别藻蓝蛋白基因在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达

采用亚克隆方法,将别藻蓝蛋白(allophycocyanin,APC)基因插入到毕赤酵母整合型表达载体pPIC6αA中,再用SacⅠ线性化,纯化后,用氯化锂法转化毕赤酵母菌株X-33,筛选表达APC的重组子。PCR和序列分析表明,APC基因已整合到酵母染色体中。重组子经甲醇诱导,用Western blotting在培养基上清液检测到APC,表明别藻蓝蛋白(APC)在毕赤酵母中可以表达。APC由两种亚基组成,分子量分别为19kDa和21kDa。重组子经摇瓶培养48h表达量达4.4mg/L。     

海藻酸裂解酶基因在毕赤酵母中的表达及重组酶性质的初步研究

褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum)是一种海藻酸降解菌.本实验采用PCR的方法,以褐球固氮菌基因组DNA为模板,克隆出约1.05 kb的海藻酸裂解酶基因algL的成熟蛋白编码序列,并将其插入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPIC9K中,获得重组质粒pPIC9K-algL.重组质粒线性化后用聚乙二醇(PEG)法导入毕赤酵母菌株GS115中,获得高效分泌表达海藻酸裂解酶的毕赤酵母工程菌株.用甲醇诱导培养基进行摇瓶发酵,表达得到43 kDa的目的蛋白,酶活力可达1 400 U/cm3左右.经测定,该重组酶的最适反应pH为8.5,最适反应温度为40℃,并且在20~55℃,pH2.0~11.0具有较好的稳定性.另外,10 mmol/cm3的Cu2+,Fe2+,Co2+,Mn2+和Ca2+对酶有不同程度的抑制作用.     

南极细菌低温脂肪酶在大肠杆菌中的高效表达

极端微生物是亟待开发的微生物资源宝库.通过PCR扩增南极嗜冷菌低温脂肪酶基因序列,将其连接到表达载体pE-24a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,实现低温脂肪酶在常温菌的高效表达,将对低温酶的催化机制研究和工业化应用起到促进作用.     

副溶血弧菌tdh基因在毕赤酵母中的表达及溶血活性检测

通过PCR技术从副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus,VP)基因组DNA上扩增耐热溶血素基因tdh,双酶切后定向插入到酵母表达载体pPICZaA中,构建重组表达质粒pPICZaA-tdh,经限制性内切酶SacI线性化后电转化毕赤酵母(Pichia pastoris,P.pastoris)GS115,经PCR和测序鉴定耐热溶血素基因成功整合到毕赤酵母的基因组中。在甲醇诱导下进行tdh的表达,SDS-PAGE分析证明重组TDH(thermostable direct hemolysin,TDH)的分子质量约为23ku,经Western blotting鉴定VP抗体能与表达的TDH发生特异反应,说明tdh基因在毕赤酵母中的表达是准确的。溶血实验证明了表达的TDH具有溶血活性。本研究首次应用毕赤酵母表达耐热溶血素基因tdh,在培养基中获得分泌表达的耐热溶血素,为研究tdh基因的功能奠定了基础。     

中国明对虾血蓝蛋白C末端片段在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性

为研究中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)血蓝蛋白C末端(FcHC-C)的抗菌功能,将血蓝蛋白基因FcHC的2个C末端基因片段连接到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建酵母表达载体pPIC9K/FcHC-C。该载体经SalI酶切后,采用PEG法转化毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)。转化子经过PCR鉴定后,阳性克隆通过含有G418的YPD平板筛选,获得高拷贝重组子。重组毕赤酵母利用甲醇诱导表达目的基因。经Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析结果表明,利用酵母工程菌成功表达了血蓝蛋白C末端片段(rFcHC-C1和rFcHC-C2)。抑菌活性鉴定实验结果显示,重组蛋白rFcHC-C1和rFcHC-C2作为阴离子抗菌肽具有抗真菌和抗细菌的活性。     

分子伴侣共表达对低温脂肪酶Lip-837异源可溶性表达的影响

将南极嗜冷菌Moritella sp.2-5-10-1的低温脂肪酶基因Lip-837克隆到表达载体pCold Ⅲ中,成功构建了重组质粒pColdⅢ+Lip-837,并转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3).SDS-PAGE实验结果表明,实现了该基因在E.coli的异源表达,且其表达量达到细胞总蛋白的39%;但表达...     

