高位池养殖对虾携带白斑综合症病毒变化

采用实时荧光定量 PCR 技术研究6口高位池塘斑节对虾和凡纳滨对虾携带WSSV变化,结果表明:养殖过程中凡纳滨对虾WSSV携带量最高为9.7×105拷贝/g;斑节对虾最高携带量为9.5×105拷贝/g.凡纳滨对虾WSSV感染率分别为:苗种没有携带WSSV;30d为80.0%;60 d为90.O%;90 d为90.0%;120 d为93.3%,斑节对虾潜伏感染率分别为:苗种没有携带WSSV;30d为73.3%;60d为83.3%;90d为90.O%:120d为96.7%.     

感染溶藻弧菌及白斑综合症病毒后凡纳滨对虾不同组织的Toll样受体基因表达变化研究

为研究不同类型Toll样受体基因在凡纳滨对虾免疫调控机制中的作用,实验首先通过荧光定量PCR方法检测了凡纳滨对虾3种Toll样受体基因在不同组织中的表达情况。结果表明凡纳滨对虾3种Toll样受体基因m RNA在各组织中均有表达。其中,Toll1基因在肌肉,血淋巴,心脏和鳃均有较高表达,心脏表达量最高;Toll2基因在血淋巴,心脏和鳃均有较高表达,其中在鳃表达量最高;Toll3基因在鳃和心脏有较高表达,其中在鳃表达量最高。实验还对人工感染溶藻弧菌及白斑综合症病毒后凡纳滨对虾3种Toll样受体基因在不同免疫组织的表达变化差异进行研究。感染白斑综合症病毒后凡纳滨对虾血淋巴及鳃中3种Toll样受体基因表达量均显著提高,并在各自达到表达峰值后逐渐下降直至恢复到感染前水平。感染溶藻弧菌后凡纳滨对虾血淋巴中3种Toll样受体基因表达量均显著提高;鳃中Toll1及Toll3表达量分别于感染后3h和12h有显著提高,而Toll2表达量无显著提高。由此推测3种Toll样受体基因均可能参与白斑综合症病毒感染所引起的免疫调控;而在溶藻弧菌感染所引起的免疫调控中,除了Toll1,Toll3参与鳃的免疫调控外,Toll2基因还参与血淋巴中的先天性免疫调控。长期感染白斑综合症病毒或溶藻弧菌后,凡纳滨对虾3种Toll样受体基因在血淋巴与鳃中的表达量均显著升高,这可能与虾体在长期感染过程中,需要不断保持较高免疫水平有关。     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)Runt转录因子的基因克隆及其功能分析

Runt结构域转录因子家族(Runx)在哺乳动物体内存在三种基因型,分别起着造血,骨生成和控制上皮细胞增殖的作用。本文应用反转录和c DNA末端快速扩增(RACE)技术,首次在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)中克隆并测序了一种Runt(lvrunt)基因全长。lvrunt c DNA全长1754bp,含有1个663bp长的开放阅读框,编码221个氨基酸,理论分子量为23.6k Da,具有Runt-family结构域。对凡纳滨对虾鳃、肠、肝胰腺、类淋巴、心脏、肌肉组织和血淋巴lvrunt的转录特征进行分析,结果显示该基因几乎特异性地在血淋巴细胞中表达,而在其他组织中表达较低。肌肉注射重组造血激素蛋白(r AST)或白斑综合征病毒(WSSV)粗提液均可显著提高lvrunt在凡纳滨对虾体内的转录表达。上述结果提示,lvrunt主要在血细胞发挥作用,可能作为造血激素的下游基因起到调节血细胞增殖和分化的作用,并在受到病毒感染后,参与提升血细胞数量或者促进血细胞分化的过程。     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)造血激素的组织分布及细胞定位分析

