Thermus aquaticus DNA连接酶的连接特性研究

为进一步研究Thermus aquaticus(Taq)DNA连接酶的作用机理、开发以DNA连接作为关键步骤的新生物技术,本文以含有超稳定发卡结构的DNA(带有11nt长的单链部分)和另一条单链DNA为连接底物,研究了片段长度、反应温度、连接位点的结构特性、聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)的添加等对连接的影响,探讨了Taq DNA连接酶的连接特性。连接结果显示:单链DNA的3’端同发卡结构I底物相连的连接率,比单链DNA的5’端同发卡结构II底物相连的连接率更高;可以连接的最短单链DNA片段的长度为6nt;在20~65℃范围内,一般连接率随温度升高而升高。在连接时,由2条底物通过互补配对形成的复合体的热稳定性对连接率影响不大,一般在连接温度远远高于该复合体的熔点(Melting Temperature,Tm)时仍有很高的连接率。在70或75℃时,虽然连接率有所降低,但仍然可以连接9nt的单链DNA片段。研究还发现,在片段连接上,PEG 6000对较难连接的片段(6~7nt)有促进作用,对容易连接的片段(8~10nt)促进作用不显著,甚至有一定抑制作用。     

节旋藻(螺旋藻)高分子量DNA的两种制备方法

DNA的简便高效制备方法是研究基因结构、功能及开展其它各项研究的基础。首次报道了针对节旋藻的结构和组成特性而建立的制备节旋藻高分子量DNA的两种方法。其中第一个方法是常规方法，可大量提取纯度较高、分子量达50kb的节旋藻DNA，可用于构建节旋藻质粒库、Southern杂交和PCR操作等；第2种方法是用脉冲电场凝胶电泳分离DNA片段，制备的DNA片段达数百kb，可用于构建节旋藻噬菌体库、粘粒库、BAC库等，从而为构建节旋藻物理图谱，定位克隆基因奠定基础。     

碱解旋法及其在检测DNA损伤中的应用

碱解旋法（DNA alkaline unwinding assay,DAU)是一种快速，灵敏，简便，廉价的检测DNA单链断裂的方法，目前已应用于检测辐圾化学物质引起的DNA损伤。本文对该实验技术的发展，检测分析方法，基本理论及其在遗传毒理学研究，环境生物监测等方面的应用前景作了简要介绍。     

沉积物中氨氧化细菌amoA基因荧光定量PCR检测方法的改进

聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)较容易受到某些抑制成分的影响,尤其是在对复杂环境样品进行的荧光定量PCR反应中,定量结果的准确性更易受到影响。为减轻这种抑制作用,以采自长江口邻近海域沉积物的DNA为研究对象,采用稀释模板法和添加BSA法对荧光定量PCR反应进行了优化。结果表明2种方法都有减轻抑制的作用,但若考虑方法的准确性和检测的便捷性,则以添加BSA的方法更为优越,最适添加浓度为0.1～0.5μg/μL。这一检测方法的改进,为研究沉积物中微生物在硝化过程中的重要作用提供了可靠的技术途径。     

氮、磷对两种微藻吸附与吸收镍的影响

采用放射性同位素示踪的方法,研究了大量营养盐氮和磷添加对两种微藻:东海原甲藻(Prorocentrum donghaienseLu)和中肋骨条藻(Skeletonema costatum)吸附和吸收重金属镍的影响。结果表明,在短时间(2h)的培养实验中,大量营养盐的添加影响了藻类对重金属的吸附和吸收速率,但氮、磷浓度的增加对藻类吸附和吸收镍的影响有所差异:硝酸盐浓度的添加促进了藻类对镍的吸附和吸收,磷浓度的添加促进了两种藻类对镍的吸附,但对藻类吸收镍的影响不大。在未添加营养盐的条件下,东海原甲藻对镍的吸附量要高于硝酸盐添加组但吸收量则较低,而中肋骨条藻的吸附量和吸收量均较硝酸盐添加组低。当尿素为氮源时,尿素促进了藻类对镍的吸收,其吸收量为同一浓度硝酸盐的1·2倍。本研究结果证明,近海富营养化特别是氮浓度的增加会影响浮游植物对微量金属的吸收,进而可能会影响到金属在整个海洋食物链中的传递。     

海洋解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefacien)产抗生素Macrolactin A的碳源优化