Bohaisea-9145海洋耶氏酵母碱性脂肪酶基因的克隆、异源表达和重组酶酶学性质

采用基因重组和分子生物学相关技术,对Yarrowia lipolytica Bohaisea-9145海洋低温碱性脂肪酶(Y.lipolytica Bohaisea-9145,LipYp)基因lipYp(1116bp)克隆并在Pichia pastoris中进行了异源真核表达研究。通过MD和MM平板及PCR扩增,筛选和鉴定了重组子。结果表明,阳性重组子经摇瓶发酵54h后上清液酶活力达到1956U/ml。发酵液经两步纯化得到在SDS-PAGE上显示为单一条带的重组脂肪酶。实验同时研究了不同反应温度、pH值对重组LipYp活力和稳定性的影响,结果显示重组LipYp最适反应温度和pH分别为35℃和8.5,在pH7.0-10.5之间以及45℃以下有较好稳定性。另外,重组脂肪酶对中长链对硝基苯基酯类和甘油三酯类(C10-C12)有较强的水解能力。     

海洋微生物低温碱性脂肪酶的纯化与性质研究

以海洋微生物通过发酵制备的脂肪酶为材料 ,对该酶的分离纯化条件及理化性质进行了研究。在脂肪酶纯化中 ,采用氯仿萃取、中空纤维柱超滤及CM SepharoseFF阳离子交换柱层析等技术对发酵制备的脂肪酶进行了纯化 ,结果得到达到电泳纯的脂肪酶。在脂肪酶理化性质研究中 ,采用SDS PAGE电泳对该脂肪酶分子量进行测定 ,并在实验中以橄榄油为底物采用脂肪酶酸碱滴定测活法 ,对脂肪酶的最适水解条件、各种因素对脂肪酶稳定性的影响进行了研究。结果显示 ,该脂肪酶分子量为 ( 38 0± 1 )kD ,最适水解温度为 35℃ ,最适pH为 8 5 ,为一低温碱性脂肪酶。该脂肪酶可在 35℃以下、pH =4 0— 9 0范围内保持良好的稳定性 ,与常见金属离子、化学试剂等的配伍性较好 ,并且具有良好的耐盐及抗氧化性能。研究中还以p NPL(月桂酸对硝基苯酚酯 )为底物采用脂肪酶化学发光测活法 ,对脂肪酶进行了酶促动力学的研究。结果表明 ,该脂肪酶在最适条件下Km 值为 7 80 5 μmol/L ,Vmax为 1 2 385mmol/ (L·min)。通过对Zn2 +抑制脂肪酶水解活性的研究 ,发现Zn2 +对脂肪酶具有可逆抑制作用 ,从而筛选到该脂肪酶的可逆抑制剂Zn2 +。     

南大洋深海嗜冷菌2-5-10-1及其低温脂肪酶的研究

从南大洋普里兹湾的水样中筛选到一株产低温脂肪酶的深海嗜冷菌2-5-10-1,对其生长及产酶情况和酶性质做了初步研究.该菌株的最适生长温度为5℃,此时分泌的胞外脂肪酶最多;添加Tween80,橄榄油可显著促进脂肪酶的产生.该脂肪酶的最适作用温度为35℃,在0～20℃均保持较高的酶活性,在0℃可保持37%的相对酶活性;酶的最适作用的pH值为7.5,在pH6～9的范围内均存在较高酶活性;对热较敏感,在60℃保温15min可丧失50%以上的酶活性.该脂肪酶的催化作用不需要金属离子的参与,Cu2+和Zn2+对酶活有着强烈的抑制作用.     

海洋球石藻病毒(Coccolithovirus)硫氧还蛋白(Trx)在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达及其活性分析

从实验室保存的pBS-Trx重组质粒中克隆球石藻病毒EhV-Trx基因,构建毕赤酵母重组表达载体pPIC9K-EhV-Trx,将重组质粒电转化毕赤酵母GS115,诱导分泌表达并对重组蛋白进行二硫键还原酶活性分析。结果表明,EhV-Trx基因开放阅读框为591bp,编码197个氨基酸;在毕赤酵母GS115中成功诱导表达重组EhV-Trx,经SDS-PAGE分析目的蛋白分子量约为27.8kDa;重组EhV-Trx具有二硫键还原酶的活性,能有效打开胰岛素A、B两条链的二硫键,有望开发成一种新型的硫氧还蛋白脱敏制剂应用于食品安全领域。     

