｏｕｌｔｅｒ ｃｏｕｎｔｅｒ颗粒计数器测量泯蚶幼虫培育水体中饵料颗粒物质浓度的变化,对泥蚶幼虫的滤水率、摄食率进行了测定,并得出泥蚶幼虫滤水率,摄食率与生殖发育之间的关系。结果表明,泥蚶幼虫的壳长与其滤水率和摄食率均呈正相关,即幼虫工越长,其滤水率和摄食率越高。相同环境条件下,幼虫的培育密度与其滤率呈     

三唑磷对泥蚶急性毒性及血清SOD,CAT酶活性的影响

三唑磷对泥蚶(Tegillarca granosa)的48h LC50为21．0mg／L,96h LC50为10．2mg／L,依此设计三唑磷对泥蚶的胁迫质量浓度(1．1,2．2,4．4,22mg／L),分别于胁迫后第0．5,1,2,4,8天及解除胁迫后第4天采样,研究三唑磷胁迫后泥蚶血清超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性的变化情况。结果表明,随三唑磷胁迫浓度和时间的不同,泥蚶血清蛋白质质量浓度无显著性差异;在0.5,1d时各处理组的SOD无显著影响,从第2天起,SOD活性显著下降,48h的LC50为3．62mg／L;CAT的活性在第1天显著升高,而后逐渐降低。三唑磷胁迫下,SOD,CAT活性呈现一定的剂量效应与时间效应。胁迫解除后,蛋白质、SOD和CAT均得到不同程度的恢复,表明泥蚶具有一定的生理调节机能。     

泥蚶(Tegillarca granosa)生长因子受体结合蛋白2(GRB2)基因的克隆与表达分析

通过已构建的泥蚶(Tegillarca granosa)转录组文库, 利用SMART RACE技术扩增得到泥蚶Tg-GRB2基因的全长cDNA序列, 并对其生物信息学、组织表达及发育阶段表达特征进行了分析。结果表明, 泥蚶Tg-GRB2 cDNA全长1283bp, 开放阅读框为708bp, 编码236个氨基酸; 蛋白结构预测显示, Tg-GRB2蛋白包含SH3-SH2-SH3三个功能域, SH2结构域由两端的α-螺旋和中间反向平行的β-折叠片构成, SH3结构域主要由β-折叠片组成, 具备典型的结构特征; 氨基酸序列比对发现, Tg-GRB2与脊椎动物的同源性为62.1%—63.8%, 而与玻璃海鞘和日本血吸虫同源性较低。qRT-PCR检测结果显示: Tg-GRB2 mRNA在泥蚶血液、斧足、鳃、外套膜、闭壳肌、内脏团6个组织中都有表达, 而在血液中的表达量极显著地高于其它组织; 在泥蚶的不同发育阶段中, Tg-GRB2 mRNA在 2—4细胞胚胎、原肠胚、担轮幼虫、D形幼虫中均有较高的表达量, 而在D形幼虫中表达量最高, 表明Tg-GRB2基因在泥蚶早期发育中发挥重要调节作用。     

泥蚶(Tegillarca granosa)血细胞转录组序列中免疫相关基因的结构与mRNA表达量分析

贝类血细胞直接参与异物吞噬和包囊作用,还在伤口修复、炎症反应过程中发挥重要作用,是机体免疫防御的承担者。本研究采用RNA-seq测序技术研究了鳗弧菌感染前后泥蚶血细胞的转录组序列,通过序列组装,获得了α-葡萄糖苷酶(GAA)、α-甘露糖苷酶(LAMAN)、芳基硫酸酯酶B(ASB)、天冬酰胺氨基葡萄糖酶(AGA)、整合素β3亚基(ITB3)、热休克蛋白9(HSPA9)和Toll相互作用蛋白(TOLLIP)序列,利用Orffinder获得了其编码蛋白序列,并对蛋白序列进行了理化性质、二级结构、保守结构域和三级结构分析。结果表明:7种蛋白质二级结构均含有α螺旋、β折叠及无规则卷曲,泥蚶和人类ITB3和TOLLIP具有相同的保守结构域, Swiss-model同源建模获得的三级结构与模板同源性均超过35%(TOLLIP除外)。鳗弧菌刺激后,GAA、LAMAN、ASB、AGA和HSPA9的表达量显著增加,ITB3和TOLLIP表达量变化不明显。该研究补充和完善了对泥蚶免疫相关基因的认识,并为进一步开展泥蚶抗病机理研究提供了重要的理论依据。     

CO_2加富对魁蚶稚贝潜沙能力和3种酶活性的影响

贝类的生长和代谢过程可能会受到高CO2浓度的影响。潜沙行为和酶活性是贝类响应环境变化的重要指标,但其对海水CO2浓度升高响应的研究鲜有报道。本文采用CO2加富培养实验的方法,研究了高CO2浓度条件对魁蚶(Scapharca broughtonii)稚贝潜沙能力和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)和乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)3种酶活性的影响。结果表明,CO2组(1 000μatm)培养水体中DIC浓度显著高于对照组,魁蚶稚贝初次潜沙时间((5.73±0.51)min)相比对照组((7.80±1.27)min)明显缩短,潜沙率((69.67±5.13)%)相比对照组((61.33±3.21)%)明显升高。实验开始时魁蚶稚贝壳长为(17.20±0.03)mm,实验结束时CO2组魁蚶稚贝壳未出现明显生长((17.24±0.02)mm),显著低于对照组魁蚶稚贝壳长(17.37±0.07)mm。CO2组魁蚶稚贝SOD活性在培养第2和第4天时显著高于对照组(P0.01),之后出现下降并与对照组无显著差异;CO2组和对照组魁蚶稚贝CAT活性在前4天均上升,之后CO2组魁蚶稚贝CAT活性基本不变,而对照组出现下降;两实验组魁蚶稚贝AChE活性在培养过程中无明显差异。高CO2浓度条件下魁蚶稚贝壳的生长受到影响,潜沙过程受到促进,3种酶活性在培养过程中的变化趋势存在差异,未来海洋酸化可能会影响魁蚶的养殖。