鱼类性别决定与分化相关基因研究进展

在脊椎动物系统进化中,鱼类处于承前启后的关键地位.与高等脊椎动物相比,鱼类的性别决定机制具有原始性、多样性和易变性,并具有所有脊椎动物的性别决定方式,存在从雌雄同体到雌雄异体的各种性别类型,性逆转在鱼类也是较为常见的现象,因此鱼类性别决定机制研究对于整个脊椎动物类群性别决定机制的形成及进化途径的揭示有非常重要的理论价值.而且鱼类的性别发育是以遗传因素为基础,并受到自身内分泌调节和外界环境的影响,是三者相互作用的结果,故其性别决定与分化没有一个普遍的模式,给性别决定与分化研究带来了一定难度.但随着分子生物学技术的迅猛发展,近20年来有关鱼类性别决定与分化机理及性别相关基因的研究已经取得了相当大的进展.作者根据现有文献资料,对鱼类性别决定与分化相关基因的研究动态和进展作一综述,并对目前存在的热点问题进行了探讨,以期为今后鱼类性别决定与分化相关基因深入研究提供参考.     

半滑舌鳎雌鱼基因组Fosmid文库构建及分析

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是我国的大型经济鱼类,其养殖发展迅速。有关半滑舌鳎的基因组文库构建和分析等方面的研究,目前尚未见报道。用流式细胞仪检测雌性半滑舌鳎基因组大小。从半滑舌鳎雌鱼肌肉提取基因组DNA,选取大小合适的DNA片段,经末端修复并回收后,再以Fosmid作为载体,构建半滑舌鳎雌鱼基因组文库。经检测,雌性半滑舌鳎基因组大小约为606.36 Mb。所构建的Fosmid文库含有49 920个克隆,重组率为96.88%;插入片段长度分布在33~45 kb之间,平均为39.2 kb;覆盖雌性半滑舌鳎基因组3.12倍;从文库中筛选得到单拷贝DNA序列的概率为95.6%。对培养第1天和第6天的克隆进行比较,结果表明文库稳定性高,培养过程中没有发生变化。     

半滑舌鳎雌性特异fosmid克隆的筛选及FISH定位

通过对半滑舌鳎雌鱼fosmid文库进行有序混合,成功构建了两步-三维PCR筛选体系,为后续的基因筛选奠定了基础。通过对半滑舌鳎W染色体文库序列进行引物设计,并分别在雌、雄鱼基因组DNA中筛选,获得1对雌鱼特异性引物。使用该引物对fosmid文库进行筛选,得到1个雌鱼特异性克隆,并通过荧光原位杂交技术将克隆定位到了W性染色体上,证实了使用该体系进行文库筛选的有效性以及雌鱼引物的特异性,建立了半滑舌鳎遗传性别的分子及细胞遗传学鉴定方法,为后续半滑舌鳎基因组及性染色体的研究奠定了基础。     

基于皮肤转录组的半滑舌鳎无眼侧黑化相关基因的筛选鉴定

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)作为比目鱼(Pleuronectiformes)中的代表物种,是我国沿海地区重要的海水经济鱼类.半滑舌鳎体色异常的问题长期以来一直困扰着从业者.导致体色变化的原因多种多样,遗传因素是最根本原因.针对半滑舌鳎无眼侧黑化的研究多在环境、营养、生理、常见色素基因克隆等方...     

