仿刺参(Apostichopus japonicus)肠道菌群的地域性差异与共性研究

作为高附加值水产养殖物种,仿刺参(Apostichopusjaponicus)的病害和病原微生物研究受到人们关注,但对其共生菌群组成、地域性差异及与水体环境间交流等方面的研究仍十分有限。本研究收集了来自中国、日本和韩国共786例仿刺参肠道、水体和沉积物的16SrRNA基因高通量测序数据,比较细菌群落组成以探寻仿刺参肠道微生物与环境和地域之间的关系。分析结果显示,尽管仿刺参肠道、水体和沉积物中各细菌组分的比例不同,但共有菌属甚多,表明仿刺参可以从外界环境大量获取微生物。与水体和沉积物的样本类型相比,仿刺参肠道微生物多样性最低且所含菌属的种类最少,进一步提示仿刺参肠道对外界来源的微生物进行了富集和筛选,其中变形细菌门(Proteobacteria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)和利斯顿氏菌属(Listonella)的富集尤为明显。中国、日本和韩国来源的仿刺参肠道微生物Alpha多样性无显著差异,但主坐标分析将它们聚为不同的簇,且各自拥有独特的细菌门类。比较中国渤海和黄海两个海区的仿刺参肠道菌群获得了相似的结果,体现出广泛的地域性差异。基于细菌分类的功能预测发现三个国家仿刺参肠道微生物均具有发酵、化能异养和需氧化能异养功能,表明共生菌群在功能上存在共性,并可能对宿主生理产生相同的作用。本研究揭示了仿刺参肠道微生物在不同地域之间存在明显差异,并且与水体环境之间存在着密切的联系,能够为仿刺参共生微生物及其与宿主健康的相关性研究提供基础性资料,并可能在自然循环过程和渔业资源保护过程中发挥作用。     

仿刺参生殖腺发生与早期分化的组织学观察

采用组织学方法,初步研究了仿刺参(Apostichopus japonicus Selenka)生殖腺的发生及早期分化的过程。结果表明,仿刺参的生殖腺位于背肠系膜处,在体长为0.1 cm的稚参中出现含有约10个原生殖细胞的原始生殖腺;体长0.5cm的稚参,原始生殖腺的中央腔明显,生殖腺初具雏形;体长3 cm的幼参中,生殖腺出现二分枝并且生殖腺上皮出现分层结构,内层为排列较松散的生殖细胞,外层为排列紧密的个体较小的上皮样细胞,此时仿刺参生殖腺的基本结构已经具备;幼参体长4 cm时,生殖腺的部分管壁内层细胞向内发生褶皱,形成以生殖细胞为主的嵴状突起,随着发育的进行,生殖腺管腔内侧的嵴状突起更加密集。     

扩增仿刺参SSR和ISSR指纹技术的初步研究

利用SSR(Simple Sequence Repeats)技术和ISSR(Inter Simple Sequence Repeats)技术对仿刺参(Apostichopus Japonicus)进行了PCR扩增。探索了刺参基因组DNA的提取方法。为了得到更好的PCR扩增结果,对引物浓度、Mg2 浓度、dNTP浓度、模板浓度、Taq浓度和退火温度及循环数等方面进行了研究,从而摸索出一个适合刺参SSR和ISSR分析的反应体系和反应条件,并对PCR反应中的一些特定影响因子进行了分析。     

