利用酵母双杂交研究铜绿微囊藻生物钟蛋白KaiB的自身相互作用

从铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)PCC7820中克隆了生物钟基因kaiB,并将其克隆入酵母双杂交系统的两个质粒pGADT7和pGBKT7中。经测序验证后,将重组质粒pGADT7-kaiB和pGBKT7-kaiB转化酵母菌AH109进行自激活性和自身相互作用的检测和验证。结果表明,铜绿微囊藻生物钟蛋白KaiB无自激活性,KaiB蛋白自身能发生相互作用。因此,可用KaiB蛋白为诱饵利用酵母双杂交系统筛选文库钓取与KaiB发生相互作用的蛋白。     

对虾白斑综合症病毒VP37基因诱饵重组载体的构建、转化与自激活作用检测

把对虾白斑综合症病毒(White syndrome spot virus,WSSV)黏附蛋白VP37的基因C末端截去102个碱基后设计了一对引物,通过PCR扩增出目的片段。用其构建酵母双杂交诱饵载体,并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用和自激活活性。结果获得截短的VP37基因片段,并成功克隆入酵母双杂交系统PGBKT7 DNA-BD载体中,测序结果表明序列完全正确。把重组载体转化酵母菌AH109并检测自激活作用。结果显示表达的融合蛋白没有激活ADE2,HIS3这2个报告基因,但激活了MEL1,该融合蛋白对酵母菌AH109无毒性。可利用其它2种报告基因将其应用于酵母双杂交系统,筛选cDNA文库中与之相互作用的基因。     

虾夷扇贝不同性别类型2 个Dmrt基因DM 结构域分析

为探讨虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)性别决定和雌雄同体形成的分子机制,利用兼并引物,以闭壳肌基因组DNA为实验材料,扩增和克隆了虾夷扇贝Dmrt基因的DM结构域,雌性、雄性和雌雄同体3种性别共获得2个具有不同DM序列的克隆,序列长度均为141bp,分别命名为Py Dmrt3和Py Dmrt4。Py Dmrt3在3种性别类型中均有克隆,而雄性中还克隆出Py Dmrt4。结果表明,在虾夷扇贝不同性别中,Dmrt基因家族的成员可能会有不同;雄性py Dmrt3的DM结构域核苷酸和氨基酸变异频率高,其次是雌雄同体,雌性的较保守,与其他软体动物DM结构域比对,该基因家族在进化上仍然高度保守,由此推测,部分雄性可能是发生了性逆转的雌雄同体,这种较高的变异性可能也是雌雄同体的一个特点,Py Dmrt4可能参与调控雄性性别的形成。     

锯缘青蟹(Scylla serrata)呼肠孤病毒5个结构蛋白互作分析

采用酵母双杂交系统,对青蟹呼肠孤病毒(Scylla serrata reovirus)5个结构蛋白(VP3,VP6,VP9,VP11,VP12)间的双向互作进行了分析。将5个结构蛋白对应的ORF分别亚克隆至诱饵载体p GBKT7和猎物载体p GADT7,成功构建了10个酵母双杂交重组载体。将重组诱饵载体或重组捕获载体转化至酵母菌Y2H Gold中进行自激活检测,结果显示5个结构蛋白均不能激活酵母菌报告基因HIS3的表达,表明5个病毒蛋白均不具有自激活活性。通过酵母双杂交实验,从5个结构蛋白25个可能性互作对中,共筛选出2个双向互作对(VP11VP6,VP11VP12)和3个自身互作对(VP3VP3,VP11VP11,VP12VP12)。本研究是有关Ss RV结构蛋白互作的首次报道。     

菲律宾蛤仔雌激素相关受体基因克隆及互作蛋白筛选

采用RACE技术克隆鉴定了菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)雌激素相关受体(rpERR)基因的cDNA序列。rpERR基因全长序列为2 340 bp,开放阅读框ORF为1 453 bp,编码484个氨基酸,理论分子量为54.5 kDa。氨基酸序列同源性分析表明菲律宾蛤仔ERR与脊椎动物ERRγ同源性相近,与其他无脊椎动物聚为一个分支,与虾夷扇贝的ERR同源性最高。rpERR含有核受体超家族通常的6个结构域。通过qRT-PCR技术检测发现ERR在菲律宾蛤仔的鳃、消化盲囊、性腺、闭壳肌和外套膜组织中各组织中均有表达,在性腺中的表达量最高。运用酵母双杂交技术对菲律宾蛤仔酵母cDNA文库进行互作蛋白筛选、测序及生物信息学分析,获得了菲律宾蛤仔ERR互作蛋白为cAMP应答元件结合蛋白。根据rpERR的生物信息学分析、各组织中表达特征以及互作蛋白推测其功能可能涉及性腺发育与物质能量代谢等重要生物学过程的调节。     

