牙鲆(Paralichthys olivaceus)β诺达病毒衣壳蛋白重组表达及复性条件优化

β诺达病毒利用其缺乏校正功能的聚合酶进行基因组复制,易导致突变,因而具有广泛的宿主感染性,而且可引发致死率极高的病毒性神经坏死症,需要有针对性地研究检测及防御方法。本研究以感染牙鲆(Paralichthys olivaceus)的β诺达病毒为对象,利用引物设计,将His标签编码序列连接到完整病毒衣壳蛋白C端,构建原核表达载体;采用SDS-PAGE及质谱对表达产物进行分离和鉴定;重组衣壳蛋白经镍离子亲和柱纯化后进行复性条件的正交优化。结果表明4个肽段经质谱鉴定与预期一致;纯化产物产量可达36mg/L;4°C条件下,复性缓冲液中尿素和PBS的最适浓度为0.8mol/L和0.05mol/L。本研究建立的制备方案可为研制相关疫苗以及开发针对该病毒的快速检测产品等提供有价值的参考。     

单环刺螠硫醌氧化还原酶的表达、纯化和复性

硫化物是1种广泛分布的有毒物质。硫醌氧化还原酶(SQR)是硫化物代谢的关键酶。单环刺螠是1种生活在潮间带下区及潮下带中的底栖生物。本研究为了获得具有活性的单环刺螠SQR,将其基因的开放阅读框cDNA克隆到原核表达载体pET28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行重组蛋白的表达,后采用稀释复性的方法对重组蛋白进行复性。经IPTG诱导后该重组蛋白主要以包涵体形式存在。用8 mol/L的尿素溶解包涵体后,通过镍离子金属螯合柱纯化获得重组蛋白。首次通过蛋白复性的方法获得具有活性的单环刺螠SQR,确定最佳稀释复性条件为pH=8.0,蛋白浓度20μg/mL,L-精氨酸浓度0.2 mol/L,还原型谷胱甘肽∶氧化型谷胱甘肽=10∶1,复性时间为96 h。     

雨生红球藻虾青素合成关键酶的原核表达及纯化

雨生红球藻是天然虾青素的重要来源,在胁迫条件下积累虾青素含量能达到细胞干重的5%。八氢番茄红素合成酶(PSY)、β-胡萝卜素酮化酶(CRTW)和β-胡萝卜素羟化酶(CRTZ)是雨生红球藻虾青素合成的关键酶,本研究分别以雨生红球藻的DNA和cDNA为模板,克隆了这三个基因,并构建不同的原核表达载体pET-24a-crtw,pET-24a-crtz,pET-24a-psy。转化大肠杆菌Rosetta感受态,经IPTG诱导后,SDS-PAGE和western blotting结果显示三种重组蛋白都能够正常表达,利用6×His标签对重组蛋白进行纯化能得到相对单一的条带,相对于纯化前目的条带明显加深。ELISA检测重组菌株E.coli RZ,E.coli RW,E.coli RP中的酶活性分别为3.0,10.5,10.0 IU/L,纯化后酶活性显著提高,分别为125.5,124.7,118.0 IU/L。本研究获得了这三种酶的活性重组蛋白,为其功能分析和抗体制备奠定了基础。     

对虾白斑综合症病毒核衣壳蛋白WSV308的鉴定

结合SDS—PAGE电泳和质谱分析，发现了一分子量为51kDa的蛋白，它是对虾白斑综合症病毒基因ORFwsv308的表达产物．将wsv308克隆到pET—His表达载体，以E．coliBL2l为宿主菌，成功表达并纯化目的蛋白后制备抗体。Western blot实验中蛋白特异抗体只与完整的病毒和核衣壳裂解蛋白中的WSV308反应，而不和膜蛋白反应，证明wsv308所编码的蛋白在完整病毒颗粒上定位于核衣壳．免疫电镜定位中金颗粒只特异地标记在核衣壳表面上，不存在于完整病毒表面上．     

