miR-210在马氏珠母贝外套膜矿化机制中的结构和功能预测

为进一步探究Pm-miR-210在马氏珠母贝贝壳形成的作用,利用miR-RACE技术验证Pm-miR-210的成熟体序列并进行序列分析,通过生物信息学分析来获得Pm-miR-210的前体序列,并进行组织定量和靶位点预测。结果表明,Pm-miR-210的miR-RACE结果与高通量测序结果一致,利用转录组数据库与Pm-miR-210成熟体序列比对,获得的前体序列长度为80 bp并具有典型的颈环结构。多序列比对结果显示,Pm-miR-210成熟体序列的种子区域在不同物种间具有极高的保守性。荧光定量结果得出,Pm-miR-210在外套膜边缘膜和中央膜中均有表达,但表达量差异不具统计学意义(P0.05)。靶向预测分析结果显示,钙调蛋白(calmodulin)、钙调磷酸酶-A亚基(calcineurin A subunit)、N19以及Shematrin-3为Pm-miR-210的候选靶基因。     

光合细菌在马氏珠母贝育苗中的应用

研究了光合细菌（下简称ＰＳＢ）作为饵料添加剂在马氏珠母贝育苗中的饵料效果。结果表明：（１）单独投喂ＰＳＢ,幼虫能生长发育并附着变态形成稚贝,但其长速,稚贝总育成率均低于单独投喂单胞藻的对照组;（２）用ＰＳＢ与单胞藻混合投喂,幼虫的长速,稚贝总育成率均高于对照组;（３）添加ＰＳＢ后,在眼点幼虫附着前不换水,幼虫的长速和眼点形成率均高于换水;但在眼点幼虫进入附着期仍不换水,则稚贝生长速度,总有成率均低     

马氏珠母贝外海深水区养殖的初步研究

采用延绳式,浮筏式,立桩式在外海深水区进行马氏珠母贝「Ｐｉｎｃｔａｄａ ｍｑａｒｔｅｎｓｉｉ（Ｄｕｎｋｅｒ）」人工养殖试验,结果表明：经１１个月的养殖,其成活率分别为延绳式５６．３％,浮筏式３２．８％,立桩式２０．８％,而 期在 水区养殖时,其成活率分别为浮筏式２８．８％,立桩式１８．５％。     

马氏珠母贝育苗方法的多因素试验

用正交试验的方法观察影响马氏珠母贝育苗效果的七个因素：ＥＤＴＡ（Ａ）、水处理（Ｂ）、换水（Ｃ）、充气（Ｄ）、光照（Ｅ）、抗菌素（Ｆ）、倒池（Ｇ）。结果表明：影响成活率的显著因素为Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ；影响贝苗生长的显著因素为Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ。加入ＥＤＴＡ、利用砂滤海水、每天换水、微弱充气、较暗的光照、使用抗菌素和定期倒池为浮游幼虫期较优的育苗方法。     

马氏珠母贝激光育苗的生物学机理

对马氏珠母贝激光育苗的机理进行研究，结果表明：激光能加强精子活力，提高精液品质；影响卵子的通透性；抑制水中的细菌生长，使受精卵发育成健壮的胚胎、幼虫、幼苗。     

马氏珠母贝人工育苗水质控制技术的探讨

马氏珠母贝Pintadamartensi（Dunker）是生产海水珍珠的主要贝类。其人工养殖主要靠人工育苗提供种苗,而种苗的生产经常出现产量不高,甚至中途失败的问题。其主要原因是水质不良。为了改善育苗期间的水质条件,我们对马氏珠母贝的常规育苗方法进行了一些改进,取得了较好的效果。现将改进工作介绍如下。互材料互．且亲贝采自海南省陵水县黎安港。贝龄约3a,壳高6．8～7．5cm。雌雄贝比例为8：1,即按8雌1雄进行选贝。1．2饵料绿色巴夫藻Pavlovaviridis,湛江等鞭藻Isochgsiszhan;iangensis,亚心形扁藻Platymonassubcordiformis,活性…     

马氏珠母贝经济性状对体重决定效应分析

采用通径分析方法研究了不同养殖区马氏珠母贝各分性状对体重的决定效应。结果表明:流沙养殖群体分性状壳长、壳高、壳宽、铰合线长、软体部重和闭壳肌重与体重间呈正相关(P<0.01),对体重的直接决定效应分别为0.091、0.072、0.029、0.002、0.089和0.001,间接决定效应分别为0.319、0.284、0.183、0.03、0.304和0.004,总决定效应分别为0.41、0.356、0.212、0.032、0.393和0.005;6个经济性状与体重间的关系在抽样断面上可用线性回归模型拟合,复相关系数达0.939(P<0.01)。6个性状3类决定效应按大小排列均为壳长>软体部重>壳宽>壳高>铰合线长>闭壳肌重。迈陈养殖群体作为验证群体,各效应值与前者有差异,但3类决定效应大小排序与前者完全相同。基于决定效应大小及性状易测性,育种目标性状的选择策略为首选壳长,二选壳高,三选壳宽。研究还发现壳宽对软体部重具有最大的决定效应,提出加大壳宽选择强度以培育大型珍珠新观点。     