仿刺参骨片的种类和形态学研究

以大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室培育的已明确年龄(1龄、2龄、3龄)的仿刺参(Apostichopus japonicus)为实验材料,采用原位压片法对仿刺参棘、体壁、触手、管足、纵肌、呼吸树、肠7种组织标本进行骨片形态学观察和SPSS统计分析,获得了不同年龄、组织仿刺参中各类型骨片的相对比例。结果表明,原位压片法得到的骨片较Na Cl O法结构损坏较小,且能观察到骨片在组织中的分布。仿刺参各组织中存在桌形体、扣形体、杆状体、花纹状体、复合盘状骨片和长孔状体6种主要骨片类型。体壁中主要骨片类型为扣形体和桌形体;棘和触手中主要骨片类型为扣形体、桌形体和杆状体;管足中主要骨片类型为特有的复合盘状骨片、扣形体和桌形体;呼吸树和肠中主要骨片类型为花纹状体;纵肌不含任何类型骨片。不同组织间相同类型骨片的形态结构一致,无组织间特异性。通过对不同年龄仿刺参各组织的骨片比较分析发现,不同年龄仿刺参相同组织中骨片比例存在差异,例如,1龄、2龄、3龄仿刺参触手中桌形体骨片的相对比例分别为11.55%±2.69%、20.76%±2.34%、3.75%±0.72%,2龄仿刺参触手中桌形体骨片的相对比例显著高于1龄、3龄仿刺参触手中桌形体骨片比例(P0.05);1龄、2龄、3龄仿刺参棘中扣形体相对比例分别为92.55%±1.98%、65.45%±1.79%、88.36%±3.08%,2龄仿刺参棘中扣形体相对比例显著低于1龄和3龄仿刺参棘中扣形体骨片比例(P0.05)。本研究为仿刺参的基础生物学研究提供资料,为仿刺参的年龄鉴别提供参考。     

不同体质量仿刺参免疫活性的研究

通过研究不同体质量仿刺参(Apostichopus japonicus)的免疫活性, 为仿刺参生长中免疫指标的建立提供依据。实验选取了50、100、150 g 左右的仿刺参各10 只, 测定其体腔细胞数量、各细胞类群比例及部分免疫酶活性。结果表明: 不同体质量的仿刺参, 其体腔细胞数量及各细胞类群、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)具有显著性变化, 而体腔液中酚氧化酶(PO)活性极低。体质量150 g左右仿刺参的细胞数量和SOD活性较其他两组都明显升高, 细胞类群也有明显变化(P<0.017), 但POD活性显著降低(P<0.05)。不同体质量的仿刺参免疫活性具有显著性差别, 说明了仿刺参免疫组分在生长过程中不断变化, 免疫防御能力在各阶段有所差别。     

池塘养殖和海上吊笼养殖仿刺参肠道菌群结构对比分析

实验采用平板分离及16S r DNA序列分析法研究池塘养殖和海上吊笼养殖仿刺参(Apostichopus japonicus)的前肠、中肠和后肠菌群结构并进行对比分析.结果显示,从海上吊笼养殖的仿刺参的肠道内分离鉴定的240株菌株分属于3个门、11个属和34个种.从池塘养殖仿刺参的肠道内分离鉴定的211株菌株分属于3个门、11个属和49个种.两种养殖模式仿刺参肠道菌群结构存在较大差异,且同一仿刺参肠道各部分之间的菌群结构也存在较大的差异.海上养殖仿刺参的肠道优势菌群为弧菌属(Vibrio)、Formosa属、希瓦氏菌属(Shewanella),池塘养殖仿刺参的肠道内优势菌群为弧菌属(Vibrio)、芽孢杆菌属(Bacillus)、喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus).两个菌群共有菌株有7个种,存在于在不同的肠道部位.两种养殖模式比较发现池塘养殖仿刺参的肠道菌群的丰富度大于海上吊笼养殖的仿刺参,且池塘养殖仿刺参肠道内芽孢杆菌(Bacillus)等益生菌的占比较高,海上吊笼养殖仿刺参分离得到较多的弧菌属(Vibrio)细菌.本研究可为南方仿刺参人工养殖中潜在益生菌的筛选提供基础资料.     

仿刺参昼夜节律相关基因的筛查和表达分析

为研究仿刺参昼伏夜出行为节律的内源性调控机制,需要先筛查出仿刺参是否具有能够调控生物节律的生物钟基因。本研究通过Blastp,将KEGG数据库中哺乳动物和果蝇的昼夜节律通路成员基因与仿刺参全基因组进行同源比对,筛选仿刺参基因组中的同源生物钟基因,并参考不同光照条件下仿刺参触手转录本数据,对相关基因在不同光照条件下的表达量进行初步分析。结果显示,在仿刺参全基因组中找到了绝大部分具有较好注释的同源候选生物钟基因,包括CLOCK(Circadian Locomotor Output Cycles Kaput)、BMAL1 (Brain and Muscle Arnt-Like 1)/CYC(Cycle)、TIM (timeless)等,但PER (Period)和DEC (class B basic helix-loop-helix protein 2/3)基因未能匹配到有效的同源基因;转录本的数据表明,在120 lx光照1 h与120 lx光照5 min比较组中(Lt1h:Lt5m),发现只有CLOCK基因具有显著的下调表达(log₂FC=-1.1209),其他生物钟...     

