基于电子鼻和HS-SPME-GC-MS方法研究 海水中七氯的快速检测技术

为了建立海水中有机氯农药的快速检测技术, 本文基于电子鼻和顶空固相微萃取气质联用法(HS-SPME-GC-MS)对海水中的七氯进行检测。结果表明, 电子鼻可以识别海水中的挥发性七氯成分及浓度, 最低检测限0.01mg/L。利用线性判别分析方法(LDA)的累计判别贡献率和欧氏距离、判别函数法、相关性对未知样品的识别率均达到了80%以上, 具有良好的区分效果; PLS模型预测七氯浓度跟实际值之间的相对误差在0.49%—16%之间。HS-SPME-GC-MS检测浓度小于0.10mg/L时, 相对误差在10%左右; 而大于此浓度时, 相对误差随之增大。检测到的主要挥发性物质基本呈现规律性的变化, 与电子鼻确认结果一致。对比两种检测技术, 发现电子鼻检测方法比HS-SPME-GC-MS更迅速、灵敏, 检测限更低, 相对误差也更小, 仪器便携、投资相对较小。     

利用化学传感器检测海水中的多氯联苯

为建立一种简单快捷的多氯联苯检测方法, 本研究应用化学传感器对宁波沿海重点陆源排污口及周边海水中的多氯联苯进行了检测, 采用HS-SPME-GC-MS(顶空固相微萃取-气质联用)对结果进行了验证。利用化学传感器测定海水中的多氯联苯, 在LDA(线性判别分析)中, 总判别率为99.81%。海水体积增大到5mL时, LDA 最低检测限达到了0.01ng/L。建立的模型中, 欧氏距离、相关性、判别函数法和马氏距离对样品浓度鉴别的正确率分别达到了100%、100%、92%、84%。采用Loading分析法简化了传感器阵列, 使BP神经网络总的MSE达到了5.6548e?006, 总的相关系数0.99998, 而最大误差只有1.0300e?002的水平。HS-SPME-GC-MS对海水中多氯联苯浓度的检测限最 低为0.001?g/L, 远高于化学传感器的0.01ng/L, 回收率在100%—120%之间。     

Cd~(2+)对青蛤(Cyclina sinensis)的毒性及蓄积过程研究

利用水生动物急性毒性实验方法,在6个浓度下Cd2+对青蛤的急性毒性进行测定,经回归分析后,得到Cd2+对青蛤96h半致死浓度为20.09mg/L,安全浓度为0.201mg/L。分别对半致死浓度和安全浓度下Cd2+在青蛤体内不同组织的蓄积情况进行了分析。结果表明,在半致死浓度条件下,168h青蛤各组织Cd2+的含量依次为肌肉内脏团鳃;而在安全浓度下,其结果为内脏团鳃肌肉,内脏团对于Cd2+富集能力远高于肌肉。讨论了青蛤的养殖环境及产品检验等问题。     

青蛤(Cyclina sinensis)TLR2基因的克隆与表达分析

利用转录组文库分析得到青蛤(Cyclina sinensis)的Toll样受体2(Toll-like receptor 2,TLR2)基因序列,采用荧光定量PCR法分析该基因的表达过程。结果显示,青蛤TLR2基因的cDNA开放阅读框为2082bp,编码693个氨基酸,具典型的LRRs、单次跨膜区和TIR结构域。该基因在血淋巴中的表达量最高,与肝脏、鳃、外套膜、闭壳肌和性腺有显著性差异(P0.05)。在鳗弧菌和Poly I:C刺激下,青蛤血淋巴中TLR2基因3h开始升高,48h达到最大值,与对照组和空白组有极显著性差异(P0.01);藤黄微球菌刺激下,血淋巴中CsTLR2基因3h开始升高,48h亦达到最大值,实验组与对照组有显著性差异(P0.05)。     

青蛤(Cyclina sinensis)溶菌酶基因在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激下的表达

利用构建的SMART cDNA文库和高通量测序方法,得到了青蛤溶菌酶相关基因的全长,采用荧光定量RT-PCR方法分析了c型溶菌酶基因在鳗弧菌刺激下的表达变化。结果表明,青蛤有c型溶菌酶和i型溶菌酶基因,分别编码155和182个氨基酸,c型溶菌酶信号肽为21个氨基酸并具有典型的LYZ1结构域,i型溶菌酶信号肽为19个氨基酸,其结构域为Destabilase domain结构,用于识别和切断谷氨酰胺-甲酰胺与赖氨酸ε-氨基之间的肽键。荧光定量PCR结果显示,在鳗弧菌刺激后6—24h,青蛤血细胞中c型溶菌酶的表达量出现明显上调的趋势,与对照组有显著性差异(P0.05),说明c型溶菌酶基因在青蛤的免疫应答中起重要的作用。     