马氏珠母贝珍珠囊发育的组织和组织化学研究

按照常规技术进行马氏珠母贝插核育珠,在手术后第1、3、7、15、20、30和60天解剖剪取珍珠囊,利用H E染色等组织化学方法研究马氏珠母贝珍珠囊形成过程中的组织学和组织化学变化。结果表明:珍珠囊表皮细胞来自于移植细胞小片的表皮细胞;在水温27℃条件下,插核后1~3 d来自育珠贝的游走细胞逐渐将细胞小片包围;插核后7~15 d,珠核表面密集来自育珠贝的游走细胞;插核后15～20 d,细胞小片外表皮细胞增殖形成珍珠囊,珍珠囊表皮细胞和细胞核均呈扁平状;插核后20～30 d,扁平状珍珠囊表皮细胞逐渐转变为高柱型,并分泌形成透明的壳皮层物质;在插核后第60天,已形成具有分泌珍珠质功能的扁平状珍珠囊表皮细胞,细胞核呈椭圆形或近圆形。     

4种壳色马氏珠母贝遗传规律研究

以黑、白、红、黄4种壳色马氏珠母贝选育系F6代为亲本,选取4种壳色最纯的雌雄个体各1个,采用解剖授精法和双列杂交的方法繁育子代,建立了6个杂交组合,包括4个自交组及12个正反交组。结果表明,马氏珠母贝壳色由背景色基因和前景色基因共同表达而成,位于不同的基因位点上;经过连续7代选育的4种壳色纯化度较高,壳色可以稳定遗传给下一代,其遗传规律比较复杂。黄色和白色为马氏珠母贝的背景色,白壳色贝存在母系遗传,若为隐性纯合含致死基因,黄色相对白色为显性;黑色和红色为马氏珠母贝前景色,相对无前景色为显性,黑色与红色共显。     

马氏珠母贝载脂蛋白-2基因的克隆与表达分析

以RACE技术克隆获得马氏珠母贝载脂蛋白-2(Pm-ApoL2)基因cDNA全长序列,以传统萃取法提取黄色与白色闭壳肌个体的类胡萝卜素,以荧光定量技术检测Pm-ApoL2基因在各个组织中的表达量及黄与白闭壳肌个体的Pm-ApoL2表达量。结果表明,Pm-ApoL2基因cDNA序列全长1 328 bp,开放阅读框(ORF)长705 bp,编码234个氨基酸,5′非翻译区(5′UTR)长342 bp,3′UTR长281 bp。Pm-ApoL2在肝胰腺中表达量最高,其后依次是外套膜、鳃、闭壳肌,其中肝胰脏表达量显著大于其它3个组织(P0.05)。黄、白色闭壳肌个体之间的类胡萝卜素含量和Pm-ApoL2的表达量都存在显著性差异(P0.05),且二者的类胡萝卜素含量与Pm-ApoL2表达量呈显著正相关。Pm-ApoL2基因为马氏珠母贝类胡萝卜素代谢候选基因。     

马氏珠母贝PmLec-8基因的克隆与表达分析

Lec-8(C-type lectin 8)属于C-型凝集素超家族,在机体抵抗微生物的感染过程起重要的作用。本研究采用RACE技术克隆出了PmLec-8基因cDNA全长序列,并且运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测了PmLec-8基因在马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)不同组织中的表达模式。结果显示:PmLec-8基因序列全长737 bp,其中5′UTR长为36 bp,3′UTR长为113 bp,开放阅读框(ORF)为588 bp,编码195个氨基酸,预测其分子质量约为22.90 ku,等电点为5.17;PmLec-8具在一个糖类识别结构域(Carbonhydrate-recognition domain,CRD),符合典型的C型凝集素(C-type lectin)家族特征;多序列比对结果表明物种间Lec-8的同源性较低,4个半胱氨基酸残基高度保守;qRT-PCR数据分析表明,PmLec-8在马氏珠母贝肝胰腺、性腺、闭壳肌、鳃、血细胞和外套膜中均有表达,其中肝胰腺中表达量最高,其次是鳃,差异具统计学意义(P0.05)。     

