南极衣藻（Chlamydomonas sp.ICE-L）谷胱甘肽还原酶基因的原核表达及其条件优化

采用RT-PCR技术克隆南极衣藻GR基因ORF全长cDNA,然后经酶切、连接等步骤构建其原核表达载体;并对其表达的诱导时间、IPTG浓度、温度进行了优化,以期获得较大量的酶蛋白。结果表明,将构建的原核表达载体pET-GR导入大肠杆菌BL21,可以高效表达融合蛋白;且表达的蛋白均以包涵体的形式存在;经SDS-PAGE电泳...     

温度对南极衣藻ICE-L(Chlamydomonas sp. ICE-L)谷胱甘肽含量及其相关酶活性的影响

采用分光光度法研究了在不同温度下(包括最适温度、低于或高于最适温度)南极衣藻ICE-L(Chlamydomonassp.ICE-L)谷胱甘肽(GSH)含量、蛋白含量、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽还原酶(GR)和谷胱甘肽硫转移酶(GST)活性,同时分析了已适应高温(16℃)的衣藻重新适应低温(8℃)时这些指标的变化,以期阐明谷胱甘肽系统与南极冰藻低温适应性的关系。结果表明,当温度低于对照组(最适温度8℃)时,蛋白含量降低,而GSH含量、GPx、GST和GR活性上升,已适应高温的衣藻重新适应低温时也出现类似的结果。但当温度高于最适温度时,GSH含量、GST和GPx活性下降,而蛋白含量和GR活力有上升的趋势,GR活力增长幅度比低于最适温度时的变化小。由此可见谷胱甘肽系统在南极衣藻低温适应过程中,GSH、GPx、GR、GST与低温适应呈正相关,同时除GR外其他因子与南极衣藻高温适应呈负相关,GSH及其相关酶在南极冰藻低温适应中具有重要作用。     

不同氮源下南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L的生物量、氮吸收与脂肪酸组成研究

微藻培养过程中氮缺失有利于油脂和生物量的积累,然而不同氮源条件下微藻生长与生物量的研究有限,限制了生物油脂的相关研究。本文研究通过研究南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L在不同氮源条件下的细胞生长与油脂积累,进一步探究其作为富集油脂微藻的潜力。研究发现：在含有NH₄CL的培养基中,Chlamydomonas sp.ICE-L生长速率最大;在含有NH₄NO₃的条件下,获得了最大干重量0.28 g/L。最高油脂含量0.21 g/g是在缺氮条件下获得,同时得到干重0.24 g/L。在多不饱和脂肪酸的产出方面,NH₄NO₃和NH₄Cl为氮源培养基时要好于缺氮和KNO₃培养基,在NH₄NO₃和NH₄Cl为氮源的培养条件下ICE-L胞内C18：3和C20：5的含量高。比较而言,缺氮和KNO₃培养基时C16：0、C18：1和C18：2的含量要高。     

南极冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L过氧化氢酶的热胁迫响应

为了研究南极冰藻的热胁迫应答机制,本文根据转录组测序得到的冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L过氧化氢酶CiCAT基因分析了其编码蛋白的特征,同时研究了CiCAT基因表达和过氧化氢酶活性在培养温度升高时的响应变化情况。结果表明:CiCAT基因序列全长为2 066 bp,编码492个氨基酸。在过氧化氢酶的系统进化树中,南极冰藻与其他绿藻聚类为一个分支。CiCAT编码的蛋白序列与盐藻和红球藻的过氧化氢酶序列相似性较高,分别为80.5%和78.9%。当南极冰藻处于热胁迫条件下,CiCAT基因的相对表达量和过氧化氢酶活均呈现出先上升后下降的趋势,但在胁迫24 h时CiCAT基因的表达量变化不明显,而实验组的酶活显著高于对照组。在胁迫72 h时,基因表达量和酶活均达到最高值。研究初步表明,与在常温藻类和高等植物中的功能相似,在经受热胁迫的情况下,南极冰藻中的抗氧化酶系统也发挥着重要作用。     

南极冰鱼和伯氏肩孔南极鱼EPO基因预测及生物信息学分析

运用PCR、TA克隆及二代测序技术获得了独角雪冰鱼(Chionodraco hamatus)、伯氏肩孔南极鱼(Trematomus bernacchii)的EPO区域基因组DNA序列,并结合生物信息学方法进行了基因结构与保守功能域等生物学特性研究。结果表明:克隆获得的独角雪冰鱼、伯氏肩孔南极鱼EPO基因序列分别为2727 bp和2820 bp,包括5个外显子和4个内含子结构,编码区全长皆为558 bp,推定编码185个氨基酸。理化性质分析得到两者的EPO蛋白皆为相对稳定的酸性可溶性蛋白。其三级结构预测结果都显示出典型的4个反相平行的α螺旋结构特征,保持了其在生物体内发挥的原有作用。多重序列比对显示,独角雪冰鱼EPO与伯氏肩孔南极鱼的氨基酸同源性为95.2%,而与其它物种的同源性在53.9%—85.5%之间。系统发育树显示,独角雪冰鱼、伯氏肩孔南极鱼的EPO基因与鱼类的同源基因聚类,系统进化情况同亲缘关系一致,表明EPO基因在进化过程中具有较强保守性。本研究为揭示EPO基因在南极冰鱼内的遗传特性提供理论依据,并为进一步探讨EPO基因在极端低温高氧环境中的鱼类适应性进化研究奠定了基础。     

