富含古罗糖醛酸的褐藻多糖生产菌株的构建

为获得古罗糖醛酸(Guluronate)含量高的细菌胞外褐藻多糖,利用PCR从海洋细菌Pseudomonassp.QDA中克隆了其甘露糖醛酸C-5差向异构酶基因(algG),连接入质粒pMF 54Km,构建了重组表达载体pMF54 Km-algG。利用三亲接合法将pMF54 Km-algG转入菌株QDA中,获得algG过量表达重组菌株QDA-G1。H-NMR测定结果表明,QDA-G所产的褐藻多糖中β-D-甘露糖醛酸(M)与它的C-5差向异构体α-L-古罗糖醛酸(G)的比值为0.38,G的质量分数达到74.2%,比野生菌株QDA提高了26.4%。且重组菌株遗传稳定性良好,连续传代20代后,M/G的比值无明显变化。     

转录组和蛋白组分析海带褐藻多糖硫酸酯对RAW 264.7细胞的免疫调节作用

海带(Saccharinajaponica)是我国的主要经济褐藻,从海带中制备的褐藻多糖硫酸酯具有免疫调节等多种生物活性,但鲜有基于组学的研究报道。本文采用RNA高通量测序(RNA-sequencing,RNA-seq)转录组学技术以及平行反应监测(ParallelReactionMonitoring,PRM)靶向定量蛋白组学方法,探究海带褐藻多糖硫酸酯作用于小鼠巨噬细胞RAW 264.7后对巨噬细胞功能和通路的影响。结果表明,褐藻多糖硫酸酯(100μg/mL)作用于RAW 264.7细胞后,差异表达基因主要富集在免疫反应、先天性免疫应答等生物过程以及TNF、NF-κB、Toll样受体等信号通路,也可促进RAW 264.7细胞膜蛋白A类清道夫受体(SR-A)中SCARA3和Toll样受体中TLR4的表达。采用流式细胞仪对褐藻多糖硫酸酯作用后SR-A和TLR4的表达量进行蛋白水平的验证, SR-A和TLR4的表达量均有升高,证实了组学结果的可靠性。本研究结果为利用褐藻多糖硫酸酯开发具有免疫调节作用的功能食品或药物提供依据。     

一株产褐藻酸多糖的海洋假单胞细菌Pseudomonas sp.QDA的筛选和鉴定

根据已获褐藻酸多糖生物合成基因簇中褐藻胶裂解酶基因(αlgL)的序列设计特异性引物，利用PCR技术从海洋微生物中筛选到1株能够分泌胞外多糖的细菌。采用形态学观察和16S rDNA序列分析鉴定该菌株，结果为假单胞属细菌，命名为Pseudomonas sp.QDA；系统发育树显示该菌株与P.putida亲缘关系最近。菌株产生的胞外多糖可被褐藻胶裂解酶(AlgL)降解，并在紫外234nm处检测到特征性吸收，初步证明含有褐藻酸多糖。     

褐藻多糖硫酸酯对脂多糖诱导大鼠肾小球系膜细胞NO产生量的影响

慢性肾衰的进程中伴随着肾脏炎症的发生,研究表明褐藻多糖硫酸酯具有抗炎作用,且对于慢性肾衰的早期治疗具有一定的作用。本文通过脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导,建立大鼠肾小球系膜细胞的炎症模型,用来源于海带的高分子质量褐藻多糖硫酸酯F1和低分子质量褐藻多糖硫酸酯F2对细胞进行处理,24 h后MTT法检测各组细胞活力,Griess法检测24 h及48 h后细胞培养液中NO的含量。结果表明,各组间细胞活力无明显差异;脂多糖可以诱导大鼠肾小球系膜细胞NO产量增加,F1和F2均可在一定程度上抑制脂多糖诱导的NO产量的增加,从而减轻细胞炎症反应。剂量为25μg/m L的F1和F2处理细胞48 h后,与模型组相比,F1和F2组细胞培养液中NO含量分别下降22.52%和38.65%,低分子质量褐藻多糖硫酸酯抗炎效果明显高于高分子质量褐藻多糖硫酸酯。     

