大黄鱼肌肉生长抑制素基因外显子Ⅱ遗传多态性分析

肌肉生长抑制素是控制动物骨骼肌生长发育的重要细胞因子,采用PCR-SSCP和测序方法分析了150尾大黄鱼样本肌肉生长抑制素基因(myostatin)外显子Ⅱ的单核苷酸多态性,结果发现,外显子Ⅱ中有10个多态位点,分别是29、131、206、261、231、243、265、273、297和300位。其中131位点T→A突变引起相应的氨基酸由L→Q,265位点T→C突变引起相应氨基酸由C→R,261位点A→G突变引起相应氨基酸由S→G,231位点的T→C突变引起相应氨基酸由W→S,273位点的C→T突变引起相应的氨基酸由R→W,297位点的A→G突变引起相应氨基酸由I→V,243位点的G→A突变引起相应氨基酸由D→N,300位点的G→A突变引起相应氨基酸由E→K。29位点A→G和206位点C→A均属于同义突变。存在6种基因型,他们的基因频率分别是0.57、0.23、0.10、0.04、0.02、0.04,该基因位点的杂合度为0.33。     

条斑紫菜锰超氧化物歧化酶原核表达及多克隆抗体制备

研究紫菜抗逆的分子机制,将本实验室克隆的条斑紫菜(Porphyra yezoensisUeda)锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,Mn SOD)基因全长cDNA克隆到质粒pET-30c(+)中,构建原核表达载体pET-S,转化大肠杆菌BL21(DE3)表达Mn SOD,表达产物的分子量约为30 KDa。利用不同浓度的Mn2+诱导重组Mn SOD的表达,可以检测到比活力随Mn2+浓度增高而上升的趋势。用重组Mn SOD免疫新西兰大白兔,制备了多克隆抗体,多克隆抗体的效价为1∶8 000。免疫印迹实验(Western Blot)表明该多克隆抗体具有很好的特异性。     

眼斑拟石首鱼肌肉生长抑制素基因克隆及组织表达分析

肌肉生长抑制素(MSTN)基因对肌肉生长起负调控作用,在动物育种上具有潜在的应用前景.报道了眼斑拟石首鱼(Sciaenops ocellatus)的MSTN基因的序列结构特征及其组织特异性表达.MSTN基因具有3个外显子和2个内含子,编码376个氨基酸.在内含子Ⅰ和3'-UTR区内,分别发现了(TC)₄CC(TC)₄CT(TC)₄和(AC)₇微卫星序列.推断的眼斑拟石首鱼的MSTN氨基酸序列具很强的保守性,与石鼓鱼、金鲷、条纹石鮨、白鲈、金眼石鮨之间的相似性在90%以上.在结构上,眼斑拟石首鱼的MSTN包含N端信号序列(1~22氨基酸残基),TGF-β前肽域(41~256氨基酸残基),RXXR蛋白水解位点(264~267位的RARR)和TGF-β区域(282~376氨基酸残基).在检测的10种组织中,MSTN只在眼斑拟石首鱼的肌肉、脑和眼组织中表达,其中在肌肉表达最强.     

大黄鱼β-actin 抗体的制备与组织表达谱分析

为探讨大黄鱼(Larimichthys crocea)β-actin基因(Lc Actb)作为内参基因进行相关研究的可行性,从转录和翻译水平研究其组织表达谱,作者以大黄鱼肝脏为材料,扩增Lc Actb的开放阅读框序列,并将其亚克隆至原核表达载体p ET32a(+)。酶切、测序结果表明,p ET32a-Lc Actb构建成功。将p ET32a-Lc Actb转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行优化表达,表达蛋白经纯化后进行Western blotting验证;原核表达结果表明,IPTG可诱导一个分子量约45 ku的特异蛋白,且主要以包涵体的形式存在,优化表达条件为:28℃、0.4mmol/L IPTG、200 r/min诱导表达5 h。用表达蛋白作为抗原,免疫新西兰白兔制备抗Lc Actb的多克隆抗体;用纯化的多抗进行Western blotting的结果表明,获得了特异性的Lc Actb抗体;通过实时荧光定量RT-PCR检测大黄鱼多种组织m RNA的表达,其次,制备了多种组织匀浆蛋白,使用纯化的抗体进行Western blotting分析,结果显示,Lc Actb在大黄鱼成体各组织中转录和翻译水平的表达差异均不显著,可做为研究大黄鱼成体组织中其他基因表达和翻译水平的内参标准。     