乳酸乳球菌XP-15对仿刺参生长、免疫及肠道菌群结构的影响

乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)是一种具有促进宿主生长、增强机体免疫力的益生菌。本研究以仿刺参(Apostichopus japonicus)为研究对象,以仿刺参源肠道分离菌株乳酸乳球菌XP-15为候选益生菌,开展菌株XP-15对仿刺参生长、免疫及肠道菌群结构的影响研究。以乳酸乳球菌XP-15投喂组为实验组(XP-15组),基础饲料投喂组为对照组(CK组),进行为期8周的养殖实验。结果显示,第1—8周,XP-15组的仿刺参肠道内的乳球菌属(Lactococcus spp.)呈现逐渐增加趋势,至第8周时占比为54.00%,明显高于CK组的7.33%,表明菌株XP-15可较好地在仿刺参肠道内定殖;于第6周取肠道进行免疫酶活力测定,结果显示,XP-15组仿刺参肠道一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase, NOS)、酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)等免疫指标显著高于CK组。于第6周采用体腔注射法进行相对免疫保护率实验,计算结果表明,投喂菌株XP-15后仿刺参在塔式...     

仿刺参采苗板上细菌的分离与鉴定

为了解仿刺参采苗板时期细菌的多样性,对分离自仿刺参采苗板上的细菌进行了分离和鉴定。应用常规生理生化鉴定、16S rDNA序列分析和构建系统发生树对其进行分子鉴定。结果表明:共分离得到19株海洋细菌,鉴定为7个属,包括短芽孢杆菌属(Brevibacillus sp.)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas sp.)、Cobetia属、肠杆菌属(Enterobacter sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、普罗威登斯菌属(Providencia sp.)和海洋螺菌属(Oceanospirillaceae sp.)。从海洋环境中分离筛选细菌对海洋资源的开发与利用具有重要意义,此外对仿刺参育苗时期进行细菌种类的鉴定有助于疾病的预防和治疗,对仿刺参的水产养殖具有一定的指导意义。     

花刺参幼参摄食和消化器官形态学和组织学研究

花刺参(Stichopus monotuberculatus)是中国热带海参中具有较高经济价值的可食用海参之一.本文以花刺参幼参为实验对象,主要研究其摄食器官触手的形态特征与消化器官肠道不同区段的组织结构.结果 显示,花刺参的口周围共有20个等长的触手,每个触手由柄部和楣状触手组成.檐状触手向外张开呈掌状,从掌心中央向...     

硫酸镁对仿刺参幼参麻醉效果的研究

本研究以硫酸镁作为麻醉剂,比较了在不同水温条件下硫酸镁对仿刺参幼参的麻醉效果,分析了不同浓度硫酸镁对仿刺参幼参的麻醉效果。实验水温设置11℃、13℃、15℃、17℃、19℃和21℃六个温度梯度,实验用仿刺参幼参规格分为大规格(L)40.26±1.84g、中规格(M)21.83±1.72g、小规格(S)11.03±1.63g。实验结果显示:1.在硫酸镁麻醉剂浓度相同时,仿刺参规格越大麻醉所需时间越长,复苏时间却越短;随着麻醉剂浓度增加,对仿刺参幼参麻醉时间相应缩短,但复苏时间呈现逐渐延长。不同浓度硫酸镁麻醉剂对不同规格仿刺参的麻醉效果具有显著差异(P0.05)。2.在水温11℃~20℃范围内,随着水温的升高,对仿刺参幼参的麻醉时间从26.13±17.78min缩短到21.47±3.52min,但复苏时间从26.13±17.78min增加到71.05±12.32min,不同水温条件下硫酸镁对仿刺参幼参麻醉效果影响显著(P0.05)。研究表明,仿刺参体重在20g以下的适宜麻醉浓度为0.1~0.25mol·L-1,体重在20g以上的适宜麻醉浓度为0.25~0.35mol·L~(-1)。     