马氏珠母贝B型清道夫受体PmSR-B基因克隆与表达性分析

采用c DNA末端快速扩增技术克隆获得马氏珠母贝清道夫受体基因c DNA全长序列(Pm SR-B);利用荧光定量技术检测Pm SR-B基因在各个组织中的表达量。结果表明,Pm SR-B基因c DNA序列全长1 857 bp,开放阅读框(ORF)长1 443 bp,编码480个氨基酸,5′非翻译区(5′UTR)长89 bp,3′UTR长325 bp。预测其分子质量为54.77 ku,等电点为7.94,脂溶性系数92.94,总平均亲水性-0.120,属于疏水性蛋白;不稳定指数26.37,属于稳定蛋白。氨基酸序列同源比对结果,Pm SR-B氨基酸序列与其他物种具有一定的保守性,与华贵类栉孔扇贝(Mimachlamys nobilis)SR-B的序列的相似度高达47%。荧光定量PCR检测结果,Pm SR-B在肝胰腺中表达量最高,其后依次是鳃、闭壳肌、中央膜,各组织的表达量差异具统计学意义(P0.05)。     

马氏珠母贝近交与杂交家系的DNA甲基化多态性比较

采用甲基化敏感多态性扩增技术(MSAP)检测马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)近交(F1)与杂交(Z1)家系闭壳肌的DNA甲基化修饰水平,对部分甲基化修饰片段进行回收、测序和注释分析。结果表明:使用20对引物进行选扩增PCR,最终F1和Z1分别获得(632.20±22.58)和(588.60±25.09)条条带,差异显著(P0.05);F1和Z1之间的组织甲基化水平分别为(9.93±1.60)%和(8.04±1.25)%,差异显著(P0.05)。对回收片段进行注释,F1家系共获得9条甲基化修饰片段,其中8条为功能蛋白,分别为E3泛素连接酶、逆转录病毒多聚蛋白、神经肽受体、交叉结点核酸内切酶、磷酸糖器、苯丙氨酸解氨酶、隐花色素蛋白、脆性位点相关蛋白;Z1家系共获得5条甲基化修饰片段且均为功能蛋白,分别为脆性位点相关蛋白、神经元乙酰胆碱受体α亚基、无调性的同源蛋白、麦芽糖酶、甲基胞嘧啶双加氧酶。初步阐明马氏珠母贝近交家系F1与杂交家系Z1间的DNA甲基化修饰水平和部分具甲基化修饰位点。     

化学物质诱导对马氏珠母贝眼点幼虫附着的影响

【目的】研究血清素(5-HT)、蜕皮激素、γ-氨基丁酸(GABA)、腺嘌呤核苷、次黄嘌呤核苷和次黄嘌呤对马氏珠母贝眼点幼虫附着的影响。【方法】以不同浓度的5-HT、蜕皮激素、GABA、腺嘌呤核苷、次黄嘌呤核苷和次黄嘌呤溶液处理马氏珠母贝眼点幼虫,不同时间后,分析眼点幼虫附着率的变化。【结果】在24~96 h作用时间里,5-HT、蜕皮激素、GABA对眼点幼虫附着的诱导效果整体上均呈上升趋势;在24~120 h作用时间里,腺嘌呤核苷、次黄嘌呤核苷和次黄嘌呤对眼点幼虫附着的诱导效果整体上呈上升趋势。眼点幼虫在10^-5 mol/L的5-HT和GABA处理24、48、72和96 h后,附着率均显著高于对照组(P<0.01);10^-5 mol/L的蜕皮激素处理24 h和72 h,10^-6 mol/L的蜕皮激素处理24 h和96 h,10^-7 mol/L的蜕皮激素处理24 h,附着率均显著高于对照组(P<0.01);10μmol/L腺嘌呤核苷处理24、48、72和120 h,1μmol/L腺嘌呤核苷处理24、48、72、96和120 h,附着率均显著高于对照组(P<0.01);10μmol/L次黄嘌呤核苷处理48和72 h,1μmol/L次黄嘌呤核苷处理48、72、96和120 h,附着率均显著高于对照组(P<0.01);10μmol/L的次黄嘌呤处理72、96和120 h,附着率均显著高于对照组(P<0.01)。【结论】5-HT、蜕皮激素、GABA、腺嘌呤核苷、次黄嘌呤核苷和次黄嘌呤溶液在适宜的浓度和处理时间均可诱导马氏珠母贝眼点幼虫附着,其中10^-5 mol/L的5-HT处理24 h对附着率的诱导效果最佳,可达对照组的6.3倍。     