毛细管气相色谱法测定海带提取多糖中的L-褐藻糖含量

建立快速而准确灵敏的方法测定海带(Laminaria japonica)提取多糖——褐藻多糖硫酸酯中的L,褐藻糖含量。海带多糖经酸解后,转化成糖腈乙酸酯衍生物。采用SGEAC225毛细管柱进行分离,实验中以肌醇为内标物。从青岛产海带提取的褐藻多糖硫酸酯中仅含有L,褐藻糖和I)-半乳糖2种单糖,样品10-1,10-2,10-3,1阻4中的L褐藻糖的平均含量分别为32．9072％,32．3147％,31．2924％,32．3571％,回收率为97．1％～99．9％,变异系数为0．23％～0．60％。采用气相色谱法测定海带多糖中的L褐藻糖含量准确、可靠。     

几种褐藻多糖硫酸酯的提取、成分分析及抗氧化活性研究

褐藻多糖硫酸酯是一种含有硫酸基的水溶性杂聚糖,其化学组成对抗氧化活性有较大的影响。本文对三种褐藻来源的褐藻多糖硫酸酯及其降解产物化学组成和抗氧化活性进行了研究,阐明了不同来源褐藻多糖硫酸酯体外抗氧化活性的构效关系。实验结果表明:1)分子量对抗氧化活性有较大影响,但是对不同褐藻来源的褐藻多糖硫酸酯的影响趋势并不一致。2)岩藻糖、硫酸基和糖醛酸含量对清除超氧阴离子自由基的影响与分子量有一定的关系。对于低分子量样品,岩藻糖和硫酸基含量与抗氧化活性成正相关。3)岩藻糖和硫酸根的比值对羟基自由基的清除能力有一定影响,比值越大,羟基自由基的清除能力越强。分子量、岩藻糖、硫酸基和糖醛酸的含量对褐藻多糖硫酸酯的抗氧化活性的影响依次减小。本研究为褐藻多糖硫酸酯在抗氧化剂保健品和功能食品中的应用提供了基础数据,也为裙带菜、羊栖菜和铜藻的高值化利用提供了理论依据。     

几种褐藻中褐藻多糖硫酸酯的分离及分析

分别从３种马尾藻及３份不同产地的海带中提取出褐藻多糖酸酯，并比较了它们的得率和化学组分。得率最高的在大连产海带，为５．５％。马尾藻褐藻多糖硫酸酯组成都很复杂，硫酸根含量都比较低。     

混合菌群发酵马尾藻作为海藻肥料的研究

从马尾藻原位分离发酵菌群,采用分子生物学手段分析鉴定菌种组成,获得发酵菌株4株分别为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium),非脱羧勒克氏菌(Leclerciaadecarboxylata),鞘氨醇单胞菌(Sphingomonasleidyi)以及赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusmacroides);控制4菌株接种比例进行马尾藻发酵,监测发酵过程中菌种生物量、褐藻酸含量及褐藻寡糖含量变化规律,结果表明,马尾藻经发酵36 h生成聚合度2-5的褐藻寡糖,并伴随菌种二次生长及pH下降等易于观察检测的参数变化;含褐藻寡糖的发酵原液稀释600倍后,能够明显促进小麦种子萌发及根生长,与清水对照相比萌发率提高26%,根系长度增长37%。本研究为微生物发酵法生产海藻肥料提供了可行案例,证实该方法简单有效,可操作性强,有广阔的应用前景,为将来实现海藻发酵肥工业化生产提供理论支持和数据支撑。     