南澳青蛤(Cyclina sinensis)野生群体数量性状间的相关及通径分析

于2009年9月,从南澳岛野生青蛤群体中随机选取162枚1-2龄的个体,测量形态性状(壳长、壳高、壳宽)和活体重,采用相关分析、回归分析、通径分析等方法研究了四个数量性状之间的相关性在影响活重量方面的作用。结果表明,四个数量性状间的相关性均达到显著水平(P0.05),相关系数从0.732到0.880;对活体重影响最大的因素是壳长,其值达16.26%。壳高与壳长间的协同作用对活体重的间接影响最大,其值为25.87%,壳宽的作用最小。以活体重(Y)为因变量,壳长(x1)、壳高(x2)、壳宽(x3)为自变量建立的回归方程为:Y=60.3203+0.9134x1+0.8113x2+0.6410x3(R2=0.8641)。本研究结果表明,以提高重量为选育目标,应首先对壳长进行选择,同时加强对壳高的协同选择,为青蛤的选择育种提供理论依据。     

青蛤(Cyclina sinensis)组织蛋白酶L基因的表达与重组蛋白活性分析

利用荧光定量PCR方法检测了青蛤(Cyclina sinensis)在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)胁迫下组织蛋白酶L基因(CsCPL)在各组织的表达差别及其在血淋巴中的时序表达关系。结果表明,CsCPL基因在青蛤血淋巴、肝脏、外套膜、鳃和闭壳肌等组织中普遍表达,其中以血淋巴表达水平最高。在鳗弧菌刺激后3—96h青蛤的血淋巴中CsCPL的表达量均出现明显上调,其中6h达到最大值并且与对照组有极其显著性差异(P0.01),说明该基因在青蛤免疫反应中具有重要作用。文章还对CsCPL基因进行了原核表达,其产物蛋白分子量约35kDa,经纯化及复性后具有明显的抑菌作用。     

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)侵染对青蛤(Cyclina sinensis)磷酸酶活性的影响

对500个成体青蛤分别用鳗弧菌和生理盐水注射,在感染后3h、6h、12h、24h和36h分别取不同处理组的肝胰脏、鳃和闭壳肌组织,测定上述样品的碱性磷酸酶(ALP)及酸性磷酸酶(ACP)活性,分析鳗弧菌对青蛤体内免疫相关酶活性的影响。结果表明,鳗弧菌感染组的ALP与ACP活性从高到低依次为肝胰脏鳃闭壳肌,其中青蛤肝胰脏和鳃组织中ALP和ACP活性均有显著升高的趋势,并且在12h时达到最高,与对照组差异显著(P0.05),随后呈现下降趋势。而青蛤闭壳肌组织中侵染组ALP和ACP活性与对照组之间没有显著差异(P0.05)。鳗弧菌对青蛤的磷酸酶活性影响较大,对其免疫防御系统有明显的刺激作用。     

刻蚀不锈钢丝固相微萃取-气相色谱法检测海水中多氯联苯

用氢氟酸刻蚀不锈钢丝制作了固相微萃取(solid-phase microextraction, SPME)纤维,与气相色谱(gas chromatography, GC)联用直接测定了海水水样中的痕量多氯联苯(polychlorinated biphenyls, PCBs),优化了萃取时间、萃取温度、搅拌速率、解吸温度和解吸时间对SPME的萃取效率的影响。本方法的线性范围可达两个数量级,PCB28和PCB52的线性范围是1.0～100.0 ng/L,其他8种PCBs的线性范围是0.5～50.0 ng/L(除PCB198外,r²均在0.99以上),检出限为0.01～0.10 ng/L。单个纤维间及纤维与纤维间的相对标准偏差分别为2.4%～7.2%和4.9%～8.7%。实际海水样品的加标回收率为80.9%～106.0%。微萃取纤维机械强度高、耐海水腐蚀、寿命长、制作成本低,该方法适用于测定海水水样中的痕量PCBs。     

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)侵染对青蛤(Cyclina sinensis)髓样分化因子88基因表达的影响

经转录组测序后筛选并克隆得到青蛤(Cyclina sinensis)髓样分化因子88(myeloid differenttiation factor 88,My D88)的c DNA序列。在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)胁迫下,采用荧光定量PCR法分析了My D88基因在青蛤体内的表达过程。结果显示,青蛤My D88基因的开放阅读框为1521bp,编码506个氨基酸,分子量约为57.14k Da,氨基酸N段存在DEATH结构域,C段存在TIR结构域(Toll/Interleukin-1 receptor domain)。My D88基因在青蛤血淋巴、肝脏、外套膜、鳃和闭壳肌等组织中普遍表达,但在血淋巴中表达量最高,与其它组织出现显著性差异(P0.05)。通过检测鳗弧菌刺激下My D88基因在青蛤血淋巴中的表达值,发现My D88基因在24h开始升高,48h达到最大值,约为对照组的10倍,实验组与对照组及空白组均出现了极显著性差异(P0.01);研究结果表明,该基因在软体动物的免疫应答反应中对革兰氏阴性菌有识别作用。     