为提高一株海洋解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ESB-2生产大环内酯类抗生素Macrolactin A的能力,利用大孔树脂对发酵液进行粗提取,利用高速逆流色谱法,高效、快速分离制备出高纯度的Macrolactin A。采用高效液相色谱法检测不同碳源对Macrolactin A产量的影响,且在优化基础上采用摇瓶发酵得到海洋解淀粉芽孢杆菌的发酵过程曲线。结果表明:高速逆流色谱法能够高效快速的制备出Macrolactin A纯品,纯度达到95%以上,明显优于高效液相色谱;添加葡萄糖、蔗糖和麦芽糖均有利于Macrolactin A的生成,麦芽糖为最佳碳源,最佳浓度为1%,其产量达到18.5mg/L,是优化前的2倍多。本研究可为提高Macrolactin A的产量、解决其药源问题、实现规模化生产打下了良好的基础。     

一种新的褐藻胶寡糖制备方法--氧化降解法

建立了一种新的褐藻胶寡糖的制备方法,即氧化降解法。通过褐藻胶来源的聚甘露糖醛酸(PM)在不同浓度的过氧化氢、不同温度和不同反应时间下降解优选降解条件。以包含3～11糖单体的寡糖混合物为目标产物,以相应的降解产物的平均分子质量为1500u为选择标准,获得氧化降解法的最佳条件：过氧化氢浓度5％,反应温度90℃,降解时间2h。以该条件降解PM获得的降解产物经圆二色谱、紫外光谱及红外光谱测定表明,制备的寡糖保持了甘露糖醛酸的结构特点。提示该方法可用于褐藻胶寡糖的制备。     

卵磷脂对花尾胡椒401幼鱼谷肤甘肤一硫一转移酶，谷肤甘肤过氧化物酶和DNA完整性的影响

采用不同卵磷脂添加量的配合饲料投喂花尾胡椒鲷(Plectorhyncchus cinctus）幼鱼，同步测定幼鱼的谷胱甘肽-硫-转移酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性以及DNA完整程度。结果表明，谷胱甘肽-硫-转移酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性随着饲料中卵磷脂含量的增加而提高，而DNA单链断裂程度随着饲料中卵磷脂含量的增加而减少。这提示卵磷脂能够提高鱼体的抗氧化防御系统的机能。     

雨生红球藻虾红素的制备及其稳定性研究

以雨生红球藻提取物为原料,利用皂化法和溶剂分配法制备虾红素,并研究其结构及稳定性。通过优化皂化过程中的碱液浓度、反应时间和反应温度,得到最佳的工艺条件:碱液浓度7%,皂化时间120min,温度15℃。此条件下,虾红素的转化率达96.12%,制备的虾红素得率为62.16%,纯度达80.36%。用HPLC-DAD-(APCI)MS/MS分析反应产物,解析虾红素的质谱裂解规律,研究光照条件、金属离子和温度对虾红素稳定性的影响。结果表明:紫外光照处理对虾红素稳定性影响显著;Fe~(3+)、Ca~(2+)、Cu~(2+)对虾红素有不同程度的破坏作用,Zn~(2+)、Mg~(2+)、Na~+、Fe~(2+)对虾红素影响较小;pH在3~8范围内,随着pH升高,虾红素稳定性提高;随着温度的升高,虾红素的保留率下降。本研究为虾红素的活性、毒理及其在食品中的应用等研究提供了重要参考。     

海洋资源的化学——Ⅲ.用于海水直接提溴的新型吸着剂

溴是合成化学工业和感光底片的重要原料。近几十年来,由于溴大量用于制备内燃机抗震添加剂和新型的高效灭火剂,因而其需用量日益增加。我国目前溴的产量亦亟待提高。世界上现今生产的溴,虽然约有70％是来源于海水,但沿用的方法和工艺,远非经济、合理。这是因为三溴苯胺法、Ethyl-Dow法和迭经改进的空气吹出法,都是先把海水泵提入反应塔,添加大量的化学试剂预行酸化,然后进行一系列的化学加工处理。这些方法设备庞大,操作繁复,试剂和能量的消耗亦多。显然,如能选用某种高效的溴吸着剂,将其直接置入浩瀚的大海中,或装入柱内使其通流海水,通过吸着、富     

盐田嗜盐单胞杆菌的分离鉴定及其PHB 积累的研究

微生物聚合物聚-?-羟基丁酸酯(PHB)具有良好的生物降解性、生物相容性和热塑性,在环保、医药和农业领域具有广阔的应用前景。高PHB积累菌株的获得及其发酵条件的研究具有很好的实用价值。作者从渤海湾日晒盐场盐田卤水中分离出一株杆状细菌,经16S r DNA序列测序比对,确定为盐杆菌属(Halomonas),命名为Halomonas 100-16-2,其最适生长盐度为50~100,最适生长p H为7~8,属中度嗜盐菌。在酸水解酪蛋白(7.5 g/L)的基础培养基中分别添加0、10、20和30 g/L葡萄糖,研究盐度100条件下不同葡萄糖添加量对Halomonas 100-16-2生长和PHB含量的影响。结果表明,随着葡萄糖浓度的增加,该菌株的生长和PHB积累显著提高。葡萄糖质量浓度为30 g/L时,细胞干质量达8.60 g/L,PHB含量达到5.57 g/L(即达到细胞干质量的65%)。本研究为渤海湾盐田微生物资源的开发和利用提供了有价值的基础数据。     