褐藻多糖硫酸酯的结构与生物活性研究

褐藻多糖硫酸酯（fucoidan,FPS）是所有褐藻中所固有的细胞间多糖,存在于细胞壁基质中。生长于潮间带、长时间与空气接触的褐藻种类中,如多年生的墨角藻（Fucus vesiculosus）类,其褐藻多糖硫酸酯的含量可高达20%;生长在较深处的海带（Saccharina japonica）类中含量较低,约为1%~2%。褐藻多糖硫酸酯是一类独特的结合有硫酸基的水溶性杂聚糖,其化学组成和结构非常复杂,以岩藻糖和硫酸基为主,随着褐藻的种类不同还含有半乳糖、木糖、糖醛酸等其他成分。褐藻多糖硫酸酯具有多种生物活性,目前针对墨角藻、泡叶藻（Ascophyllum nodosum）、鼠尾藻（Sargassum thunbergii）等褐藻中的褐藻多糖硫酸酯研究较多,发现其具有免疫调节、抗病毒、抗肿瘤、抗凝血、抗氧化等生物活性。本文主要就褐藻多糖硫酸酯的提取、纯化、结构及生物活性等方面研究进行综述。     

产免疫调节活性多糖海洋放线菌的筛选

用硫酸苯酚法和实验动物模型检测分离于厦门海区潮间带的996株海洋放线菌胞外多糖产量和体内外免疫增强活性.结果表明,33%的海洋放线菌粗多糖产量大于3g/dm3;在粗多糖产量高的海洋放线菌中有3株菌株的胞外多糖在体内外均具有较好的免疫增强活性,其中链霉菌(Streptomyces sp.)2305菌株的胞外多糖具有较高的非特异性、细胞及体液免疫增强活性.研究结果表明海洋放线菌胞外多糖是免疫调节剂开发的重要资源.     

深海细菌Pseudomonas sp.bIp-2黑色素生成条件研究及其hppD基因的克隆

从大西洋深海沉积物中分离得到1株产黑色素细菌b Ip-2,16S rRNA基因序列分析表明该菌隶属于假单胞菌属（Pseudomonas）,与施氏假单胞菌（P.stutzeri）有最高的16S rRNA基因序列相似性（99%）.进一步对该菌的生长及产黑色素条件进行了初步研究,结果表明b Ip-2在稳定生长期后期才开始大量积累黑色素;b Ip-2可在4～37℃的温度范围下生长,最适生长温度为37℃,在28℃具有最高的黑色素产量;b Ip-2生长的pH范围偏碱性,在p H=7的最适生长条件下黑色素产量最高,同时碱性环境有利于黑色素的快速形成;b Ip-2可以在1%～9%的NaCl浓度范围中生长,在5%的NaCl浓度下具有最高的黑色素产量;低浓度的Fe^2＋（0.05 mmol/dm^3）可以提高黑色素的产量,Fe^2＋浓度≥0.20 mmol/dm^3时明显抑制黑色素的生成,而Fe^2＋浓度为1.00 mmol/dm^3时可完全抑制菌株的生长;低浓度的Cu^2＋（0.1 mmol/dm^3）对黑色素的产量无明显影响,Cu^2＋浓度≥0.5mmol/dm^3时可抑制黑色素的生成,而Cu^2＋浓度超过1.0 mmol/dm^3时可完全抑制菌株的生长.通过PCR扩增获得菌株b Ip-2的对羟苯基丙酮酸双加氧酶（hydroxyphenylpyruvic acid dioxygenase,HPPD）全长基因（1087 bp）,分析发现其编码的HPPD蛋白序列（含361氨基酸）与来自菌株Pseudomonas stutzeri RCH2的HPPD蛋白序列具有最高的同源性（序列相似性为97%）.这些结果为深入研究该细菌所产黑色素的合成,应用及生态作用奠定了基础.     

一株假单胞菌的亚硝酸盐降解特性及其对鱼池底泥的净化作用

从海水养殖池的底泥中筛选到一株对亚硝酸盐有强降解作用的假单胞菌（Pseudomonas sp．）SF1,在实验室条件下研究了SF1的亚硝酸盐降解特性及其对高污染鱼池底泥的净化作用。研究结果表明,SF1具有高效降解转化高浓度亚硝酸钠的能力,其适宜降解条件为：亚硝酸钠质量浓度范围为1～1000mg／L;菌种接种量为10％;...     