重组七鳃鳗PHB2蛋白的原核表达及纯化

为了研究PHB2蛋白的生物学活性及后续抗体的制备,作者以前期构建的p MD18-T-Lm-PHB2质粒为模板,PCR扩增Lm-PHB2基因全长CDS区,PCR产物经Hind III和Eco R I双酶切后连接至表达载体p ET-32a,构建重组质粒p ET-32a-Lm-PHB2。将鉴定正确的重组质粒转化入大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta Blue,经IPTG诱导表达后,表达产物通过SDS-PAGE和Western blotting进行检测,利用镍柱亲和层析纯化得到纯度较高的目的蛋白r Lm-PHB2。结果表明,经PCR、双酶切和测序鉴定,所构建的重组质粒p ET-32a-Lm-PHB2序列正确,表达产物存在于裂解菌液的上清和沉淀中,经SDS-PAGE和Western blotting证实在约47 ku处有目的蛋白r Lm-PHB2的表达条带。本研究构建了重组七鳃鳗(Lampetra japonica)PHB2蛋白的原核表达载体,并大量表达和纯化目的蛋白,为该蛋白后续的抗体制备及生物活性研究奠定了基础。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)生长激素体外重组表达及活性分析

根据半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)生长激素(GH)基因的c DNA全长序列设计引物克隆得到其全长552个碱基成熟肽序列。利用RT-PCR方法将扩增片段克隆到原核表达载体p ET-28a上,实现了GH成熟肽在大肠杆菌BL21(DE3)中的融合表达。融合蛋白分子量为26 k Da,在IPTG诱导4h时目的蛋白表达量最高,占细菌总蛋白的41.5%,主要以包涵体形式存在。Western-blotting分析表明GH融合蛋白可特异性地被6×His抗体识别。诱导表达后的菌液沉淀经纯化和复性后,获得大小为26 k Da的纯化GH融合蛋白。以ELISA方法检测纯化后的GH融合蛋白显示其具有免疫学活性。本研究为认识半滑舌鳎生长轴的调控机制提供了基础资料。     

鲨肝刺激物质类似物基因在大肠杆菌中的表达与产物活性分析

构建了鲨肝刺激物质类似物基因片段的原核表达载体质粒 (pET-sHSS) ,转化大肠杆菌后通过IPTG诱导获得原核表达产物 ,并利用凝胶层析方法对表达产物进行了分离纯化 ;进一步利用MTT比色法研究了该重组产物对肝癌细胞株SMMC -7721的增殖影响。结果表明 ,在1mmol/L的IPTG的诱导下 ,鲨肝刺激物质类似物基因片段在大肠杆菌BL21菌株中获得表达 ,表达产物的相对分子质量大小约为17500u,占菌体可溶性蛋白总量的38%左右 ;纯化后的产物在低浓度下 (<50ng/L)具有明显刺激SMMC7721细胞株增殖的活性 ,高浓度下 (>100ng/L)则明显抑制该肿瘤细胞株的生长 ,与天然鲨肝刺激物质的生物活性类似     

单环刺螠转录因子基因Sp8的克隆、原核表达和重组蛋白纯化

转录因子Sp是一类广泛存在的锌指蛋白超家族成员,可与某些基因的上游调控序列结合,参与基因的转录调控。本研究采用同源克隆和RACE技术,获得单环刺螠的Sp8的全长cDNA,该序列长1 913bp,开放阅读框1 521bp,编码506个氨基酸;将其开放阅读框cDNA克隆到原核表达载体pET28a中,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,在37℃条件下,经1mmol/L IPTG诱导表达4h,获得以包涵体形式存在的重组蛋白pET28a-SP,使用8mol/L尿素溶解包涵体,并通过镍离子金属螯合柱纯化获得重组蛋白,SDS-PAGE分析该蛋白的分子量约为50kD。Sp8蛋白体外表达的成功将为研究单环刺螠相关基因的转录调控打下基础。     

副溶血弧菌trh基因的克隆、表达及基因缺失株的构建

利用PCR方法从VP基因组DNA中扩增出trh溶血素基因,构建了大肠杆菌原核表达载体,对trh进行了表达和纯化,经溶血活性检测,复性蛋白具有溶血活性.同时还构建了trh基因缺失株,对trh基因进行了基因敲除研究.结果表明,单独敲除trh基因并不能够影响菌株的溶血活性,说明副溶血弧菌还存在其它溶血素基因.     