青岛仿刺参中3种海参皂苷的分离纯化及结构鉴定

对青岛产仿刺参体内皂苷类成分进行分离及结构鉴定,确定其皂苷的主要组成及比例。应用大孔树脂,正相硅胶柱层析和半制备型HPLC对青岛产仿刺参体内的皂苷成分进行分离纯化,根据化合物的理化性质和波谱数据鉴定其结构。共分离并鉴定3种三萜皂苷类化合物,分别为Cladoloside B(1),Holotoxin A1(2)和Holotoxin B1(3)。青岛海域仿刺参体内的皂苷组成主要为Cladoloside B(1),Holotoxin A1(2)和Holotoxin B1(3),比例约为1∶4.5∶1.7。     

仿刺参不同体外标记方法效果的比较

为筛选出仿刺参(Apostichopus japonicus)体外标记方法,研究了体腔植入标记物法、体壁半包埋法、棘部及体壁穿刺法、体壁胶粘法和石灰环嵌套法。研究结果表明,前4种方法标记保留时间均未超过2 d,且有严重排异反应,影响活动和摄食,难以满足标记要求,体壁胶粘法保留时间可达2 d,且活动摄食正常,可用于短期标记。使用石灰环嵌套法标记小规格仿刺参10 d后标签保留率达到75.8%,标记大规格仿刺参3个月后标签保留率可达93%,初步确定石灰环嵌套法可作为仿刺参体外长效标记的方法。     

盐度骤变对仿刺参hsp70及hsp90基因表达的影响

为研究夏季暴雨导致的养殖池塘盐度变化对仿刺参(Apostichopus japonicus)生理的影响,在实验室内模拟野外盐度变化,采用半定量RT-PCR的方法研究了其hsp70、hsp90a及hsp90b基因的表达。实验中,盐度先以每6h降2.5的速度由30降至20;保持96h后,再以同样的速度由20升至30,随后在盐度为30条件下保持96h。在盐度变化过程中随机取样。hsp70和hsp90b基因在盐度降至20后表达量开始显著升高(P<0.05),hsp90a基因在盐度降至22.5时表达量开始显著升高(P<0.05);但保持在盐度为20条件下,3个基因的表达量均逐渐降低至初始值。在之后的盐度升高及恢复阶段,3个基因表达量均有先升高后降低的趋势,表明hsp70、hsp90a和hsp90b基因是仿刺参在盐度胁迫下的重要响应因子。     

氯化钾诱导仿刺参(Apostichopus japonicus)幼虫附着变态的研究

以不同浓度的氯化钾(KCl)溶液处理仿刺参(Apostichopus japonicus)樽形幼虫,处理不同时间后,分析KCl对仿刺参幼虫附着变态的诱导作用。结果表明,使用较低浓度的KCl溶液(10、30和50 mmol/L)分别诱导仿刺参樽形幼虫6、12和24 h均可以显著提高其附着变态率,诱导24 h附着变态率分别提高27.67%、32.67%和19.67%。较高浓度的KCl溶液(100、300和500 mmol/L)也可以诱导仿刺参幼虫附着变态,但随着KCl浓度的升高和诱导时间的延长,幼虫死亡率逐渐升高。低浓度KCl溶液,特别是在30 mmol/L诱导仿刺参幼虫12 h时,可以显著提高幼虫的附着变态率,增加发育的同步性,降低死亡率,对仿刺参幼虫变态的诱导效果较好。     

仿刺参（Apostichopus japonicus）摄食和运动器官的结构与功能

触手、管足是仿刺参（Apostichopus japonicus）的摄食和运动器官,对食物选择和生境斑块选择有着重要影响。本研究利用组织学、组织化学、透射电镜和扫描电镜技术对仿刺参触手、管足的组织结构,粘液细胞类型进行了研究,并探讨了触手和管足结构与功能的关系。研究查明了仿刺参触手柄部组织结构由外至内为角质层、上皮、疏松结缔组织、致密结缔组织、神经丛、纵肌层、间皮;触手末端与柄部结构组成基本相同,仅乳突腹面上皮加厚。管足吸盘由外自内依次为角质层、上皮、神经丛、结缔组织、端板、间皮。触手和管足细胞多含酸性粘多糖。触手乳突腹面分布有一种含有颗粒囊泡的粘液细胞,管足吸盘腹面存在有纤毛的非分泌细胞（CNS）、支持细胞（SC）、无纤毛细胞（NCS)     