响应面法优化南极菌Psychrobacter sp.B-3的发酵产糖条件

为对南极菌Psychrobacter sp.B-3产胞外糖的发酵条件进行优化,以温度、pH、不同碳源、不同氮源、不同金属离子及海水配比作为唯一变量进行单因素实验,筛选出对产糖有显著影响的单因素取值范围;在此基础上,利用Plackett-Burman实验设计筛选出影响产多糖的3个主要因素,即酵母粉、陈海水配比和装液量.然后通过Box-Behnken实验设计及响应面分析法进行回归分析,得出了南极菌Psychrobacter sp.B-3发酵条件系统优化的结果为:酵母粉1.1 g/L,陈海水与自来水的配比为2:1,装液量为50％,蛋白胨6.0 g/L,接种量1.5％,培养时间64 h,BaCl20.03 g/L,温度10℃,转速150 r/min,pH为7.0.优化后发酵液中的糖含量由优化前的444 μg/mL提高到624 μg/mL,相比初始糖产量提高了40％.结果表明,响应面法可显著优化南极菌Psychrobacter sp.B-3液体发酵产胞外糖的条件.     

南极菌Psychrobacter sp.B-3胞外多糖化学特征及其对番茄抗氧化酶的诱导作用研究

以B-3多糖诱导番茄叶,采用试剂盒测定其对番茄叶抗氧化酶活性的影响,并对南极茵B-3胞外糖的分子量、单糖组成等化学特征进行了初步分析.结果表明,不同质量浓度的B-3在诱导不同时间后,均能提高番茄各抗氧化酶的活性.0.5％的B-3多糖诱导24 h过氧化氢酶(CAT)活性最高;0.5％的B-3多糖作用48h对超氧化物歧化酶...     

雨生红球藻β-胡萝卜素酮化酶基因在莱茵衣藻叶绿体中的表达

雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)的β-胡萝卜素酮化酶是虾青素生物合成途径中关键酶之一,本研究通过基因枪法将克隆出的β-胡萝卜素酮化酶基因(bkt),转入莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的叶绿体中,经过含100mg/L壮观霉素固体培养基筛选得到转化子。通过PCR和基因组酶切Southern杂交分析,证明bkt基因通过同源重组定点整合到转化子的叶绿体基因组中。进一步通过RT-PCR和RT-PCR Southern杂交分析,表明bkt在衣藻转化子中得到表达。     

南极适冷菌Pseudoaltermonas sp.S-15-13胞外多糖低温保护作用的研究

研究了南极适冷菌Pseudoaltermonas sp.S-15-13胞外多糖(Exopolysaccharides,EPSs)对重复冻融的菌体的保护作用。结果表明,重复冻融循环后,有胞外多糖包被的菌体仍能保持较好的生长能力,无胞外多糖包被的菌体生长缓慢,甚至死亡;不同浓度的胞外多糖均可降低水溶液的冰点,其效果较浓度相同的葡聚糖明显。说明南极适冷菌S-15-13对反复冻融的耐受能力与菌体分泌的胞外多糖直接相关,除了形成机械隔离屏障,胞外多糖还可能通过降低冰点等途径使菌体免受伤害。     

南极冰藻 Chlamydomonas sp.ICE-L的 cDNA文库构建及品质检测

为构建南极冰藻Chlamydomonassp.ICE-L的cDNA文库,提取对数生长期南极冰藻ICE-L的总RNA,以此为模板,通过PowerScript逆转录酶逆转录合成第一链cDNA;再以第一链cDNA产物为模板,用LD-PCR合成第二链cDNA。该cDNA产物经分级分离转入大肠杆菌中,即获得南极冰藻ICE-L的cDNA原始文库,其滴度为1.6×106cfu/mL。扩增后的cDNA文库的滴度为1.0×1010cfu/mL。用PCR方法测得文库的重组率大于97%,插入cDNA的长度为0.5~1.8 kb,0.9 kb以上插入片段占50%以上。取适量扩增文库稀释并铺平板,挑取72个独立菌落,对其中22个独立菌落所插入的cDNA进行测序,克隆到了一个具有5′和3′非编码区的40S ribosomalprotein S5全长基因序列,GenBank收录号为AM167929。     

南极冰藻Chlamydomonas L4的RPS5基因的获得及其在分类中的作用

通过对南极冰藻L4(Chlamydomonas L4)cDNA文库的筛选,克隆出一个具有5'和3'非编码区的40S核糖体蛋白S5(RPS5)全长基因序列.通过与GenBank中日本凋毛藻、拟南芥、果蝇、斑马鱼、非洲爪蟾、人等物种的同源基因或ESTs序列比对,得到了根据RPS5基因的序列相似性绘制的系统分类树,其符合传统的物种分类系统.证明了通过持家基因的一种--RPS5基因的序列相似性进行分子分类学研究具有可行性.     