栉孔扇贝、虾夷扇贝及其杂交子代线粒体COI和Cytb基因遗传多样性分析

为了解栉孔扇贝(Chlamys farreri)、虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)及其杂交子代(F1)的种群遗传多样性和遗传结构,对3个群体的线粒体COI和Cytb基因的部分序列进行了扩增和分析。经比对分别获得781bp和725bp核苷酸片段,74个样本共检测到47个单倍型;F1群体的单倍型数、单倍型多样性指数、核苷酸多样性及平均核苷酸差异数都是最高的,而双亲的较低;F1和栉孔扇贝间的遗传距离最小,其次为栉孔扇贝和虾夷扇贝群体之间,F1和虾夷扇贝群体之间的遗传距离最大;F1和栉孔扇贝之间的遗传分化系数较小而两者间的基因流比较大,F1和栉孔扇贝与虾夷扇贝之间的遗传分化系数较大而基因流较小,说明栉孔扇贝和虾夷扇贝群体群体很早就发生了遗传分化;采用UPGMA法和简化的中介网络法构建的系统树表明,3个群体的所有个体被分为2个族群,栉孔扇贝和F1交叉聚为一类,虾夷扇贝独自聚为一类,2个分支间没有交叉;使用特异性引物分别对3个群体进行PCR扩增检验,结果栉孔扇贝的特异引物能在杂交子代中扩增,而虾夷扇贝的特异引物不能在子代中扩增出条带,说明栉孔扇贝和虾夷扇贝杂交,其子代的线粒体遗传模式为严格的母系遗传。本研究结果表明杂种优势的形成与线粒体遗传多样性的变化有关。     

控制虾夷扇贝闭壳肌积累类胡萝卜素相关基因的筛查

利用抑制性差减杂交技术(Suppression subtractive hybridization,SSH)对虾夷扇贝闭壳肌积累类胡萝卜素相关基因进行筛查和分析。以虾夷扇贝橘红色闭壳肌和白色闭壳肌cDNA构建正反向差减文库,结合454测序技术在正向差减文库中测序得到2 640条序列,拼接得到50个contigs(重叠群);反向差减文库中测序得到2 496条序列,拼接得到187个contigs。经过同源性比对分析,共获得150多个差异表达基因,从中选择3种清道夫受体SRB1、SRF2和SRCR作为候选基因进行研究,对其在虾夷扇贝各组织中的表达量水平进行检测,初步阐述了其在虾夷扇贝中的组织表达规律。根据结果推测在虾夷扇贝橘红色闭壳肌中,清道夫受体有可能是调节类胡萝卜素累积和转运的关键基因。本研究为虾夷扇贝闭壳肌类胡萝卜素累积相关通路的探索提供了初步研究的基础数据。     

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)呼肠孤病毒(GCRV)VP6相互作用蛋白的筛选

为筛选与草鱼呼肠孤病毒GCRV096 VP6发生相互作用的宿主蛋白,先将VP6基因的PCR扩增产物,克隆至酵母表达载体p GBKT7以构建其诱饵质粒(p GBKT7-VP6);再将酵母菌Y2HGold(含p GBKT7-VP6)与酵母菌Y187[含草鱼肾脏细胞(CIK)c DNA文库质粒]进行人工诱导融合,然后经选择培养筛选阳性克隆。结果共筛选到4株阳性克隆,经测序、生物信息学分析,分别属于两条不同的核苷酸序列,其中之一所编码的产物与GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)同源性较高。可见,该酶极可能在GCRV096侵染宿主的初期发挥着重要作用。     