造血激素(astakine)是一种具有促进造血组织细胞分化和增殖作用的甲壳动物细胞因子,参与甲壳动物的造血活动,对于只依赖于非特异性免疫的甲壳动物抗感染能力有重要的意义。本实验室前期成功克隆凡纳滨对虾造血激素(LvAST)的基因Lvast。为了进一步了解其功能,本文通过实时荧光定量PCR技术检测了Lvast表达的组织分布,同时还用Dlight标记抗LvAST抗体进行了LvAST在对虾细胞和组织中的免疫荧光定位分析。荧光定量PCR测定结果说明,Lvast主要在肝胰腺、鳃和肌肉中大量表达,而淋巴器官和血淋巴细胞中表达量较低;免疫荧光结果显示,LvAST可同时存在于血淋巴细胞内和血淋巴细胞膜表面,不同的血淋巴细胞表面的LvAST分布呈现出明显差异,可能具有重要的血细胞分类意义。LvAST蛋白在肝胰腺、鳃、肌肉、淋巴器官等组织中均有分布,并且肝胰腺组织中分布较多,淋巴器官组织中分布较少。     

高盐和温度对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)受精卵孵化及幼体发育的影响

实验以凡纳滨对虾受精卵和各期幼体为试验材料,探讨了高盐和温度对受精卵孵化和幼体发育的影响,以及各期幼体对高盐的耐受性。结果表明,高盐胁迫和温度显著影响受精卵的孵化率、初孵时间和集中孵化时间(P0.05)。随盐度和温度升高,平均孵化率呈先升高后降低的变化趋势,盐度30和温度32°C时孵化率最高。盐度由33升至36时孵化率由74.67%下降到50.79%,盐度39时孵化率仅为3.42%,盐度42无幼体孵出。受精卵最早可在7.5h左右完成幼体破膜孵化。同一温度下,初孵时间随盐度的升高而延长。盐度27—33和温度30—33°C时,受精卵集中于胚胎发育后的7.5—11.5h完成孵化,时间最短;溞状幼体对高盐胁迫的耐受性随变态发育逐渐提高,表现为Z3Z2Z1;糠虾各期幼体及仔虾P1—P3间耐盐性均无显著差异(P0.05)。此外,幼体的发育指数也随盐度升高而下降,盐度越高,幼体发育越慢。结果说明,高盐和低温会抑制凡纳滨对虾受精卵孵化和幼体变态,受精卵孵化的盐度上限在39—42之间。     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)鳃细胞膜蛋白与WSSV的结合活性以及BP53的初步研究

实验提取了凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的鳃细胞膜并采用2种非离子型表面活性剂TritonX-100和Tween-20增溶鳃细胞膜,通过ELISA方法证实增溶后的对虾鳃膜蛋白与WSSV有结合活性,对其中1种鳃膜蛋白BP53进行了MALDI-TOF-MS-MS质谱测序,并且经BLASTP对其保守域进行了分析,结果表明BP53鳃膜蛋白与ATP ase-β-subunit同源性最高。     

盐度、pH变化对凡纳滨对虾鳃丝Na+-K+-ATPase活力的影响

本文研究了盐度、pH变化对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)鳃丝Na -K -ATPase活力的影响.结果表明:盐度、pH变化对凡纳滨对虾鳃丝Na -K -ATPase活力的影响显著(F》F0.01).在盐度变化(30→5)3d内,各处理组鳃丝Na -K -ATPase活力随着处理时间的增加逐渐升高;至3～15d时,不同盐度下鳃丝Na -K -ATPase活力趋于稳定,与对照组相比酶活力明显升高(F》F0.05),而且盐度越低酶活力越大.在pH变化(7.0←8.0→9.5)3d内,各处理组鳃丝Na -K -ATPase活力随着处理时间的增加呈峰值变化,表现为向低pH和向高pH变化分别于9h和12h达到最大值,至3d时均恢复正常;在pH变化3～12d内,不同pH环境下鳃丝Na -K -ATPase活力无明显差异(F《F0.05).     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)感染白斑症病毒(WSSV)后大颗粒血细胞的变化