嗜碱盐单胞菌X3中异化型硝酸盐还原酶编码基因簇的功能验证及蛋白结构预测

细菌的氮代谢推动环境的氮循环,硝酸盐还原反应是氮代谢途径中重要步骤之一。本文运用酶活测定、qRTPCR和生物信息学软件分析的方法,对嗜碱盐单胞菌(Halomonas alkaliphila)X3中编码细菌异化型硝酸盐还原酶(Dissimilatory nitrate reductase,Nar)不同亚基的基因簇narGYJV进行了功能验证、蛋白结构预测和系统发育分析。研究表明,X3菌株中存在narGYJV基因簇并具有表达活性,测得Nar的酶活为每克蛋白21.415U;预测到的narGYJV编码蛋白功能区域中1～1246氨基酸属于NarG超家族,编码Nar的α亚基;1261～1752氨基酸属于DMSOR-beta-like超家族,编码Nar的β亚基;2061～2279氨基酸编码γ亚基,1802～2018氨基酸编码δ亚基;Nar的二级结构中无规卷曲占37.59%,α螺旋占34.43%,延伸链占18.33%;NarG、NarY和NarV的3D结构与PDB中大肠杆菌(Escherichia coli)的1Q16 3D结构最接近,覆盖率96%～100%。系统发育树显示,菌株X3中NarG与同属菌的遗传距离较近,在不同菌属间虽然功能相似,其同源性较低;NarY与大肠杆菌中的氨基酸序列的同源关系较近,说明异化型硝酸盐还原酶Nar中不同亚基的系统发育地位不同。研究结果表明,Halomonas alkaliphila X3菌株中存在编码Nar的基因簇narGYJV,编码蛋白具有独特的3D结构,不同亚基的系统发育地位不同。研究结果为进一步研究该菌的氮代谢通路选择和调控机制提供了依据。     

甘氨酸镁对南极冰藻促生长作用研究

研究了甘氨酸镁对南极冰藻的促生长作用。甘氨酸镁已被美国和欧盟等发达国家大量用作新型无公害植物促生长剂和丰产剂。用不同浓度的甘氨酸镁 (0 ,2 5× 1 0 - 6,5 0× 1 0 - 6,1 0 0× 1 0 - 6,2 0 0× 1 0 - 6,40 0× 1 0 - 6)对国家海洋局海洋生物活性物质重点实验室保存的南极冰藻L 1绿藻 (Pyramimonassp.)和 H1硅藻 (Bacillariophyceae )进行培养。实验结果表明 ,甘氨酸镁对南极冰藻 L1绿藻和 H1硅藻有显著促生长作用 ,而且从 L1绿藻和 H1硅藻的生长曲线可以看出 ,甘氨酸镁浓度越高促生长作用越强 ,这将为海洋微藻的培养提供一种新型的生长促进剂     

Changes of proteins in the Antarctic ice microalga Chlamydomonas sp.cultured under UV-B radiation stress

1 IntroductionAntarctic ice m icroalga Chlamydomonas sp., akind ofgreen algae in the Antarctic sea ice, playsavery important role in Antarctic ecological environm ents.Antarctic“ozonehole”enhancesthesolarUVradiationarrivingatseaiceandcontinent. M anyphy…     

两种海洋微藻硝酸还原酶活性测定方法的比较研究

对6种常见海洋微藻的硝酸还原酶活性测定方法进行了初步研究。确立了离体法和活体法的提取(振荡)时间及酶促反应时间,分别为:5 min,30 min(离体法)和6 min,10 min(活体法),并对2种方法进行了对比。结果表明:在本文条件下,离体法较活体法更适于进行塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)、强壮前沟藻(Amphidinium carterae)、中肋骨条藻(Skeletonema costatum)、新月菱形藻(Nitzchia closterium)和旋链角毛藻(Chaetoceros curvisetus)的硝酸还原酶活性的测定;活体法更适于东海原甲藻(Prorocentrum donghainase)硝酸还原酶活性的测定。     

外源基因在衣藻叶绿体中高效表达的研究

植物细胞核生物反应器技术快速发展,外源基因表达量低下一直是困扰该表达体系的一个瓶颈,衣藻叶绿体表达体系的建立为克服这一瓶颈带来新的希望.围绕如何进一步提高外源基因在衣藻叶绿体中的表达量,国内外学者近几年来进行了很多研究,并取得了很大的进展.对外源基因的同质化程度、衣藻叶绿体转录顺式作用元件及衣藻叶绿体基因密码子的偏好性等几个方面作了综述.