α-酮戊二酸及其钠盐对雨生红球藻生长和虾青素积累的促进作用

雨生红球藻是已知虾青素(astaxanthin, AST)含量最高的生物,是理想的细胞制备工厂。尽管研究表明添加α-酮戊二酸(OG,α-oxoglutarate)能有效促进混养条件下雨生红球藻AST积累,但在自养条件下是否也有类似效果不清楚。研究以自养雨生红球藻为对象,在正常(CK)、高光(HL)、缺氮(DN)和高光-缺氮双重逆境(HL-DN)下从细胞生长和AST积累两方面评估OG及其钠盐(OG-2Na)的促进作用。结果显示,添加OG或OG-2Na显著缓解HL、DN和HL-DN胁迫对细胞生长的抑制作用,培养至6 d的生物量分别为0.58、0.53和0.38 g/L,约是未添加组的2.0倍。添加OG或OG-2Na显著促进AST积累。培养至6 d,在HL、DN和HL-DN下, AST含量分别达到13.62、19.51和28.29 mg/g,是未添加组的2.39、1.16和1.35倍。同时在胁迫条件下,添加OG或OG-2Na有效提高单位细胞中AST含量。针对OG和OG-2Na添加,最大单位细胞AST含量分别出现在HL和HL-DN条件下,达到53.72和60.58 pg/cell,是对照的3....     

中华哲水蚤对环状异帽藻生物调控的初步研究

在实验室条件下开展了中华哲水蚤(Calanus sinicus)对海洋赤潮藻环状异帽藻(Heterocapsa circularisquama)的生物滤食及其影响因子研究。结果表明藻浓度、温度、盐度和光周期等对中华哲水蚤的滤食率均有显著的影响(P0.01)。中华哲水蚤对环状异帽藻的滤食率随藻浓度的增加呈递增趋势;在10～20℃时,中华哲水蚤对环状异帽藻的滤食活动随温度的升高而增强,表现为滤食率G和清滤率F都同时上升,最佳滤食温度是20℃;18～24盐度是中华哲水蚤滤食环状异帽藻的适宜盐度,低于或高于该盐度范围,F和G都降低;中华哲水蚤对环状异帽藻的滤食率和清滤率对光周期的响应完全一致,均在全黑暗条件下为最佳,在全光照条件下达最低。     

海藻酸钠/聚砜复合纳滤膜的研究

应用海藻酸钠作为表面活性层材料,以戊二醛为交联剂,以聚砜超滤膜为支撑层,制备了1种新型荷负电纳滤膜。研究了复合纳滤膜的制备影响因素及操作条件对膜性能的影响,结果表明当海藻酸钠的浓度为2.0%,戊二醛溶液的浓度为0.9%,30℃下交联4 h条件下制备的复合膜的膜性能(截留率)最好。实验结果表明:对1 000 mg.L-1的Na2SO4,MgSO4,NaCl和MgCl2盐溶液的截留率分别为87.2%,21.5%,32.0%,12.2%,通量依次为30.6,35.2,33.5,22.4 L.h-1.m-2。     

SELEX 筛选嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)适体方法的建立

嗜水气单胞菌是水产养殖中一种比较常见的致病病原菌。本研究以嗜水气单胞菌为研究对象,利用SELEX指数富集系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX),经过12轮的筛选,通过生物素-抗地高辛碱性磷酸酶显色系统检测DNA适配子与嗜水气单胞菌的亲和力,克隆、测序后,用DNAMAN软件分析其一级序列与二级结构。研究结果表明,通过12轮筛选后,亲和力由最初的0.32升到第9轮的0.72,亲和力提高了2.25倍。一级结构主要由GT组成,说明同源性适体有了一定程度的富集。二级结构模拟图以茎环状结构为主,说明这些茎环状结构可能是适体与靶分子进行结合作用的基础,也是其进一步形成三维空间结构的基础。     