采用抗凡纳滨对虾大颗粒细胞的单克隆抗体，应用免疫细胞化学方法，分析了凡纳滨对虾人工感染白斑症病毒(WSSV)后血细胞中大颗粒细胞的变化。研究表明，凡纳滨对虾感染WSSV后，大颗粒细胞的细胞质较正常细胞的多；从WSSV感染凡纳滨对虾的第1天至第3天，大颗粒细胞的数量增加幅度较大。同时，大颗粒细胞占血细胞总数的比例也增加较大：第1天为15．2％，第2天为18％，第3天增大到45．9％，而后大颗粒细胞的比例稍有下降，到第8天下降到43．3％，但仍明显高于对照组(健康虾的大颗粒细胞比例为15．2％)。     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)亲虾繁殖期水体微生物多样性

为了揭示凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)繁殖期亲虾养殖水体的微生物多样性,我们比较了雌雄虾养殖水体细菌群落结构差异,采用Illumina HiSeq高通量测序方法对凡纳滨对虾亲虾养殖水体细菌的16S rRNA基因的两个高变区(V3-V4)进行测序分析,并进行了α-多样性指数和β-多样性指数分析。结果表明:雌雄虾养殖水体细菌群落的α-多样性指数中Chao1,ACE和Goods-coverage指数无显著差异(P0.05),而Observed-species,Shannon和Simpson指数有显著性差异(P0.05)。主坐标分析和聚类热图分析表明雌雄虾养殖水体的细菌群落结构不同,变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为两者共同的优势菌门,但其相对丰度有一定差异,在雄虾养殖池水体中相对丰度分别为76.15%和21.28%;在雌虾养殖池水体中相对丰度分别为66.01%和29.02%。两者的核心微生物群(属水平)明显不同,雄虾养殖水体的核心属主要包括Glaciecola、Octadecabacter、Methylobacterium、Psychroserpens、Olleya;雌虾养殖水体的核心属主要包括Pseudomonas、Polaribacter、Pseudoalteromonas、Vibrio、Arcobacter、Synechococcus、Hyphomonas、Paracoccus、HTCC、Thalassomonas、Thalassobius、Owenweeksia等,其中包括了Vibrio、Pseudomonas和Owenweeksia等病原相关菌类。该实验结果对凡纳滨对虾育苗阶段亲虾的健康管理、病害诊断及防治具有重要意义。     

盐度对凡纳滨对虾幼虾消化酶活性的影响

采用酶学分析方法,在盐度为1,15和30的条件下,对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei Boone)幼虾消化酶活性进行测定。实验结果表明:(1)幼虾肝胰腺中,当盐度为1时,胃蛋白酶活性最高[29.58μg/(mg..min)],胰蛋白酶活性[92.46μg/(mg.min)]与盐度为15时的值[97.60μg/(mg.min)]相当;胃肠中,胰蛋白酶和胃蛋白酶活性均以盐度为1时最高。(2)当盐度为1时,肝胰腺和胃肠中脂肪酶活性最大,但统计分析各组间差异不显著(P>0.05)。(3)肝胰腺中,各盐度组的淀粉酶活性很接近,组间无显著差异(P>0.05);胃肠中,盐度为1时的淀粉酶活性最高,达109.29μg/(mg.min),显著高于盐度为15,30时的活性(P<0.05)。     

凡纳滨对虾在盐度变化下免疫机能评价的研究

研究凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)在盐度变化下免疫机能的评价指标。结果表明:盐度变化对凡纳滨对虾血细胞数量、吞噬率和血淋巴酚氧化酶、溶菌、α2-巨球蛋白活力的影响显著(P<0.05),而对照组各免疫指标无明显变化。凡纳滨对虾在盐度变化1d内3类血细胞和总血细胞数量明显下降,1d后趋于稳定,且与盐度值呈正相关;血细胞吞噬率和血淋巴酚氧化酶、溶菌和类α2-巨球蛋白活力在3d内呈峰值变化,其中血细胞吞噬率、溶菌活力均于0.5d时达到最小值,血淋巴酚氧化酶、类α2-巨球蛋白活力分别于0.5d或1d时达到最大值,同时各免疫指标与盐度变化呈明显的正、负相关性,3d后均恢复至对照组水平。结合凡纳滨对虾在盐度变化下的免疫响应机制和免疫适应性,提出血细胞吞噬率和血淋巴溶菌活力可作为衡量对虾在盐度变化下免疫健康水平的指标。     