青蛤(Cyclina sinensis)生长性状相关分子标记的 AFLP 分析

采用AFLP技术和单因素方差分析方法,进行了青蛤主要生长性状相关分子标记筛选研究。结果表明,检测的18个与壳长相关的基因位点,其贡献率在6.46%—18.32%之间,其中E32M51-8、E33M51-38对壳长的贡献率较高,分别为18.32%和15.68%。检测的23个与壳宽相关的基因位点,其贡献率在6.75%—20.93%之间,其中E32M51-8、E33M48-19对壳宽的贡献率较高,分别为20.93%和17.34%。检测的22个与壳高相关的基因位点,其贡献率在6.54%—15.91%之间,其中E32M51-17对壳高的贡献率最高,为15.91%。检测的8个与活体重相关的基因位点,其贡献率在6.65%—17.83%之间,其中E33M48-10对活体重的贡献率最高,为17.83%。以上结果说明青蛤生长性状的遗传基础复杂,通过筛选与其相关显著的分子标记,在育种中开展分子标记选择是可行的。     

青蛤(Cyclina sinensis)金属硫蛋白及硫氧还蛋白基因的克隆与表达分析

利用构建的cDNA文库及高通量测序方法,获得金属硫蛋白及硫氧还蛋白基因全长。结果表明,青蛤金属硫蛋白和硫氧还蛋白的cDNA全长分别为776bp和804bp,金属硫蛋白基因编码74个氨基酸,包含7个CXC特征结构;硫氧还蛋白基因编码165氨基酸,包含5个氨基酸构成的活性中心。采用实时定量PCR方法分析了两种基因在Cd2+胁迫下的表达变化,结果显示,金属硫蛋白基因在Cd2+胁迫下6—12hmRNA表达量急剧上升,与对照组有显著性差异(P<0.01)。硫氧还蛋白基因在Cd2+胁迫下mRNA在6h明显升高,在6—24h与对照组出现显著性差异(P<0.05)。说明Cd2+能够诱导青蛤金属硫蛋白和硫氧还蛋白基因表达的时序性升高,二者的转录过程反映了贝类抵御重金属胁迫的分子调控过程。     

青蛤(Cyclina sinensis)cDNA文库构建及免疫相关因子基因的筛选

在鳗弧菌侵染下,利用SMART方法构建了青蛤的cDNA文库,并采用高通量测序方法和BLASTX比对筛选出ESTs及免疫相关因子的基因.结果表明,所构建的cDNA文库的库容量为1.12×106,插入片段均在500bp以上;大于100bp的有效ESTs序列1113条,平均长度725bp,拼接后获得一致性序列420条,其中包括126个叠联群和294个单拷贝EST,BLASTX比对后获得注释序列271条,进一步筛选获得青蛤免疫相关因子基因序列45条,为克隆其免疫防御相关因子的基因提供了重要的基础.     

青蛤(Cyclina sinensis)贝壳形态性状对软体部重的影响分析

随机抽取中国及日本海域的1龄青蛤(Cyclina shiensis)245个,分别测量其壳高、壳长、壳宽、韧带长、壳重及软体部重等形态学和生产性状,采用相关分析、通径分析、决定系数分析和多元回归分析方法,讨论了贝壳各形态性状对软体部重的影响.结果表明,青蛤的壳高对软体部重相关系数r1y和直接影响通径系数Pi分别达到了0.953和0.938,统计检验均达到了极显著水平(P<0.01).此外,壳高对软体部重的决定系数R12为0.9080,多元回归分析亦显示出青蛤的壳高与软体部重具有显著的相关性(P<0.01).实验结论认为,壳高对青蛤的生产性状影响最大,可以作为青蛤种质选育的重要甄别性状.     

青蛤(Cyclina sinensis) TRAF6基因克隆及其在Poly I:C胁迫下的免疫应答

对青蛤(Cyclina sinensis)转录组文库筛选并克隆得到青蛤TRAF6(Cs TRAF6)基因的c DNA序列,其开放阅读框为2337bp,编码778个氨基酸,分子量为86.59k Da。Cs TRAF6蛋白包含RING型锌指结构,两个TRAF型锌指结构,coiled-coil结构域以及MATH结构域。经生物信息学及分子系统学分析表明Cs TRAF6属于TRAF6家族的一员。利用实时荧光定量PCR方法检测了Cs TRAF6基因在青蛤各个组织以及在Poly I:C侵染下在血淋巴中的时序性表达情况。结果表明,Cs TRAF6基因在青蛤血淋巴、闭壳肌、鳃、性腺、外套膜和肝脏中普遍表达,其中在血淋巴中的表达水平最高。在Poly I:C刺激后的3h,青蛤血淋巴中Cs TRAF6的表达量迅速升高,在6h达到最大值,说明青蛤的Cs TRAF6基因参与了病毒类似物侵染下的免疫应答反应。