马氏珠母贝肠道及其养殖水体可培养细菌群落结构

【目的】了解马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)肠道及其养殖水体可培养细菌的群落组成。【方法】采用2216E平板涂布法研究海区养殖马氏珠母贝肠道与养殖水体的可培养菌群种类及丰度。【结果与结论】马氏珠母贝肠道及其养殖水体的可培养细菌归属于2门(变形菌门和厚壁菌门)3纲7目10科23属56种。属水平上,肠道中以弧菌属(74.7%)和假交替单胞菌属(18.7%)为主;养殖水体中α-变形菌纲的FJ943236_g属(40.7%)丰度最大,弧菌属(16.7%)相对肠道丰度较低。样品共有菌属为弧菌属、假交替单胞菌属、发光杆菌属和芽孢杆菌属;肠道特有菌属为希瓦氏菌属和盐单胞菌属;养殖水体特有菌属主要为FJ943236_g、鲁杰氏菌属和Nautella。在种水平上,7个种为二者共有;马氏珠母贝肠道和养殖水体特异性菌种分别为18个和31个。虽然门水平上马氏珠母贝肠道中可培养细菌群落与其养殖水体中的细菌群落大致相似,但在属、种水平上二者差异明显。     

流沙湾海区不同规格马氏珠母贝氨基酸组成的研究

以小(S)、中(M)和大(L)3种规格组马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)为材料,分析不同发育阶段马氏珠母贝的常规营养成分和氨基酸组成变化。结果表明:S组、M组和L组的粗蛋白质量分数分别为59.96%、65.48%和66.80%,粗脂肪质量分数分别为4.06%、4.51%和5.83%,粗灰分质量分数分别为22.24%、18.34%和16.90%,无氮浸出物质量分数分别为13.75%、11.66%和10.48%;S组、M组和L组马氏珠母贝软体部必需氨基酸(EAA)的质量分数分别为17.55%、18.76%和19.44%,必需氨基酸占总氨基酸比率(EAA/TAA)分别为36.57%、36.57%和36.89%;呈味氨基酸(DAA)的质量分数分别为22.50%、24.01%和24.31%,呈味氨基酸占总氨基酸比例(DAA/TAA)分别为46.89%、46.79%和46.26%。随着贝体的生长发育,粗蛋白和粗脂肪的质量分数逐渐升高,粗灰分和无氮浸出物的质量分数逐渐降低;各氨基酸(Gly除外)质量分数呈升高的趋势,且EAA和DAA的质量分数显著升高(P0.05)。     

不同温度下马氏珠母贝干露耐受能力及其免疫相关基因表达的变化

【目的】探究马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)对干露胁迫的响应,为马氏珠母贝健康养殖和遗传育种提供基础资料。【方法】在不同温度下对马氏珠母贝进行干露胁迫,探究温度对马氏珠母贝干露耐受的影响;筛选出马氏珠母贝干露胁迫敏感组和耐受组,比较两组的免疫相关基因表达量和植核后休养期存活率。【结果】(1)22~34℃条件下,马氏珠母贝干露耐受能力随温度升高及干露时间延长而降低;(2)22℃下,S组和T组的脯氨酸羟化酶(PHD)、葡萄糖转运蛋白(GLUT)、髓样分化因子(MYD88)、热休克蛋白(Hsp70、Hsp20)和凋亡抑制因子(cIAP)6个基因在干露过程中表达量基本呈上升趋势,组间差异显著(P<0.05);(3)植核试验结果表明耐受组植核后休养期的存活率显著高于敏感组(P<0.05)。【结论】马氏珠母贝在高温环境下干露耐受能力降低,在适温条件下耐受组比敏感组表现出较高的存活率。     

马氏珠母贝TRACP基因的克隆及组织表达

【目的】克隆马氏珠母贝(Pinctada martensii)抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate resistant acid phosphatase,TRACP)基因,分析该基因在不同组织中的表达模式。【方法】用RACE技术克隆得马氏珠母贝TRACP基因(PmTRACP),用实时荧光定量PCR分析该基因在外套膜、闭壳肌、足、性腺、珍珠囊、肝胰腺和鳃中的表达。【结果与结论】PmTRACP基因长度为2 034 bp,开放式阅读框972 bp,编码323个氨基酸,5′UTR长度为27 bp,3′UTR长度为1 035 bp。预测PmTRACP分子质量约为36.39 ku,理论等电点为5.97。该基因含有一个钙调神经磷酸酶样磷酸酯酶结构域。PmTRACP与其他物种TRACP的同源性为48%～65%,与长牡蛎(Crassostrea gigas)TRACP的同源性最高,同时D³²、D⁷⁰、Y⁷³、N¹⁰⁸、H²⁰³、H²¹²、H²³⁷、H²³⁹等8个氨基酸活性位点和N¹¹⁴糖基化位点在不同物种TRACP中高度保守。PmTRACP与长牡蛎TRACP的亲缘关系最近。PmTRACP在马氏珠母贝各个组织均有表达,且在肝胰腺和珍珠囊中高表达。