大黄鱼FcRs基因的克隆及其在免疫应答中的初步功能分析

Fc受体（Fc Receptors,FcRs）是一类与免疫球蛋白的Fc段特异性结合,介导多种免疫反应的受体分子。本研究克隆得到了大黄鱼（Larimichthys crocea）6个FcRs基因,分别是LcFcγRⅠL、LcFcγRⅡ、LcFcγRⅡaL、LcFcγRⅢ、LcFcRL5和LcFcRLA,其开放阅读框（ORF）大小分别为1 070、2 486、1 145、 1 955、4 125、1 659 bp。大黄鱼的6个LcFcRs都具有一个信号肽和2~8个免疫球蛋白（Ig）结构域,LcFcγRⅡ、LcFcγRⅢ和LcFcRL5还包含一个跨膜区。实时荧光定量PCR结果显示LcFcγRⅠL、LcFcγRⅡ、LcFcγRⅡaL和LcFcγRⅢ主要在鳃或肠等黏膜组织中表达,而LcFcRL5和LcFcRLA主要在脾和头肾等系统免疫组织中表达;革兰氏阴性细菌细胞壁脂多糖（LPS）刺激后,这6个LcFcRs基因头肾和脾脏中的表达在不同时间出现了显著上调;双链RNA病毒类似物Poly(I:C)刺激后,6个LcFcRs在头肾和脾脏中的表达出现不同程度的上调,而LcFcRL5在脾脏中的表达显著上调,在头肾中则明显下调,提示大黄鱼FcRs可能在LPS和Poly(I:C)诱导的免疫反应中起着重要但又不同的作用。     

马氏珠母贝肌肉生长抑制素基因eSNP多态性与生长性状的关联分析

肌肉生长抑制素myostatin(MSTN),是目前已知抑制肌肉生长最强效的分化因子,具有负向调控肌肉生长、发育的作用,它与生长之间的这种单向作用关系,使其在养殖生物遗传改良上具有重要的潜在应用价值。文以马氏珠母贝MSTN基因21个e SNP位点作为候选SNP位点,对106只马氏珠母贝进行基因分型并与8个生长性状进行关联分析。SNP最小等位基因频率的范围为0.028 3~0.490 4,多态信息含量(PIC)的范围为0.093 6~0.375 0,观测杂合度(Ho)及期望杂合度(He)的范围分别为0.028 3~1.000 0及0.098 9~0.502 7。2个SNP位点与生长性状显著关联:g.3154 AG位点的GG型个体的壳高、壳长、总重、壳重、软体部重和闭壳肌重显著大于AG型个体(P0.05);g.4379AG位点GG型个体的壳高、壳长、铰合线长、总重、软体部重和闭壳肌重显著大于AG型个体(P0.05)。g.3154 AG位点和g.4379AG位点间无显著交互作用。这2个SNP可作为潜在的马氏珠母贝基因型选择育种标记。     

大黄鱼IL-7-Rα基因的克隆与表达分析

白细胞介素7受体α链(IL-7Rα,CD127)是一个重要的多效性细胞因子受体.本研究克隆得到大黄鱼(Larimichthys crocea)的IL-7Rα(LycIL-7Rα),其开放阅读框全长1 242 bp,编码413个氨基酸.通过氨基酸序列分析和多序列比对发现,LycIL-7Rα多肽具有I型细胞因子受体的典型特征,包括4个保守的半胱氨酸、1个信号肽、1个单次跨膜结构域、1个胞外的fibronectin type III(FN IIIlike)结构域、1个Trp-Ser-X-Trp-Ser(WSXWS)基序以及胞内Box1结构域.系统进化分析表明,LycIL-7Rα与其他鱼类的IL-7Rα聚在一起,与鲈鱼(Lates calcarifer)IL-7Rα的亲缘关系最近.Realtime PCR结果表明,LycIL-7Rα在健康大黄鱼中为组成型表达,在脾脏中的表达量最高,在心脏中的表达量最低.大黄鱼经聚肌苷酸胞苷酸[Poly(I:C)]或溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)刺激后,其脾脏中LycIL-7Rα的mRNA转录水平均显著上调.这些结果表明LycIL-7Rα可能在大黄鱼免疫反应中发挥重要作用.     