凡纳滨对虾对多巴胺免疫响应的研究

研究凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)对多巴胺的免疫响应。结果表明:注射多巴胺对凡纳滨对虾血细胞数量、吞噬率和血淋巴酚氧化酶、溶菌、类α2-巨球蛋白活力影响显著(P<0.05),而对照组各免疫指标无明显变化。在实验时间内,多巴胺处理组各指标均呈峰值变化,3类血细胞、总血细胞数量和血淋巴类α2-巨球蛋白活力在3h时分别达到最小值和最大值,而血淋巴酚氧化酶、血细胞吞噬率和血淋巴溶菌活力于6h时分别达到最大值和最小值,同时各免疫指标变化与多巴胺的注射剂量具有明显的负、正相关性;其中颗粒细胞、半颗粒细胞数量和血淋巴酚氧化酶、类α2-巨球蛋白活力在12h后趋于稳定,透明细胞、总血细胞数量和吞噬率于18h后保持稳定,而溶菌活力在24h后保持平稳,稳定后各免疫指标均恢复至对照组水平。这说明多巴胺对凡纳滨对虾血细胞具有明显的调节作用,能在短时间内引起对虾免疫力的显著下降,并表现出明显的剂量效应性。     

温度周期性波动对凡纳滨对虾稚虾蜕壳和蜕壳激素含量的影响

采用实验生态学方法,以温度25℃为对照,研究了四种温度波动幅度(25±1、25±2、25±3、25±4℃)对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)稚虾蜕壳率争蜕壳激素滴度的影响.主要实验结果如下:(1)25±3℃和25±4℃组对虾的蜕壳率显著高于其他各处理组(P＜0.05).(2)5种温度处理下,对虾血...     

注射生物胺对凡纳滨对虾鳃丝离子转运酶活力和血淋巴渗透压的影响

本文研究了注射生物胺(多巴胺、5-羟色胺)对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)离子转运酶活力和渗透压的影响。结果表明:注射生物胺(DA、5-HT)对凡纳滨对虾鳃丝总AT- Pase、Na -K -ATPase、V-ATPase活力的影响均显著(P<0．05)．而对HCO3--ATPase活力和渗透压的影响不显著(P>0．05),而对照组渗透生理指标无明显变化。注射DA组AT- Pase、Na -K -ATPase活力在6h内呈峰值变化,分别在1h、3h达到最大值,在6-12h时稳定在对照组水平,12h后逐渐升高,于36h时达到最大值后降低,而V-ATPase活力在实验时间内呈阶段式升高现象,在36h达最大值后降低;注射5-HT组ATPase、Na -K -ATPase活力随取样时间增加而降低．至9h达到最小值,9h后趋于稳定,V-ATPase活力在48h内与对照组差异不显著。注射DA、5-HT处理组血淋巴渗透压分别在6h、9h内呈明显的峰值变化．分别在1h、6h达到最大值,然后分别在6h、9h后趋于稳定,并恢复至对照组水平。     

中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)血细胞中一氧化氮合成酶的鉴定及其在白斑综合症病毒感染过程中的变化

诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)在生物机体免疫，特别在无脊椎动物免疫中的作用近来得到了广泛的关注，由其催化产生的一氧化氯(NO)除具有已知的神经传导、松弛平滑肌等功能外，还具有抗菌、抗病毒、抗寄生虫等作用。作者通过硝基四氯唑蓝(NBT)法和血细胞形态观察等方法，对中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)血细胞中存在的诱导型一氧化氮合成酶进行了初步鉴定。在此基础上，通过亚硝酸盐法和L-瓜氨酸法对比，研究了感染白斑综合症病毒(WSSV)后中国明对虾血细胞中一氧化氯合成酶的变化情况。结果显示，中国明对虾在感染WSSV后，iNOS活性在12h内有上升趋势，实验36h后酶活性显著下降，至60h后酶活性降至对照组的一半左右。同时，被脂多糖(LPS)诱导的一氧化氮合成酶活性与对照相比也有显著下降。与此对应的是，核酸探针斑点杂交法检测病毒的结果显示：实验36h后在对虾体内能够检测到白斑综合症病毒。对照组中国明对虾血细胞的iNOS在实验过程中基本保持稳定。这说明WSSV在感染中国明对虾初期可以诱导血细胞产生iNOS，但随着WSSV在中国明对虾体内的大量增殖及其对血细胞的破坏，使得iNOS活性显著降低，对虾也趋于死亡。因此，iNOS能够作为反映对虾在病毒感染过程中健康状况的有效指标。     