性类固醇激素及其受体在半滑舌鳎性腺分化发育过程中的表达与生理功能

首次用17β-雌二醇(E_2)及其受体(ERα)、睾酮受体(AR)的多克隆抗体在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevisG(u|¨)nther)性腺分化发育过程中进行免疫细胞化学定位研究。结果表明:在半滑舌鳎原始性腺中已有E_2、ERα和AR的分布和表达;卵原细胞、初级卵母细胞、精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞对E_2及ERα、AR抗体均呈现不同程度的阳性反应,在精细胞和精子中对E_2和ERα呈免疫阴性反应,而AR则一直保持较强表达,揭示了半滑舌鳎性腺中类固醇激素可能通过旁分泌调控机制刺激卵子和精子发育和成熟。性类固醇激素及其受体免疫阳性物定位在生殖细胞的胞质、胞膜和核膜等广泛部位并有表达,在性腺分化和不同发育时期的表达强度有所不同,表明其在性腺分化发育过程各阶段所起生理功能不同。这些结果为证明性类固醇激素及受体参与调节半滑舌鳎性腺分化发育提供了重要形态学新证据。     

大头鳕和半滑舌鳎RAPD分析条件的优化

大头鳕和半滑舌鳎是我国重要的两种经济鱼类,本论文以大头鳕和半滑舌鳎基因组DNA为模板,对RAPD分析中的DNA模板浓度进行了优化,确定最适浓度。并分别筛选出20条和18条扩增结果稳定性好、多态性强的随机引物用于大头鳕以及半滑舌鳎的RAPD遗传变异分析。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)幼鱼生长性状和底色的表型和遗传参数估计

半滑舌鳎是重要的经济鱼类,已经被广泛推广养殖,致力于养殖方面的研究开展了很多工作,但是对半滑舌鳎生长性状进行准确遗传评估的研究还未见报道。为了对生长性状进行准确的遗传参数估计,本次研究以80个半滑舌鳎家系为研究对象,对半滑舌鳎早期生长性状（包括个体全长、体宽和体质量）进行分析。另外还将鱼体底面纯白与否（命名为底面颜色）作为一个性状进行研究。结果表明,四个性状都属于中等遗传力（全长为0.210、体宽为0.259、体质量为0.268、底面颜色为0.362）。三个生长性状之间具有很高的遗传相关性（0.913-0.959）,表明如果三个性状进行间接选择的话,将会取得较好效果。底面颜色性状与三个生长性状均为正遗传相关,相关系数在0.241-0.353之间,由此可知,对底面颜色进行选择时,可以加强生长性状的选择效果。通过家系育种值排序,初步筛选出了生长性状优良遗传背景丰富的16个全同胞家系,将作为亲鱼繁殖后代。本研究为半滑舌鳎优良品种的成功培育提供了重要基础资料。     

半滑舌鳎des基因的表达及其启动子功能分析

利用NCBI上已经发表的半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)基因组及转录组序列,发现了半滑舌鳎两个有结蛋白(Desmin)基因(des和des-like),且des-like具有两个剪切型des-like_X1、des-like_X2。系统进化树及基因结构分析发现,半滑舌鳎的des基因和des-like基因分别与硬骨鱼的des基因和des-like基因聚为一支,物种间des和des-like氨基酸序列相似性分别在90%和85%以上。保守性与染色体共线性分析发现,半滑舌鳎的des基因和哺乳动物的des基因具有相同的起源,而其des-like基因是通过硬骨鱼的第三次全基因组复制获得的。qRT-PCR的检测分析发现,des基因在肠和心脏中表达量较高,在肌肉中只是痕量表达;而des-like基因则在心脏和肌肉中表达最高,在肠中痕量表达,说明des与des-like已经出现了功能的分化而且可能存在功能上的互补效应。有趣的是,des-like_X1只在心脏中表达,本研究推测des-like_X1对于半滑舌鳎的心脏发育具有重要作用。des基因呈现母源性表达,而des-like在胚胎发育早期表达量较低,从神经胚后表达量开始升高,此时是肌节与心脏发育的时期,说明des-like可能参与胚胎发育时期的肌节与心肌发育。此外,通过PCR克隆了半滑舌鳎结蛋白基因不同长度的启动子片段,并对其进行启动活性分析。结果表明,半滑舌鳎des基因ATG上游长度为667 bp的片段是其核心启动子,为进一步研究des基因的功能奠定了基础。     