大黄鱼β-actin 抗体的制备与组织表达谱分析

为探讨大黄鱼(Larimichthys crocea)β-actin基因(Lc Actb)作为内参基因进行相关研究的可行性,从转录和翻译水平研究其组织表达谱,作者以大黄鱼肝脏为材料,扩增Lc Actb的开放阅读框序列,并将其亚克隆至原核表达载体p ET32a(+)。酶切、测序结果表明,p ET32a-Lc Actb构建成功。将p ET32a-Lc Actb转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行优化表达,表达蛋白经纯化后进行Western blotting验证;原核表达结果表明,IPTG可诱导一个分子量约45 ku的特异蛋白,且主要以包涵体的形式存在,优化表达条件为:28℃、0.4mmol/L IPTG、200 r/min诱导表达5 h。用表达蛋白作为抗原,免疫新西兰白兔制备抗Lc Actb的多克隆抗体;用纯化的多抗进行Western blotting的结果表明,获得了特异性的Lc Actb抗体;通过实时荧光定量RT-PCR检测大黄鱼多种组织m RNA的表达,其次,制备了多种组织匀浆蛋白,使用纯化的抗体进行Western blotting分析,结果显示,Lc Actb在大黄鱼成体各组织中转录和翻译水平的表达差异均不显著,可做为研究大黄鱼成体组织中其他基因表达和翻译水平的内参标准。     

栉孔扇贝(Chlamys farreri)中抗氧化肽的分离纯化及性质研究

以栉孔扇贝内脏团为原料,对其中抗氧化肽的制备、纯化及性质进行了研究。首先采用硫酸铵沉淀、DEAE-Sephadex A-50阴离子交换层析的方法,进行了扇贝提取蛋白的制备,其次采用海洋蛋白酶YS-80水解、SephadexG-25凝胶层析的方法,进行扇贝抗氧化肽的制备,获得多肽粗品(海洋肽,PCF),并进一步采用CM Sepharose阳离子交换层析和反相高效液相色谱的方法,对扇贝抗氧化肽进行了纯化,结果得到组分PCF-3A,反相高效液相显示为单一峰。采用茚三酮反应、Sephadex G-15凝胶层析和AccQ.Tag氨基酸分析柱,进行了PCF-3A的理化性质研究。结果表明,茚三酮反应呈阳性;分子量约为794D;由7种氨基酸组成,分别为天冬氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、赖氨酸和脯氨酸。采用邻苯三酚自氧化体系和Fenton反应体系对PCF-3A的抗氧化活性进行了研究,发现该肽可有效清除羟自由基和超氧阴离子,半抑制浓度(IC50)分别为0.39mg/ml和2.85mg/ml,具有明显的抗氧化、抗衰老作用。     

水母毒素蛋白凝聚现象的初步研究

通过测定水母毒素的凝聚速度,来初步研究水母毒素蛋白的凝聚现象,这为水母毒素蛋白的提取利用及研究毒素蛋白的结构、稳定性、生物活性等提供重要参考依据.实验结果表明,在0.01mol/L,pH 6的磷酸缓冲溶液中,0.003mol/L的Vc、EDTA、苯甲酸均能降低水母毒素蛋白的凝聚速度;蔗糖对水母毒素的抗凝聚现象不明显.     

南极半岛近岸海域生物化学要素分布特征及影响因素

基于中国第30次南极科学考察在南极半岛(60°~63°S)近岸海域获取的调查资料,分析了该海域生物化学要素中溶解有机碳(DOC)、总氮(TN)和总磷(TP)分布特征并讨论地形和水团对其的影响。结果表明:2014年夏季南极半岛近岸海域水体DOC浓度变化范围为40.5~78.1μmol/L,平均浓度为66.3μmol/L;TN浓度变化范围为4.2~29.5μmol/L,平均浓度为14.9μmol/L;TP浓度变化范围为0.8~2.9μmol/L,平均浓度为2.0μmol/L。表层DOC呈现研究海域西北部D1断面和东南部D5断面浓度较高,中部DOC浓度较低;表层TN与TP浓度高值区出现在研究海域西部D1断面北部以及南部,中部和东部浓度较低;DOC,TN和TP浓度的垂直分布与海底地形和水团交汇密切相关,水团运动受阻于地形致使生物化学要素在垂直方向再分布。DOC,TN和TP空间分布反映了南极半岛近岸海域生物化学要素复杂的流通,将为合理开发和利用南极资源及环境影响评价提供科学依据。     