斑石鲷肌肉、脑细胞系的建立与生物学特性

斑石鲷(Oplegnathus punctatus),是一种具有极高经济价值的海水养殖鱼类,尚未见其细胞系建立的相关报道。本研究以斑石鲷肌肉、脑组织为材料,采用组织块移植培养技术,建立了斑石鲷肌肉、脑细胞系,分别定名为OPPM、OPPB。斑石鲷肌肉细胞系已传至183代,脑细胞系已传至174代,细胞均为成纤维样细胞。OPPM细胞最适培养温度为28℃,OPPB细胞最适培养温度为26℃。在FBS浓度为10%~20%条件下细胞生长旺盛。对OPPM、OPPB分别提取DNA进行18SrRNA基因片段特异性扩增,均获得819bp DNA片段,与斑石鲷18SrRNA序列进行比对,一致性达99.6%,表明该细胞起源于斑石鲷,而染色体分析表明两个细胞系染色体数目和核型均出现不同程度变异。OPPM细胞与OPPB细胞液氮冷冻保存10个月后,复苏后经台盼蓝细胞染色,约91.2%、86.7%细胞具有活性,且复苏后增殖速度快,可正常传代。使用脂质体转染法将pEGFP-C1质粒转染至OPPM、OPPB,可高效表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)。OPPM和OPPB细胞系的建立将为斑石鲷免疫学研究及基因功能研究奠定基础。     

酶解法辅助提取布渣叶总黄酮的工艺优选

目的：优选酶解法辅助提取布渣叶总黄酮的工艺条件。方法：以总黄酮提取率为指标,采用单因素试验、正交试验法,分别考察酶种类、酶用量、pH值、酶解时间及乙醇浓度对提取工艺的影响。结果：最佳工艺条件为复合酶（纤维素酶∶果胶酶=1∶1）用量1%,乙醇浓度60%,酶解1h,总黄酮提取率为20.90%,较未经酶解法提高了4.85%。结论：优选的工艺简单高效,为布渣叶总黄酮的开发利用提供了实验依据。     

几种海洋微藻基因组DNA的分离提取及PCR检测

用改良CTAB法分别提取6种海洋微藻的基因组DNA,发现提取的DNA纯度、产率高(>100μg.g-1鲜重),DNA完整性好。以6种海洋微藻的基因组DNA为模板,并以5'TTCGAGCCAG3'(OPC-01)为随机引物,对PCR反应条件进行研究。结果表明,25μl反应体系中,Mg2 、Taq DNA聚合酶、引物、模板DNA和dNTP 5种主要成分的适宜浓度或用量分别是:2.0mmol.L-1、1.6U、20pmol.L-1、50ng和2.5mmol.L-1。扩增程序优化为:94℃预变性5min,94℃变性1min,36℃退火1min,72℃延伸2min,循环45次,最后于72℃再延伸10min。酶切实验结果表明,6种海洋微藻的基因组DNA都能被EcoRⅠ酶切,酶切图谱呈弥散状,满足分子水平操作的要求,可直接应用于进一步的分子生物学实验。     

氮磷营养盐对浒苔生长影响的初步探讨

在实验室条件下,设置不同的N、P浓度,研究单因子(P:30μmol/L,N:0～500μmol/L和N:500μmol/L,P:0～30μmol/L)对浒苔(Enteromorpha prolifera)生长的影响。结果表明:在高N、P浓度(N:500μmol/L,P:30μmol/L)条件下浒苔生长态势最好,具有较高的相对生长率(0.451)。添加N可以明显促进浒苔的生长,而且随着添加N浓度的提高促进作用增强,浒苔的相对生长率有较大幅度提高。添加P对浒苔的生长也具有一定的促进作用,但促进作用不如添加N的明显;随着添加P浓度的提高,浒苔的相对生长率提高幅度不大,这说明浒苔生长对N变化更为敏感。     

两株芽孢杆菌对凡纳滨对虾生长和血清非特异性免疫指标的影响研究

为研究芽孢杆菌对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)生长指标和血清非特异性免疫指标的影响。以初始体重(4.00±0.03)g的凡纳滨对虾为对象,在对虾饲料中分别添加浓度为1×10~7、1×10~9和1×10~(11)cfu/kg的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis),以对虾商品饲料为对照组,养殖42d。实验结束后,测定凡纳滨对虾的生长情况和血清非特异性免疫指标。研究表明:各组对虾的成活率均在90%以上,且组间差异不显著(P0.05);除了枯草芽孢杆菌1×107cfu/kg添加组,其余添加组中凡纳滨对虾的体重、特定生长率、饲料效率和消化率(P0.05)显著提高,在添加浓度为1×109cfu/kg时各指标取得最大值。饲料中添加益生菌可提高凡纳滨对虾的超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、溶菌酶、总一氧化氮合酶、诱导型一氧化氮合酶活性和血清蛋白浓度等血清非特异性免疫指标,且均在添加浓度为1×109cfu/kg时各指标取得最大值。研究结果表明,饲料中添加适当浓度的益生菌可有效促进凡纳滨对虾的生长,提高其血清非特异性免疫水平。当益生菌的添加浓度为1×109cfu/kg时,效果最显著。