基于GBS技术的半滑舌鳎野生与养殖群体遗传多样性分析

目前半滑舌鳎的人工繁育中普遍存在近亲繁殖现象,种质资源和优良性状无法保障,关于半滑舌鳎野生群体和养殖群体的群体结构、混杂程度、遗传多样性分析等研究工作近10a内没有持续跟进,随着大量的半滑舌鳎人工繁育苗种增殖放流入海,野生和养殖种群的混杂程度有待评估。本研究对半滑舌鳎3个海捕野生群体和3个养殖群体进行遗传多样性分析和种质资源状况研究,通过GBS技术对87个半滑舌鳎样本进行测序,产生的高质量序列数据量为55.12Gb,共获563109个高质量的SNP位点用于遗传多样性分析。通过SNP分析遗传多样性发现,野生群体的遗传多样性略高于养殖群体,个别养殖群体高于野生群体,说明近年来增殖放流对野生群体的遗传多样性有所影响,遗传距离最远的是天津野生群体和河北养殖群体。在种群分化方面, 6个群体间不存在明显分化,尚未形成明显的地理隔离,不过聚类分析还是可以把野生群体和养殖群体分成两个亚群。本研究发现了一些高分化位点,计划通过设计引物扩增该段序列找出能够区分野生和养殖群体的候选标记。     

中国对虾早期性别分化研究

自20世纪80年代初期，对虾的工厂化育苗获得成功，使对虾养殖业得到长足的发展。为此，科学家们围绕对虾人工养殖，在对虾的性腺发育、性腺成熟等方面进行了研究(洪水根等，1988；李怀梅等，1994)。由于养殖水域的过度开发，养殖环境的恶化，养殖种类的病害越来越严重地影响着水产养殖业的发展。显然，要维持水产养殖业的持续发展，必须通过一些遗传改良技术对现有养殖品种进行遗传改良，从而获得性状优良的养殖品种。目前较为行之有效的方法是对对虾的性别进行控制，获得对虾雌性比例高的种群，才能有效地提高养殖产量，因而对对虾性别控制研究具有重要的意义。脊椎动物激素可引起鱼类发生性别反转，但是，对对虾的性别反转不起作用。利用激素饲喂或浸泡幼小动物可以引起性反转，已完成性分化的鱼苗不能进行性反转，只能抑制或促进性别特征的发育。促雄腺对对虾的外部性征发育起着重要的作用(李富花等，1996)，对对虾早期性别分化进行研究是成功进行人工性别控制的基础。目前有关对虾早期性别分化的研究报道很少(尹左芬等，1986；Nakamura，1992)。本文利用扫描电镜和组织学切片观察相结合的方法，研究了中国对虾的早期性别分化情况，为中国对虾性别控制硏究奠定了基础。     

程序化设计的简并引物克隆半滑舌鳎CYP17基因

采用1种新的简并引物设计方法--CODEHOP法来克隆半滑舌鳎CYP17基因.该法结合NCBI、Blastp、BlockMaker、CODEHOP等生物信息学资源和DNAMAN、Oligo6.0等生物软件,程序性设计半滑舌鳎CYP17基因的CODEHOP引物,从半滑舌鳎卵巢组织中成功克隆了CYP17基因,该基因片段与其它物种的CYP17家族具有较高的同源性,经鉴定,该基因属于整个脊椎动物的CYP17基因群,尤其是鱼类亚群.实验结果表明,程序性设计的简并引物较传统简并引物特异性更高,假阳性率少,更有利于实验成功.     