菲律宾蛤仔碱性磷酸酶的分离纯化及部分性质研究

经Tris-HCl缓冲液浸提、硫酸铵分级沉淀盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析等步骤,从菲律宾蛤仔内脏团中分离得到碱性磷酸酶,SDS-PAGE显示为单一条带,提纯倍数为14.42,比活力达到131.08U/mg。酶学性质研究表明:该酶亚基分子量约44kD,最适反应温度为45℃,最适pH值为9.0,米氏常数Km为0.098mmol/L,最大反应速度Vmax为1.01μmol/(mL·min)。Ca2+、Mg2+对酶活力表现出显著的激活作用。     

硒对华贵栉孔扇贝碱性磷酸酶的酶动力学及理化性质研究

探讨了微量硒(Se~(4+))对华贵栉孔扇贝(Chlamys nobilis(Reeve))碱性磷酸酶(AKP)的作用。以催化动力学原理研究了不同缓冲系统中微量硒时AKP的影响。结果表明,Se~(4+)对谈酶的作用与酶所处的环境有关。在0.05 mol/L Na_2CO_3-NaHCO_3(pH 9.0)缓冲溶液中Se~(4+)浓度小于12.5 mmol/L时呈现出激活作用;Se~(4+)浓度大于12.5 mmol/L时呈现出非竞争性的抑制作用,其抑制常数为6.81×10~(-2)mol/L。在0.05 mol/L Tris-HCl缓冲系统(pH 9.0)中,微量Se~(4+)对AKP具有强烈竞争性抑制作用,其抑制常数为3.79×10~(-1)mol/L。经紫外吸收光谱、荧光发射光谱和圆二色谱的实验表明,微量Se~(4+)与AKP作用后,该酶的构象已发生了变化。研究发现海水环境中若含有微量Se~(4+)(SeO_3~(2-)),可以促进扇贝AKP的水解。利于贝类的生长发育和外壳的形成,并有益于贝类的繁殖。     

Physiological differences in the growth and maturation of Eisenia bicyclis and Ecklonia cava gametophytes in Korea

The objective of this study was to examine the eff ects of temperature and light intensity on growth of female gametophytes of Eisenia bicyclis and Ecklonia cava and responses of these female gametophytes to Fe addition and daylength. Female gametophytes of each species were cultured at four temperatures (10, 15, 20, and 25°C) and under a combination of four light intensities (10, 20, 40, and 80 μmol photons/(m^2 ·s)) with two temperatures (15 and 20°C for E i . bicyclis;20 and 25°C for E c . cava ) to clarify their optimal growth conditions. Growth and maturation of female gametophytes of these two species under a combination of five Fe-EDTA concentrations (0, 1, 2, 4, and 8 μmol/L) and three daylengths (10, 12, and 14 h) were also examined. The growth of E i . bicyclis gametophyte was maximal at approximately 15–20°C, 20 μmol photons/(m^2 ·s), Fe-EDTA concentration of 8 μmol/L and daylengths of 12–14 h. While E c . c ava gametophytes showed optimal growth at approximately 20–25°C, 20 μmol photons/(m^2 ·s), Fe- EDTA concentration of 8 μmol/L and daylength of 14 h. Maturation of gametophytes was enhanced at Fe-EDTA concentration of 4 μmol/L for E i . bicyclis and at 2 μmol/L for E c . c ava . In conclusion, optimal growth temperatures and Fe-EDTA concentrations for maturation of E i . bicyclis and E c . c ava gametophytes were diff erent. Higher optimal growth temperature for E c . c ava gametophytes may contribute to its wider geographical distribution compared to E i . bicyclis which has restricted habitats in Korea. This suggests that addition of Fe ion could be used to recover beds of these two species in barren grounds of Korea.     