重组鲈鱼生长激素酵母饲料添加剂及对网箱喂养海水鱼的促长效应

该文应用基因工程方法开展了具有加速鱼生长的鱼生长激素基因工程研究，构建了高效表达的66鱼生长激素甲醇半赤酵母工程菌．研究中试规模的培养基配方，解决中试工艺设计和生产试验及质量检验方面的问题；通过发酵培养该工程茵获得重组鱼生长激素产品，研究掺入饲料的合适比例，并进行生产规模的海水经济鱼类喂养试验．先后对花尾胡椒鲷(Plectorhinchus cinctus)，卵形鲳鯠(Trachinouts ovatus)，大黄鱼(Pseudosciaena croces)等3种海水经济鱼(4批共约6万尾)进行生长状况对比，增重比率均值分别为20．0％、17．3％、18．4％和56．8％．饲料添加酵母工程菌具有明显地促进海水鱼生长的作用。     

大黄鱼抗菌肽hepcidin在巴斯德毕赤酵母中的表达及其产物的抑菌活性

Hepcidin是一类具有独特性质的小分子抗菌肽,克隆得到大黄鱼(Pseudosciana crocea)的hepcidin基因(Lyc-Hepc),cDNA序列全长585个核苷酸,编码一个由85个氨基酸组成的蛋白,包含24个氨基酸的信号肽、35个氨基酸的前导肽和26个氨基酸的成熟肽,成熟肽具有8个保守的半胱氨酸.将Lyc-Hepc 183bp的编码前导肽和成熟肽的前体肽(25aa-85aa)基因片段克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA中,然后电击转化巴斯德毕赤酵母SMD1168,经高浓度Zeocin筛选获得多个单克隆.挑取4个克隆进行培养,提取酵母基因组进行PCR检测,结果表明目的基因片段已成功整合到酵母菌SMD1168基因组中,获得酵母工程菌株SMD1168/pP1CZα-Lyc-Hepc.SDS-PAGE和WesternBlot分析表明酵母工程菌株在0.5％甲醇诱导培养72h后,Lyc-Hepc在培养上清中得到了分泌型表达.体外抑菌实验表明重组Lyc-Hepc蛋白能够抑制2株水产养殖病害菌嗜水气单胞菌和副溶血弧菌的生长.研究结果表明大黄鱼hepcidin可能在抗细菌免疫中发挥了作用.     

极地产适冷脂肪酶菌株的酶学性质研究

从南北极环境样品中分离到7株产脂肪酶的细菌,经16SrDNA序列分析表明,这些细菌分别属于假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas）和嗜冷杆菌属（Psychrobacter）．采用p-NPP法对这7株细菌所产的脂肪酶进行酶学性质研究,结果显示这些酶的最适作用温度在30～40cC、最适作用pH值在7—8之间,在低温下能保持较高的剩余活力,对热敏感,属于适冷脂肪酶．其中假交替单胞菌（Psychrobacter sp．7342）所产脂肪酶具有低温下酶的剩余活力高、有效作用温度和pH范围广、热稳定性较好及对多种金属离子抗性强等特点．该菌株能利用多种单一氮源和碳源产酶,最适产酶温度为25℃．在此基础上进行正交实验分析得到了该菌株的最佳发酵条件为：蛋白胨和淀粉含量各为1．33％,酵母膏含量为0．3％,温度为25℃．     

凡纳滨对虾翻译控制肿瘤蛋白Fortilin的毕赤酵母表达及其对血细胞免疫反应的影响

翻译控制肿瘤蛋白Fortilin是1种多功能蛋白,参与重要的细胞活动.并且,对虾fortilin通过抑制病毒复制干扰病毒感染.参照Genbank中fortilin基因序列设计引物,PCR扩增得到凡纳滨对虾fortilin目的基因片段,EcoR I/XbaI双酶切插入表达载体pGAPZαA,转化大肠杆菌,经博来霉素(Zeocin)抗性筛选及测序分析,获得分泌型重组酵母表达载体pGAPZαA-F.酶切线性化后,经电穿孔法转入毕赤酵母细胞X-33,经Zeocin抗性筛选,得到阳性转化子.表达产物的上清液经SDS- PAGE电泳和质谱分析,表明在酵母中成功表达fortilin.以体外原代培养的对虾血细胞检测重组蛋白的免疫活性,结果显示重组蛋白显著提高了血细胞酚氧化酶和超氧化物歧化酶活性.该结果为下一步研究重组fortilin 在对虾养殖中的应用奠定了基础.     