大黄鱼EBI3基因的克隆与表达分析

通过克隆大黄鱼(Larimichthys crocea)的EBI3(Epstein-Barr virus-induced gene 3)基因并对其进行了序列分析.大黄鱼EBI3(Lyc EBI3)基因开放阅读框长747bp,编码248个氨基酸,存在1个信号肽序列和2个FN3结构域(37~130,145~230).多序列比对发现Lyc EBI3分子与其他已知EBI3氨基酸水平一致性为27.68%~57.53%.Real-time PCR结果表明,Lyc EBI3基因在脾脏和血液中表达量最高,且溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)刺激后,大黄鱼头肾和脾脏中Lyc EBI3基因的转录水平会显著升高,说明Lyc EBI3基因可能参与了抑制由细菌引起的炎症反应.     

大黄鱼(Pseudosciaena crocea)热激蛋白的基因克隆、原核表达及抗血清的制备

应用trizol裂解法提取象山港网箱养殖大黄鱼肝脏总RNA,采用RTPCR获得大黄鱼cDNA;通过设计特异引物进行PCR扩增,将PCR产物转化到质粒并直接测序,得到1.7kb的目的基因;同时将此目的基因连接到表达质粒pSBET中,在大肠杆菌BL21中进行诱导表达以及表达产物的分析。克隆基因的表达产物经SDSPAGE分析表明,HSP基因的蛋白分子量为60kDa左右,与阅读框的编码大小一致;表达蛋白经纯化后免疫小鼠制备抗血清。Westernblotting检测结果表明,制备的抗血清与HSP蛋白起较强的特异性反应。HSP基因的系统进化分析表明,大黄鱼与非洲爪蟾最为接近,从侧面印证了脊椎动物中两栖纲动物与鱼纲动物的亲源关系。通过大黄鱼HSP基因的提取和分析,可为以后制备出核酸探针、筛选和克隆出一批具有优良性状的基因、构建基因文库等研究工作奠定基础。     

大黄鱼倍性检测研究

于2001—2004年对人工诱导大黄鱼的不同发育阶段和不同组织进行倍性检测，胚胎眼泡期采用染色体计数法测定，鱼苗和成鱼阶段用流式细胞法，结果表明，胚胎染色体数目2n=48条为二倍体，3n=72条为三倍体．采用流式细胞法测定鱼苗和成鱼个体时，若受测样品的DNA相对含量值与已知对照组二倍体的比值约为1．5：1，其个体为三倍体；比值约为1：1，则为二倍体，无论用肌肉或尾鳍组织，皆可检测出其个体的倍性。     

官井洋野生与养殖大黄鱼同工酶的研究

应用矣丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）法对取自福建宁德官井洋海区养殖群体和野生种群各20尾大黄鱼的9种同工酶15个基因座位于检测分析，结果表明，大黄鱼眼球中浮酸脱氢酶（LDH）酶谱表现为LDH的经典模式即有5种谱型LDH，在氙检测出的15个基因座位中，野生种群样品的编码苹果酸怪酶(sMDH)，苹果酸酶（ME）和琥珀酸脱氢酶（IDDH－1）的3个基因座位具有多态性，养殖群体中仅发现1个基因座位具有多态性（IDDH－1）所检测的野生种群比养殖群体的遗传变异水平高，但从总体上平高，但从总体上来说，官井洋大黄鱼遗传多样性相对较低，表明该种群已出现了种质退化现象，因此，进行科学的遗传管理对保护和恢复大黄鱼资源是相当必要的。     

三种致病弧菌感染对大黄鱼非特异性免疫功能的影响

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolytic-us)是引起大黄鱼(Pseudosciaena crocea)溃疡病的3种主要致病菌.将试验大黄鱼随机分成4组,分别腹腔注射哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和灭菌生理盐水,在感染后的不同时间采样,通过白细胞数量、白细胞分类计数、NBT阳性细胞数量以及溶菌酶活力的变化趋势来探讨3种致病弧菌感染对大黄鱼非特异性免疫功能的影响.结果表明,大黄鱼各项血液指标的变化主要发生在感染后的1～7 d.在人工感染的初期,各实验组大黄鱼外周血的白细胞数量、NBT阳性细胞数量呈现先增加后降低的趋势,淋巴细胞、嗜中性粒细胞百分比显著降低(p<0.05),单核细胞百分比显著提高(p<0.05);随着时间的延长,白细胞数量开始下降;淋巴细胞、嗜中性粒细胞百分比有所上升,7 d以后各类血细胞数量变化不显著.其中哈氏弧菌感染组在白细胞数量、NBT阳性细胞数量等多个指标上的变化最为明显.血清中溶菌酶活性显著高于脾组织,鱼体受感染后两者溶菌酶活性均较对照组有显著提高,不同致病菌与大黄鱼非特异性免疫功能之间呈现一定的时效差异.研究认为反映鱼体受感染后从应激反应发生至非特异性免疫功能的发挥主要发生在病原菌感染前期,不同致病菌与大黄鱼非特异性免疫功能之间呈现一定的时效差异.     