间隔取液法延长化学镀镍液寿命的研究

研究了通过间隔取液法延长化学镀镍液使用寿命的技术,通过孔隙率试验测定镀层耐孔蚀性能。结果表明,间隔取液法可以有效地延长镀液的使用寿命,镀液中有害离子Na ,SO42-,HPO3-的临界浓度分别为1.99,0.626和0.486mol/L。当取液量>11%时,镀液中的有害离子均不超过其临界浓度,镀液可以循环使用。     

海洋沉积物孔隙水中痕量金属元素的测试分析方法

孔隙水是沉积物-海水界面链接沉积物颗粒和上覆水体的一个重要过渡相态,针对其研究可更好地了解痕量金属在固-液界面的早期成岩过程。近年来,针对孔隙水中痕量元素研究的方法较为匮乏,为此建立了一种分析测定海洋沉积物孔隙水中7种痕量金属元素(Mn、Cu、Zn、Ni、Cd、Co、Pb)的方法,该方法使用Nobias PA1树脂进行富集分离,再使用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)进行测试,可针对孔隙水中的痕量金属元素进行准确分析。通过实验结果发现该方法最优实验条件为: Nobias PA1树脂富集时的pH值为5.5~6.0,洗脱酸浓度为1.3 mol/L硝酸,体积为1 mL。同时,样品需进行紫外消解4 h以上以分解有机络合物,该消解步骤对Cu和Co这两种元素尤其重要。该方法通过加标回收获得Mn、Cu、Ni、Co和Pb的回收率在92%~100%, Zn和Cd的回收率分别为72%和82%; Mn、Cu、Zn、Ni的方法检出限范围为0.03~0.53 nmol/L, Cd、Co、Pb的方法检出限范围为2.66×10^-3~8.60×10^-3 nmol/L,满足孔隙水中痕量金属浓度的测试需求。同时,根据检出限计算的结果显示,孔隙水样品只需1 mL,即可应用该方法进行测试。应用该方法测试了一根采集于北黄海中部沉积物短柱的孔隙水样品,测试结果显示其垂相分布合理、较符合早期成岩过程规律。此研究为分析海洋沉积物孔隙水中痕量金属元素提供了一种准确而简便的方法。     

氯化钾诱导仿刺参(Apostichopus japonicus)幼虫附着变态的研究

以不同浓度的氯化钾(KCl)溶液处理仿刺参(Apostichopus japonicus)樽形幼虫,处理不同时间后,分析KCl对仿刺参幼虫附着变态的诱导作用。结果表明,使用较低浓度的KCl溶液(10、30和50 mmol/L)分别诱导仿刺参樽形幼虫6、12和24 h均可以显著提高其附着变态率,诱导24 h附着变态率分别提高27.67%、32.67%和19.67%。较高浓度的KCl溶液(100、300和500 mmol/L)也可以诱导仿刺参幼虫附着变态,但随着KCl浓度的升高和诱导时间的延长,幼虫死亡率逐渐升高。低浓度KCl溶液,特别是在30 mmol/L诱导仿刺参幼虫12 h时,可以显著提高幼虫的附着变态率,增加发育的同步性,降低死亡率,对仿刺参幼虫变态的诱导效果较好。     

龙须菜和扁江篱多糖的组成及其抗肿瘤效果

于１９８５－１９８７年期间用冷水和热水对采集于青岛的龙须菜和扁江篱的琼胶型多糖进行提取。两海藻的热水提取多糖都通过ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ５０色谱桩用热水和不同浓度ＮａＣｌ深液前后进行洗脱分级。龙须菜和扁江篱多糖的主要级分分别为０．５ｍｏｌ／Ｌ和１．０ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ洗脱级分。对各级分做化学分析及ＩＲ和＾１３ＣＮＭＲ光谱分析。结果表明，龙须菜多糖由琼二糖、琼胶糖前体和６－ＯＣＨ３－琼二糖组成