条斑紫菜酵母双杂交文库的构建及PyMAPK5互作蛋白的筛选

为进一步研究条斑紫菜促分裂原活化激酶家族PyMAPK5的下游互作蛋白,理解其生物学功能,本研究通过酵母双杂交的方法进行其相互作用蛋白的筛选。提取不同温度和失水逆境胁迫下的RNA,利用Invitrogen体系构建条斑紫菜酵母双杂交cDNA文库,其库容为1.44×107CFU,重组率为91.8%。以pGBKT7-PyMAPK5为诱饵蛋白载体,利用共转化方法,从文库中筛选得到26个与PyMAPK5互作的候选蛋白。候选蛋白集中在光系统II相关蛋白、捕光蛋白、微管蛋白、ATP酶、GTP结合蛋白及假设蛋白等。微管蛋白、捕光蛋白、光系统II蛋白一对一验证结果为阳性,表明在酵母体内存在互作。本研究为阐明条斑紫菜PyMAPK5与其互作蛋白的关系及解析PyMAPK5下游作用机制奠定了基础。     

酵母双杂交系统用于WSSV结构蛋白VP39相互作用的宿主蛋白基因的初步研究

为研究WSSV的结构蛋白VP39相关蛋白的基因,应用酵母双杂交系统筛选中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)鳃细胞全长cDNA文库。将构建好的VP39基因的重组载体pGBKT7-VP39转化酵母Y187后,与含文库质粒的酵母株AH109融合,在营养缺陷培养基上进行反复筛选,得到1个阳性克隆,测序并进行生物信息学分析。结果显示,此cDNA片段在数据库中是新序列,该蛋白在WSSV识别并结合宿主的过程中所起的作用还有待于进一步研究。本实验成功筛选了VP39相关蛋白的cDNA片段,为进一步研究WSSV的致病机理奠定了基础。     

性类固醇激素在虾夷扇贝性腺发育周期的分布

性类固醇激素不仅在脊椎动物性别分化、生殖、发育等过程中发挥重要作用,在部分软体动物中也参与生殖调控。本文分析了3种主要性类固醇激素(孕酮、睾酮和雌二醇)在虾夷扇贝性腺发育过程中的变化情况。首先通过组织学方法确定虾夷扇贝性腺4个发育阶段的周年分布:休止期(7—9月)、增殖期(10—12月)、生长期(1—2月)、成熟期(1—6月)。之后,采用酶联免疫吸附实验测定虾夷扇贝性腺各发育阶段中性类固醇激素的含量。结果表明,性腺中激素含量呈现孕酮>雌二醇>睾酮,它们分别约占激素总含量的60%、30%、10%;精巢中3种激素含量均呈显著正相关,但卵巢中仅孕酮和睾酮之间显著相关;研究还发现,虽然3种激素含量在性别、发育阶段之间差异均不显著,但睾酮比例和雌二醇/睾酮在生长期的精巢和卵巢之间差异显著,精巢睾酮比例高于卵巢,而卵巢的雌二醇/睾酮高于精巢。以上结果表明,性类固醇激素很可能参与虾夷扇贝生殖调控,在性腺发育、配子发生过程中发挥重要作用。     

雅浦海沟南缘铁锰结核矿物与地球化学特征及其成因研究

本文采用X射线衍射、全岩地球化学和电子探针等测试方法,对雅浦海沟南部附近海域获得的铁锰结核样品进行了显微构造、矿物和地球化学分析,并探讨了其成因。结果表明:铁锰结核的显微构造主要包括平行纹层构造、柱状构造、叠层状构造和同心环状构造;显微构造和探针结果显示铁锰结核在生长初期处于底部海洋动力比较强烈的环境,后期生长环境逐渐趋于稳定;铁锰结核的矿物组分以水羟锰矿、钠水锰矿、石英和钙十字石为主;样品中Fe、Mn元素含量较高且含量比较接近,Cu、Co、Ni和REE相对富集,REE分布模式整体比较平缓并都出现较强的Ce正异常和重稀土元素亏损现象;文中两块铁锰结核都为水成成因,成矿物质主要来自同期的海水沉淀,同时也受一定海底火山物质和陆源风尘物质的影响。     

南海西缘泰国晚新生代玄武岩岩浆过程研究及其地质意义

泰国晚新生代玄武质岩石主要为碱玄岩、玄武岩、粗玄岩和玄武粗安岩,属于碱性系列,呈现似洋岛玄武岩的地球化学特征,与南海地区其他位置的同时代玄武岩特征一致。本研究玄武岩的斑晶矿物主要为橄榄石、斜长石及少量的单斜辉石。利用全岩组分推算,泰国玄武岩源区岩性为石榴石辉石岩,与越南、北部湾等地同期玄武岩的岩性类似。本研究利用PRIMELT软件模拟计算了泰国晚新生代玄武岩的原始岩浆组分。利用反演的原始岩浆组分计算出本区域的玄武岩熔融温度范围为1 425～1 442℃,熔融压力范围为22.3～27.4 kbar,类似于海南岛(1 420～1 530℃,18～32 kbar)和越南南部地区(1 470～1 480℃,29.7～32.8 kbar)。本区域的地幔潜在温度为1 448～1 467℃,与越南南部(1 468～1 490℃)类似,稍低于海南岛北部(1 420～1 530℃)。总体上,泰国晚新生代玄武岩与南海地区其他区域同时代玄武岩的岩石地球化学特征和岩浆过程类似,它们的深部地球动力学背景均与海南地幔柱有关。     