养殖大黄鱼生化组份的分析

本文测定了厦门火烧屿养殖大黄鱼成、幼鱼肌肉中蛋白质、脂类和糖类等生化组份,并计算其比能值;分析了肌肉蛋白南中１７种常见氨基酸的含量。结果表明：成鱼肌肉蛋白质占１８．９％（湿重比,下同）脂类为３．１１％,糖类为１．６２％,水份占７５．３０％,灰份为０．９５％。比能值为５．９７ＫＪ／ｇ,Ｅ／Ｐ值为３１．６２ＫＪ／ｇ。幼鱼肌肉中占７５．３０％,灰份为０．９５％。比值为５．９８ＫＪ／ｇ,Ｅ／Ｐ值为３１．６     

大黄鱼肌浆蛋白和肝酯酶同工酶的电泳分析

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)技术,对大黄鱼肌浆蛋白(Pm)和肝酯酶(EST)同工酶进行研究。结果表明,大黄鱼的Pm电泳酶谱不存在个体间差异,而肝EST酶谱复杂,Est-2和Est-3为多态位点。X2检验表明,这两个多态位点等位基因频率都符合Hardy-Weinberg平衡。     

网箱养殖大黄鱼越冬期间脂肪酸的相对含量变化

利用气-质法(GC-MS)对越冬期间海水平均温度在20,16,12,10和8 ℃条件下的2龄大黄鱼肌肉和肝脏组织中脂肪酸组成及相对含量进行分析,结果表明:随着海水水温的降低,机体会增加不饱和脂肪酸含量,尤其是EPA[C20:5(n-3)],EPA在肌肉中的含量从20 ℃时5.71%增至8 ℃时8.06%,在肝脏中从20 ℃时6.76%增至8 ℃时8.44%。由此可见,在越冬禁食条件下,大黄鱼机体通过自身的脂肪酸动态转化和代谢,减少饱和脂肪酸含量,而增加不饱和脂肪酸含量,以此增加膜的流动性,抵御寒冷。     

闽东大黄鱼饲料的现状与对策

近年来，大黄鱼养殖业发展迅速，饲料供给出现了激烈的竞争.冻、鲜杂鱼仍是养殖大黄鱼的主要饲料，但存在着资源破坏、环境污染的问题.配合饲料使用量增加较快，品牌杂、规格多、质量差异大.期待加大科研力度，深入进行大黄鱼专用配合饲料的研究，尽快制订出大黄鱼配合饲料的质量标准，加强质量监督.     

"海马"牌配合饲料喂养大黄鱼的试验

本文笔者于2000年5月17日至7月5日在霞浦海区网箱养殖大黄鱼中，进行"海马"牌配合饲料(按不同比例搭配小杂鱼)喂养大黄鱼试验.结果表明在相同的管理和养殖条件下，10％幼鱼粉搭配90％小杂鱼、50％幼鱼粉搭配50％小杂鱼、膨化饲料搭配小杂鱼在提高大黄鱼的生长速度、存活率和降低养殖成本方面均优于单一使用小杂鱼.     

大黄鱼病原弧菌拮抗放线菌的筛选与人工诱变

从厦门集美海滩底泥分离得到38株放线菌，用琼脂块法测定它们对大黄鱼病原弧菌-溶藻弧菌和副溶血弧菌的拮抗效果，选择两株拮抗效果较好的放线菌进行诱变，测定诱变后各菌株的抗菌效果，并选择抗菌效果较好的菌株进行第二次诱变，如此反复诱变3次，共得到97株放线菌，结果表明；38株放线菌中的22株对两株病原菌有一定的拮抗作用；用紫外线照射可以获得少量对两株病原菌拮抗作用加强的菌株。     

网箱养殖大黄鱼体重与体长、体长与咽喉径之间的关系

通过对大黄鱼体重、体长、咽喉径的准确测量，并将测量的原始数据经计算机统计回归分析.结果表明，大黄鱼体重与体长之间存在着幂函数关系；同时，当大黄鱼体重在5～100g范围内时，体长与咽喉径之间存在着线性函数关系.