南极产碱性淀粉酶菌株NJ270的选育及酶学性质

从南极中山站排污口沉积物样品中筛选到一株产碱性淀粉酶的耐冷菌株NJ270,结合形态学观察和16S rDNA序列分析表明该菌属于假单胞菌属(Pseudomonas).发酵试验发现添加淀粉能使产酶量提高8.42倍.采用硫酸铵沉淀、Q Sepharose XL离子交换层析和Sephadex G-75凝胶层析对假单胞菌NJ270淀粉酶进行了纯化,获得电泳纯的淀粉酶,SDS-PAGE检测结果表明该酶大小约为55 kDa.酶学性质研究表明其最适pH值为9.0,最适作用温度为50℃.在低于40℃的条件下具有较高的热稳定性,属于碱性中温淀粉酶.该酶可水解可溶性淀粉生成麦芽五糖.酶活力受多种金属离子和螯合剂的影响,其中Mg2+可使酶活力提高10%,而Fe3+、Co2+、Cu2+、Zn2+、Hg2+、EDTA则能抑制酶活性,抑制率均为60%左右.该酶的性质特征表明其在洗涤剂制造等工业生产中有一定的应用潜力.     

海藻酸裂解酶基因在毕赤酵母中的表达及重组酶性质的初步研究

褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum)是一种海藻酸降解菌.本实验采用PCR的方法,以褐球固氮菌基因组DNA为模板,克隆出约1.05 kb的海藻酸裂解酶基因algL的成熟蛋白编码序列,并将其插入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPIC9K中,获得重组质粒pPIC9K-algL.重组质粒线性化后用聚乙二醇(PEG)法导入毕赤酵母菌株GS115中,获得高效分泌表达海藻酸裂解酶的毕赤酵母工程菌株.用甲醇诱导培养基进行摇瓶发酵,表达得到43 kDa的目的蛋白,酶活力可达1 400 U/cm3左右.经测定,该重组酶的最适反应pH为8.5,最适反应温度为40℃,并且在20~55℃,pH2.0~11.0具有较好的稳定性.另外,10 mmol/cm3的Cu2+,Fe2+,Co2+,Mn2+和Ca2+对酶有不同程度的抑制作用.     

Biological characteristics of marine bacterium S-9801 strain and its culture conditions of pigment production

ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＩＯＮＲｅｃｅｎｔｌｙ ,ｍｏｒｅａｎｄｍｏｒｅａｔｔｅｎｔｉｏｎｈａｓｂｅｅｎｇｉｖｅｎｔｏｔｈｅｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎａｎｄｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｍａｒｉｎｅｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｂｙｔｈｅｓｔａｔｅ .Ｉｔｈａｓｂｅｅｎｗｉｄｅｌｙｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄｔｈａｔｍａｒｉｎｅｏｒｇａｎｉｓｍｓｄｕｅｔｏｔｈｅｉｒｕｎｉｑｕｅｓｕｒｖｉｖａｌｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｃａｎｐｒｏｄｕｃｅｎｏｖｅｌｂｉｏａｃｔｉｖｅｐｒｏｄｕｃｔｓ,ｗｈｉｃｈｈａｖｅｎ’ｔｂｅｅｎｆｏｕｎｄｉｎｔ…     

Influence of Bacterial Exopolymers, Conspecific Adult Extract and Salinity on the Cyprid Metamorphosis of Balanus amphitrite Cirripedia: Thoracica

Abstract. The influence of bacterial exopolymers and conspecific adult extract of Balanus amphitrite on metamorphosis of cyprid larvae at different salinities has been evaluated through laboratory assay. The bacterial exopolymers epm extracted from Pseudomonas, Acinetobacter and Enterobacteriaceae strains, isolated from the shell surface of Balanus amphitrite , were examined for their influence on metamorphosis, both individually and in combination with conspecific adult extract at 15, 25, 35 and 45% salinities. The epm extracted from the pool of these three strains mixed culture was also tested similarly.
The influence of epm varied with the strain of bacteria and salinity. The surface condition and time interval significantly influenced the metamorphosis rate. The interaction between these two variables, however, did not change in any combination, irrespective of the bacterial strain used. The Pseudomonas epm promoted metamorphosis at 15%, but was inhibitory at 45%. The Acinetobacter epm induced metamorphosis to a level of 71 ± 15% at 15%. No such metamorphosis promotion was observed with the epm of this strain at higher salinities and the influence was less than the conspecific adult extract. The epm of Enterobacteriaceae and mixed culture epm did not promote metamorphosis. There was no appreciable change in the metamorphic rate in the control conditions at 25%, 35% and 45% salinities and the rate was much lower than that obtained with conspecific adult extract. At 15%, however, the influence of adult extract was closer to that of the control condition. This shows that even in the absence of any attractant, the settlement intensity is positively influenced at mid-salinity of the barnacles' natural distributional range.     