沙尘和灰霾对西北太平洋浮游植物群落结构变化的影响

通过在西北太平洋黑潮亲潮混合区(E02和E10M)和副热带寡营养区(M1和M1B)开展的船基围隔培养实验,探究了不同海域表层海水中浮游植物对沙尘和灰霾添加的响应,以及浮游植物群落结构的变化。结果表明,黑潮亲潮混合区浮游植物可能受铁(Fe)限制,副热带寡营养区浮游植物主要受氮(N)限制。沙尘和灰霾添加均可以促进浮游植物生长,并可使浮游植物的粒级结构分布发生明显变化。在黑潮亲潮混合区,沙尘添加组使小型浮游植物对总叶绿素a的贡献率(C_Micro)由～10%上升至～55%,超微型浮游植物对总叶绿素a的贡献率(C_Pico)由～70%下降至～20%,但在培养实验过程中,各粒级浮游植物对总叶绿素a贡献率的变化量与沙尘添加量无明显的相关关系,这种现象的原因可能是不同量的沙尘添加均可为浮游植物的生长提供较充足的Fe导致的。在副热带寡营养区,沙尘或灰霾添加组的C_Micro由～10%上升至～35%,C_Pico由～70%下降至～55%～～35%,各粒级浮游植物对总叶绿素a贡献率的变化与沙尘或灰霾添加量呈线性相关关系,表明浮游植物的生长对沙尘或灰霾的N供给量具有较高的敏感性。     

逐步添加法制备单链环状DNA的影响因素探究

单链环状DNA在纳米技术、分子生物学和医药学等领域具有广泛的应用前景,但难以大量制备一直是制约其研究和应用的难题之一。本文针对一种高效大量制备单链环状DNA的方法-逐步添加法,系统地探究了逐步添加法中各主要条件对制备单链环状DNA的影响,确定了逐步添加法中的主要关键条件为:T4DNA连接酶Buffer浓度、单链DNA浓度、添加间隔时间、温度和Splint GC含量。以72nt的核酸链为例,使用逐步添加法将单链环状DNA的制备得率提高至99%,产量与常用的一步法相比提高至4.9倍。本研究为高效、大量制备单链环状DNA提供了指导,为以单链环状DNA为基础的研究奠定了基础。     

电渗析-厌氧膜生物反应器处理含甘油高盐废水

利用电渗析(ED)-厌氧膜生物反应器(AnMBR)处理含甘油高盐废水,电渗析过程脱盐率达99%以上,平均能耗为616kJ/L,电流效率91.4%。AnMBR处理含甘油废水过程中COD去除率达95%,膜在COD去除中发挥了重要作用,其COD截留率为41%~81%。期间发生膜污染现象,跨膜压差快速上升并最终稳定在0.040~0.043MPa。AnMBR沼气中甲烷比例为78.3%,甘油比产甲烷速率0.252LCH4/g甘油。甘油在厌氧条件下首先转变成丙酸,然后再被分解。研究证明,在厌氧处理甘油的过程中有机负荷不宜过大,否则会造成严重的挥发性脂肪酸(VFA)积累,尤其是丙酸的积累。此外,CaCl2浓度与甘油转化关系的实验结果表明:厌氧菌群受到4%以下盐度冲击时能在6d内恢复活性,受到6%以上盐度冲击将导致活性恢复缓慢。因此,厌氧反应器进水盐度需控制在4%以内。研究还发现VFA中丙酸所占比例随着盐度升高逐渐下降,说明高盐度会使厌氧菌活性受到抑制,影响甘油降解。     