半滑舌鳎肾脏组织结构与细胞种类研究

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是中国重要的海水养殖鱼类品种,目前对于其肾脏结构与细胞种类的研究较少。本研究以半滑舌鳎肾脏为研究对象,通过切片技术、免疫组织化学与显微镜观察,描述半滑舌鳎肾脏结构与细胞分布情况。结果显示,半滑舌鳎的肾脏可以分为头肾与体肾两部分;头肾较小,具有独立的结构,位于肾脏前部,靠近脑,形态上呈分叉状;头肾由淋巴髓样细胞构成,无肾小球等分泌结构,免疫细胞丰富,包括淋巴细胞、单核细胞、颗粒细胞,是半滑舌鳎免疫细胞的主要生发部位之一,是免疫系统的重要组成;半滑舌鳎的体肾与头肾后部分叉处相连,呈纺锤状,紧贴腹腔背部,向后延伸;体肾主要由肾单位组成,有丰富的肾小囊、近曲小管、远曲小管和集合管结构,表明其具有排泄功能。     

半滑舌鳎和塞内加尔鳎养殖群体遗传变异的RAPD分析

采用RAPD方法对半滑舌鳎和塞内加尔鳎的养殖群体进行遗传变异分析。从78条随机引物中筛选出20条用于群体遗传学分析,2个群体共扩增出260条DNA片段,其中半滑舌鳎187条,塞内加尔鳎180条,片段大小为200-2 000 bp。半滑舌鳎和塞内加尔鳎养殖群体的多态片段比例分别为63.10%和60.56%,Nei的多样性指数和Shannon的信息指数分别为0.266 4和0.237 5,0.385 2和0.349 8。与其它鲆鲽鱼类养殖群体相比,半滑舌鳎和塞内加尔鳎养殖群体的遗传多样性水平略低;2种鱼群体间的遗传相似性系数和遗传距离分别为0.458 3和0.723 1,它们的遗传变异主要来自群体内。     

水生经济动物性别遗传基础及其鉴定方式研究进展

部分水生经济动物具有性别二态性,这种特性与养殖品质、商业价值相关。与哺乳动物不同,水生动物不具有明显的性征,在育种时难以识别亲本性别,会造成额外的劳动力和培育成本。该文主要围绕水生经济动物性别遗传基础及其鉴定方式,综述了水生经济动物的性别二态现象、常见的性别鉴定方式以及决定基因,以期为种质资源保护和良种选育提供理论参考。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)GnRHR基因全长cDNA 的克隆与组织表达分析

采用同源克隆和末端快速扩增(RACE)方法, 克隆了半滑舌鳎中 GnRHR 全长 cDNA。通过基因全长以及推断的氨基酸序列分析, 得知该序列包含一个 7tm-1 保守结构域, 为 G 蛋白偶联受体家族成员。利用 PHYLIP 3.5c 邻位相连法以及 DNAstar 中的 CLUSTAL W 方法对相应的氨基酸序列进行了聚类分析和序列相似度分析。结果表明, 半滑舌鳎 GnRHR 鳉 与鲈鱼、琥珀鱼、虹鳟以及青 等鱼类中的 GnRHR聚为一支, 亲缘关系较近, 且相似度较高, 分别为 90.1%、 89.7%、 79.0%以及 78.3%, 而与高等哺乳动物人、小鼠相似性仅分别为 18.8%和 16.2%, 亲缘关系较远。应用半定量 RT-PCR 技术分析其组织表达, 发现 GnRHR 广泛表达于各个组织, 但表达量差异较大, 在性腺、脑和肾中表达量较高, 其它组织较弱。     

渤海湾半滑舌鳎及焦氏舌鳎的鱼卵和仔稚鱼的形态

半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis Günther和焦氏舌鳎C.joyneri Günther 均隶属于舌鳎科Cyonglossidae的舌鳎属Cynoglossus,系广泛分布在我国近海的底层鱼类。它们具有一定的经济价值。其中半滑舌鳎是该属中个体较大的种类,最大体长可达800毫米以上。素有名贵鱼类之称。惟产量不高。该类鱼多栖息在海湾水域,洄游距离短,活动范围小,是适合增养殖的对象之一。 关于这两种舌鳎的早期形态资料迄今尚未     