温度、pH和金属离子对仿刺参蛋白酶活力影响的研究

利用分光光度计比色法测定了温度、pH值和Hg2 等9种金属离子对体长24.2cm±0.7cm仿刺参(Apostichopusjaponicus)消化道中蛋白酶活性的影响。结果表明,蛋白酶的最适温度为40℃,对热不稳定,最适pH为7.2。Hg2 ,Mn2 ,Ag ,Pb2 ,Ba2 ,Ca2 对蛋白酶的活性有抑制作用,抑制作用由强至弱依次为Hg2 >Ag >Mn2 >Pb2 >Ca2 >Ba2 ,其中Hg2 和Ag 与对照差异极显著(P﹤0.01),表现出极强的抑制作用;Cu2 ,Zn2 ,Mg2 则对酶活有一定的促进作用,其促进作用大小依次为Mg2 >Zn2 >Cu2 ,Mg2 与对照差异显著(P﹤0.05)。     

薄荷醇对仿刺参幼参的麻醉效果

为确立一种准确测量仿刺参体长的方法,选用薄荷醇(menthol)为麻醉剂,在不同麻醉浓度条件下,观察了对仿刺参(Apostichopus japonicus)幼参的麻醉反应,同时比较了在不同水温(11、13、15、17、19、21℃)环境条件下对不同规格((L)42.37 g±1.99 g、(M)22.91 g±1.03 g、(S)12.09 g±1.51g)幼参的麻醉效果。结果显示:当薄荷醇浓度在4%以内时对仿刺参具有良好的麻醉效果,麻醉起效迅速,复苏率为100%;在麻醉体积分数为0.25%、0.5%、1%时,对大规格幼参麻醉时间及复苏时间影响显著,而对中小规格影响不显著;水温11~19℃时,随着温度的升高,仿刺参幼参的麻醉时间从15.62 min±1.31 min缩短到12.17 min±0.21 min,但复苏时间从13.61 min±4.85 min显著增加到28.10 min±7.35 min,不同水温下薄荷醇对仿刺参幼参的麻醉效果差异显著(P0.05),当水温超过21℃时幼参麻醉状态出现异常,不适宜进行麻醉。研究表明:薄荷醇是一种对仿刺参安全有效的麻醉剂,在水温11~21℃进行测量体长的实验中,对体质量20 g以上的幼参适宜的麻醉体积分数为0.5%~1%,对体质量20 g以下的幼参适宜的麻醉体积分数为0.25%~0.5%。     

应用PCR-DGGE指纹技术分析高温季节仿刺参养殖水环境中菌群多样性

采用16S rDNA的PCR-DGGE基因指纹技术,于6~9月间,对辽宁普兰店湾2个相邻的刺参养殖池塘进行了养殖水环境中菌群多样性的分析,首先用2216E固体培养基对仿刺参养殖水环境中的细菌总数进行统计,再采用PCR-DGGE指纹技术分析菌群多样性。结果表明,池塘水环境中较高水平的细菌数,且9月为6月的3倍;高温季节刺参养殖水环境中细菌种群较为丰富,其中大多数属于变形菌门;6~9月份样品具有一致的优势菌群,分别为Pseudomonas sp.,Uncul-tureddelta bacterium,Ostreococcus sp.以及Unculturedalpha proteobacterium。同时发现,同一时间采集的样品,有一定的菌群相似性,并在聚类分析图中分别成簇,检测样品的细菌多样性指数在1.7至2.5之间。     

南移养殖仿刺参（StichopusjaponicusSelenka）铁蛋白基因的克隆及表达特征分析

采用cDNA文库、RACE、荧光定量PCR和Westernblot技术,克隆了南移养殖仿刺参铁蛋白基因的全长序列,并对其表达特征进行了研究。结果表明,南移养殖仿刺参铁蛋白cDNA全长1222bp,包括187bp的5’UTR;513bp的3’UTR和编码173个氨基酸残基的522bp的开放阅读框。诸如铁结合序列标签和铁调...