Gene cloning and sequence analysis of the cold-adapted chaperones DnaK and DnaJ from deep-sea psychrotrophic bacterium Pseudoalteromonas sp.SM9913

Pseudoalteromonas sp.SM9913 is a phychrotrophic bacterium isolated from the deep-sea sediment.The genes encoding chaperones DnaJ and DnaK of P.sp.SM9913 were cloned by normal PCR and TAIL-PCR(GenBank accession Nos DQ640312,DQ504163).The chaperones DnaJ and DnaK from the strain SM9913 contain such conserved domains as those of many other bacteria,and show some cold-adapted characteristics in their structures when compared with those from psychro-,meso-and themophilic bacteria.It is indicated that chaperones DnaJ and DnaK of P.sp.SM9913 may be adapted to low temperature in deep-sea and function well in assisting folding,assembling and translocation of proteins at low temperature.This research lays a foundation for the further study on the cold-adapted mechanism of chaperones DnaJ and DnaK of cold-adapted microorganisms.     

海湾扇贝促性腺激素释放激素基因克隆及表达分析

促性腺激素释放激素(Gonadotropin Releasing Hormone,GnRH)是脊椎动物下丘脑-垂体-性腺轴的关键信号分子。近年来的研究显示,GnRH也存在于贝类等无脊椎动物,且在雌雄异体性别分化与繁殖中起重要作用,然而雌雄同体贝类GnRH的研究仍处于空白。本文以海湾扇贝为研究对象,利用RACE技术克隆获得GnRH的cDNA全长序列,该基因长1335 bp,编码101个氨基酸,前体包含1个由24个氨基酸组成的信号肽以及1个具有酰胺化修饰的活性肽(QNFHYSNGWQP-amide)。GnRH在脑足神经节和脏神经节中均有表达,且在2015年10月-2016年1月,GnRH在脑足神经节中的表达量显著高于脏神经节(P<0.05);GnRH在两个神经节中的表达均呈现先上升后下降的趋势,峰值出现在11月份,推测可能与性腺发育启动有关。本研究为深入理解GnRH在贝类繁殖调控中的作用奠定了基础。     

牙鲆NPY的体外表达及体内检测

神经肽Y(Neuropeptide Y,NPY)被普遍认为是一种重要的促食因子,在调节鱼类的摄食行为方面起着至关重要的作用。为进一步研究牙鲆NPY蛋白的生物学功能,作者克隆了牙鲆NPY成熟肽序列(m-NPY)及含有信号肽的全长序列(f-NPY),利用原核表达系统分别进行体外重组表达,筛选出诱导剂IPTG最佳诱导浓度为0.8 mmol/L及最佳诱导时间3 h;此外,根据牙鲆NPY第49-64位氨基酸序列制备了多克隆抗体并通过Western blot验证该多抗能够有效检验重组NPY及牙鲆体内NPY的表达。研究结果为研究重组牙鲆NPY蛋白在牙鲆水产养殖产业中的应用及检测提供了依据。     

鱼类生长激素的异源表达、应用及安全性评价

鱼类生长激素对鱼的生长发育起着重要的调节作用,能促进鱼体快速生长,提高饵料转化率,在水产养殖业中具有重大应用价值。转生长激素基因鱼具有快速生长效应,可以缩短养殖周期,降低养殖成本和风险。鱼类生长激素基因异源表达体系的建立和发展,使获得大量廉价的鱼类生长激素产品成为可能,为鱼类养殖业新型饵料添加剂的研制开辟了新的途径。本文综述了转生长激素基因鱼和鱼类生长激素基因的异源表达两方面的研究及其安全性评价。     

壳聚糖酶基因在解脂耶氏酵母中的表达及重组酶性质研究

为构建高效表达壳聚糖酶工程菌株,以Microbacteriumsp.基因组为模板扩增壳聚糖酶基因,目的基因与表达载体pINA1317连接构建重组质粒,重组质粒NotⅠ酶切线性化后转化解脂耶氏酵母Y.liPolytica Po1h。所得结果为PCR扩增得到约1000bp的特异性片段,序列分析表明含有壳聚糖酶全长基因,开放阅读框801bp,编码266个氨基酸残基。转化子酶活力为10.4U/mL,是原菌株酶活力的3.15倍。重组蛋白经DEAE-Sepharose FF分离纯化,达到电泳纯,SDS-PAGE显示单一条带,分子量约41kDa。重组酶反应最适温度为45℃,最适pH为5.6,Km和Vmax分别是0.926mg/mL和6.15U/mL。质谱分析酶解产物主要为三糖和五糖。实现了壳聚糖酶在解脂耶氏酵母中的分泌表达,为壳聚糖酶的工业化生产奠定了理论基础。