半滑舌鳎IGF1基因编码区的多态性与生长性状及表达的相关性分析

胰岛素样生长因子1(IGF1)在鱼类生长内分泌调节过程中发挥着重要的调控作用。本研究检测了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)IGF1基因外显子的单核苷酸多态性(SNPs),分析其基因型与生长性状、血液生化指标的关系及基因表达的相关性。结果显示,IGF1基因外显子5的884bp处一个位点发生突变,此突变处碱基C变为A,即C884A,此突变发生于终止密码子之后,并且发生在WD40结构域,可能会对基因的转录、表达和生长性状产生影响。此位点与体重(P0.05)、去内脏重(P0.05)呈显著相关性,AA基因型的体重和去内脏重显著高于AB基因型(P0.05),AA基因型的尿素含量显著大于AB基因型(P0.05),AA基因型的mRNA表达量也显著高于AB基因型(P0.05)。研究表明,IGF1基因编码区的多态性对半滑舌鳎的生长性状、血液生化指标和基因表达有显著影响,IGF1基因可以作为选择育种的一种分子标记,从遗传学的角度辅助半滑舌鳎优良品种的分子选育。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)血浆性类固醇激素表达与卵巢发育及温光调控的关系研究

采用放射免疫法(RIA)、组织切片技术和形态测量法首次系统研究了人工养殖条件下半滑舌鳎亲鱼卵巢的年周期发育过程中血浆中性类固醇激素[雌二醇(E<,2>)和睾酮(T)]的表达规律与性腺发育[组织结构、性腺指数(GSI)、肥满度(CF)和肝脏指数(HSI)]及温度和光周期调控的关系.结果表明,半滑舌鳎属于非同步分批产卵类型...     

半滑舌鳎稚鱼脂肪分解关键酶基因的克隆及饲料中脂肪水平对其表达的调控

克隆了半滑舌鳎脂肪分解关键酶基因即激素敏感脂肪酶(Hormone-sensitive lipase,HSL)和脂肪甘油三酯脂肪酶(Adipose triglyceride lipase,ATGL)cDNA部分序列,并探讨了饲料中脂肪水平对半滑舌鳎稚鱼HSL及ATGL基因表达的影响。克隆所得到的HSL和ATGL片段长度分别为589bp和581bp,序列和系统进化分析表明半滑舌鳎的HSL和ATGL与大部分鱼类具有较高的同源性。采用不同水平的鱼油配制成5种不同脂肪水平(6.68%、9.84%、13.47%、17.89%和21.88%干物质)的等氮饲料,饲养35日龄半滑舌鳎稚鱼30d,养殖过程中每天饱食投喂5次,养殖实验结束后采用实时荧光定量PCR分别测定各处理稚鱼内脏团的HSL及ATGL mRNA相对表达量。结果表明,高脂饲料组(21.88%)显著促进了半滑舌鳎稚鱼内脏团HSL基因的表达(P0.05),但饲料脂肪水平对于半滑舌鳎稚鱼内脏团的ATGL表达量未产生显著影响(P0.05)。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)雌雄性腺的差异转录组分析

三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)是我国东海海域具有重要经济价值的蟹类。为探讨雌雄梭子蟹性腺基因表达差异,挖掘与性腺发育相关基因,利用高通量测序技术对三疣梭子蟹雌雄性腺进行测序和生物信息学分析,为进一步研究其性腺发育及性别分化机制提供基础。测序结果经denovo组装共获得192848个转录本,130054个unigene。差异表达分析发现,其中101742个unigene上调,37588个unigene下调。在差异表达数据库中筛选出EcR、RXR、VTG等6个可能参与三疣梭子蟹的性腺分化发育的基因,并利用荧光定量PCR验证其在雌雄性腺中的表达情况,验证结果与转录组测序结果基本一致,为深入研究三疣梭子蟹性腺分化发育调控分子机理和相关功能基因提供了重要的基因数据资源。