基于WGP物理作图法的虾夷扇贝Fosmid克隆混池策略及解码率研究

利用全基因组解析(Whole genome profiling,WGP)法进行物理图谱构建时,克隆混池策略及克隆解码率的高低是影响物理图谱构建效果的关键性因素。如何通过调控混合克隆数目,来平衡克隆解码率和测序的成本,是利用WGP法构建物理图谱的亟需解决的问题。本研究利用虾夷扇贝Fosmid文库的部分克隆,使用序列特异性标签的WGP方法,对虾夷扇贝物理图谱构建方法的混池策略及克隆解码率进行了初步研究。通过计算机分别模拟了384 N(N=1,2…24)孔培养板内的克隆混合,计算出了对应混合尺度下BsaXI和FspEI两种酶的克隆解码率。以该模拟数据作为参照,最终分别以4、8、12、16张384孔培养板内的克隆混合构建了克隆超级池;并利用2b-RAD技术构建了基于BsaXI和FspEI两种限制性内切酶的测序文库。通过对酶切标签数据的分析,成功实现了混合池内的克隆解码,且在利用两种酶对应的酶切标签联合解码后,联合解码率达到84%以上。本研究最终确定了由8张384孔培养板混合的混池策略及利用BsaXI和FspEI两种酶切标签进行联合克隆解码,为后期利用WGP方法构建虾夷扇贝物理图谱提供了参考方案。     

长江流域颗粒态金属元素的分布及其主要影响因素

为了解三峡工程建成后长江流域颗粒物的风化状况及颗粒态重金属的变化规律和污染程度,于2009年8—10月对长江干流及主要南、北支流悬浮颗粒进行采样调查。本文采用电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)对颗粒态常量金属(Al、Ca、Fe、K、Na)及重金属(Cr、Zn、Cu、Ni、V)进行测定。利用化学风化指数(CIA)估算长江流域颗粒物的风化程度,结果表明:长江干流的化学风化指数在62~75之间,风化程度下游高于上游,气温、岩石类型及地势是主要的影响因素。长江流域南、北支流颗粒物CIA平均值分别为71和66,主要受岩石类型和南北气候影响,与三峡工程前相比CIA值无明显变化。利用富集因子(EF)估算长江流域颗粒态重金属污染程度,结果表明:总体长江干流及北岸支流污染较轻,仅Cu、Zn处于中等程度富集。南岸支流湘江、螳螂川颗粒态Cu、Zn显著污染,主要受采矿及人为排污的影响。采用因子分析对干流上、下游颗粒态金属的组成进行来源分析,提取了三个因子,结果表明主要受自然来源影响,同时也受到人类活动(大坝拦截、排污)及化学风化影响。     

用于海洋沉积物中厌氧氨氧化细菌分子生态学研究的引物比较

为比较厌氧氨氧化细菌16SrRNA基因的2对特异性引物(Amx368F/Amx820R、Brod541F/Amx820R)在其分子生态学研究方面的优点与不足,本研究采用高通量测序和qPCR技术对长江口及其邻近海域沉积物中厌氧氨氧化细菌细菌的群落组成、多样性和丰度进行比较分析,结果表明,引物Amx368F/Amx820R特异性较高,能够较为完整地反映沉积物中厌氧氨氧化细菌的多样性信息,且其覆盖的厌氧氨氧化细菌丰度与功能基因hzo丰度正相关(P<0.01);而引物Brod541F/Amx820R特异性较低,覆盖部分厌氧氨氧化细菌及其他多个门的细菌,其量化的厌氧氨氧化细菌与功能基因hzo丰度无明显相关关系(P>0.05)。因此,引物Amx368F/Amx820R能够更加真实地反映厌氧氨氧化细菌在海洋沉积物中的群落特征,在其分子生态学研究中更具优势。     

海洋酸化对碳、氮和硫循环的影响

工业革命以来,大气CO_2浓度呈现快速增加的趋势,随之而来的问题是海洋酸化的程度越来越明显。与工业革命前相比,目前海洋表层海水pH降低了0.1个单位,到本世纪末估计会降低0.4个pH单位。本文综述了海洋酸化对碳、氮和硫循环的影响,包括碳循环中的溶解度泵、碳酸盐泵、软组织泵和微型生物碳泵,海洋酸化对氮循环中氮的固定、硝化作用、反硝化作用、N_2O的产生的影响,海洋酸化与硫循环中二甲基硫(DMS)的产生及其与食物网结构之间的关系。海洋酸化无论是以直接或间接方式均会在一定程度上对碳、氮和硫的生物地球化学循环产生影响,最终改变海洋系统的结构与功能。在自然界中,海洋酸化不是一个独立的过程,而是与其他物理、化学、生物变化因素相偶联共同作用于碳、氮和硫的生物地球化学循环。