低溶解氧对凡纳滨对虾酚氧化酶原激活系统和相关免疫因子的影响

本文研究了凡纳滨对虾在低溶解氧条件下酚氧化酶原系统的激活机制。结果表明:低溶氧(1.5mg/L,3.0mg/L)胁迫对凡纳滨对虾血淋巴中多巴胺含量、血细胞数量、酚氧化酶原激活系统相关酶活力、血淋巴中类α2-巨球蛋白活力影响显著(P<0.05),且各指标表现出明显的时间效应性。在实验时间内,DO为3.0mg/L处理组,总血细胞、小颗粒细胞和透明细胞数量均在12h内降低而后趋于稳定,大颗粒细胞数量在24h内降低后保持稳定,DO为1.5mg/L处理组,总血细胞数量和三类血细胞数量均在24h内降低而后趋于稳定;DO为3.0mg/L和1.5mg/L处理组凡纳滨对虾血淋巴中多巴胺含量分别在24h、12h内呈峰值变化,至12h、6h时达到最大值,在24h、12h后恢复至对照组水平并趋于稳定;血细胞中酚氧化酶原活力分别在12h、6h时显著降低,且均在24h时趋于稳定;丝氨酸蛋白酶活力在6h时均显著降低,在24h时达到最低值,而后趋于稳定,蛋白酶抑制剂活力显著降低,但类α2-巨球蛋白活力48h内呈峰值变化,与对照组比较均显著升高,48h后趋于稳定。实验期内对照组DO为5.5mg/L各指标变化不显著。     

去眼柄对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)稚虾耗氧率昼夜节律的影响

采用流水装置测定去眼柄对凡纳滨对虾稚虾 (Litopenaeusvannamei)耗氧率昼夜节律的影响。实验水温为 2 5℃± 0 .5℃ ,实验虾规格为 (2 .2 6 6± 0 .0 13) g。实验结果表明 :1、去眼柄对凡纳滨对虾稚虾耗氧率的高峰和低峰发生的时间产生影响。正常组对虾耗氧率的高峰多发生在夜间 ,低峰多发生在日间 ;去眼柄后 ,对虾耗氧率的高峰和低峰则大都发生在日间 ;2、去眼柄对虾的日间和夜间的平均耗氧率差异不显著 (P >0 .0 5 ) ,而正常对虾夜间平均耗氧率显著高于日间 34.79% (P <0 .0 5 ) ;3、去眼柄对对虾的平均耗氧率未产生显著的影响(P >0 .0 5 )。     

PCR检测对虾白斑综合征病毒(WSSV)中假阴性的探讨

采用PCR、核酸探针斑点杂交、组织切片等方法研究了PCR检测白斑综合征病毒(WSSV)中的假阴性问题。设计了一对引物用于PCR检测WSSV,PCR扩增的产物长度为235bp,检出极限为0.1pg WSSV DNA。结果表明,PCR检测15例攻毒螯虾鳃样品时出现一例阴性,而经10—106倍稀释后的样品却呈现阳性,推断PCR出现了假阴性。核酸探针斑点杂交及组织切片结果表明注射WSSV的螯虾鳃组织确已被严重感染,进一步证实了PCR假阴性。根据PCR的检出极限及模板稀释梯度,推算出该PCR能成功扩增的引物与模板浓度的比例范围约为2.4×105—2.4×1010。