海洋链霉菌分离株M095遗传转化体系的建立

研究了海洋链霉菌分离株M095的基因转移系统。利用属间接合转移将具有oriT的大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pIJ8600转入EscherichiacoliET12567(pUZ8002)中,获得供体菌。将供体菌与预萌发的菌株M095的孢子进行接合转移,将质粒pIJ8600转入菌株M095中,其转化率为1.99×10-4个接合转化子/受体。Southern杂交证明质粒pIJ8600已经整合到菌株M095的染色体上。同时,将来自Spirulinamaxima(Cyanophyta)的别藻蓝蛋白基因(apc)克隆在质粒pIJ8600的XbaI和BglII位点,产生质粒pAPIJ。用接合转移法将质粒pAPIJ转入菌株M095。通过SDS-PAGE分析,得到2个大小为22ku和17ku的蛋白,分别相对应于别藻蓝蛋白的α和β亚基。这些结果进一步证明菌株M095的遗传转化体系已经成功建立起来,这将为其他海洋放线菌遗传转化工作的研究奠定基础。     

极地产适冷脂肪酶菌株的酶学性质研究

从南北极环境样品中分离到7株产脂肪酶的细菌,经16SrDNA序列分析表明,这些细菌分别属于假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas）和嗜冷杆菌属（Psychrobacter）．采用p-NPP法对这7株细菌所产的脂肪酶进行酶学性质研究,结果显示这些酶的最适作用温度在30～40cC、最适作用pH值在7—8之间,在低温下能保持较高的剩余活力,对热敏感,属于适冷脂肪酶．其中假交替单胞菌（Psychrobacter sp．7342）所产脂肪酶具有低温下酶的剩余活力高、有效作用温度和pH范围广、热稳定性较好及对多种金属离子抗性强等特点．该菌株能利用多种单一氮源和碳源产酶,最适产酶温度为25℃．在此基础上进行正交实验分析得到了该菌株的最佳发酵条件为：蛋白胨和淀粉含量各为1．33％,酵母膏含量为0．3％,温度为25℃．     

饵料、温度和盐度对两种海洋桡足类摄食与排粪的影响

中华哲水蚤是中国近海典型的浮游桡足类,猛水蚤是青岛胶州湾和汇泉湾常见底栖桡足类,研究2种海洋桡足类的摄食和排粪规律可为大量培养桡足类提供最佳条件。论文研究了在6种不同饵料(球等鞭金藻、亚心形扁藻、小球藻、绿色巴夫藻、三角褐指藻、小新月菱形藻)的条件下,温度和盐度对中华哲水蚤和猛水蚤摄食和排粪的影响。温度和盐度对2种桡足类摄食和排粪的影响具有种间差异性。中华哲水蚤在15℃的摄食率、滤水率和排粪率高于在20和25℃的摄食率、滤水率和排粪率。在15、20和25℃3个温度范围内,猛水蚤的摄食率、滤水率和排粪率随温度升高而升高。在20～36盐度范围内,中华哲水蚤的摄食率、滤水率和排粪率随盐度的升高先升高后降低,在盐度为28时达到最大值,猛水蚤的摄食率、滤水率和排粪率随盐度升高而逐渐降低,猛水蚤摄食和排粪的最适盐度为20。温度和盐度实验均表明,在6种饵料中,亚心形扁藻和球等鞭金藻有利于中华哲水蚤的摄食,球等鞭金藻有利于猛水蚤的摄食,而小球藻对2种桡足类的摄食均不利。