高效几丁质降解菌CB101的分离、鉴定及其几丁质酶系的研究

几丁质是海洋中居首位的多糖物质,它是虾、蟹壳的主要成分,同时广泛存在于昆虫外骨骼及真菌的细胞壁中.许多生物包括植物、细菌、真菌和一些无脊椎动物与脊椎动物都能够产生几丁质酶降解几丁质,其中细菌利用几丁质酶降解几丁质作为生活所需碳源和氮源.从生态角度来看,几丁质酶在自然界几丁质循环过程中扮演了重要角色,作为对环境的适应,多种微生物都带有完整的几丁质酶系.     

三疣梭子蟹几丁质酶基因克隆鉴定及在低盐胁迫和蜕皮周期中的表达分析

几丁质酶在甲壳动物中参与多个生物学进程,发挥重要作用。本研究采用RACE技术,克隆获得总长为3694 bp的三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)几丁质酶基因全长c DNA序列,命名为Pt Cht基因。该基因5′和3′非编码区分别为200bp和455bp,开放阅读框为3039bp,推测编码1012个氨基酸,预测分子量为113.4k Da,理论等电点为6.289。生物信息学分析表明,Pt Cht基因含有2个催化结构域和1个几丁质结合结构域Cht BD2,催化结构域具有几丁质酶第18家族的保守基序MotifⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ;同源性和系统进化分析表明,三疣梭子蟹Pt Cht基因与亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)Cht的同源性最高;荧光定量RT-PCR分析表明,Pt Cht基因在各组织中均有表达,而在眼柄和表皮中的相对表达量较高。Pt Cht基因在蜕皮周期中的表达规律表明,Pt Cht基因在不同蜕皮时期存在明显变化,在表皮中先下调后上调;在眼柄中,呈整体上调趋势。通过分析Pt Cht基因在低盐胁迫进程中的表达规律发现,低盐胁迫可显著改变Pt Cht基因在鳃和肝胰腺中的表达模式,整体呈先下降后上升最后下降的表达趋势。该研究结果表明Pt Cht基因在三疣梭子蟹蜕皮发育和渗透压调节中发挥重要作用,为深入研究三疣梭子蟹和其它甲壳动物几丁质酶的功能提供了重要信息。     

南极产低温几丁质酶菌株的筛选及分子鉴定

从南极普里兹湾深海底泥样品中分离得到一批嗜冷细菌,对这些嗜冷细菌进行了产几丁质酶菌株的筛选,对其中一株具有较高产酶活性的菌株AC167所分泌的几丁质酶进行了性质分析,并通过16S rDNA序列分析进行了菌株的分子鉴定。该菌株最适生长温度为10℃,最高生长温度为25℃,是典型的嗜冷菌,经16S rDNA序列比较及系统发育分析鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas)。该菌株只在低于25℃的条件下分泌几丁质酶,酶的最适反应温度为30°C,属于低温酶。     

仿刺参(Apostichopus japonicus)和海地瓜(Acaudina leucoprocta)体壁多肽的响应面法酶解和N末端测序

为充分开发利用海参资源,优化海参体壁酶解工艺,鉴定海参多肽,本文以水解度为指标,设计了3因素(时间、温度和加酶量)3水平的响应面实验,得到海参水解的最优条件是:仿刺参(Apostichopus japonicus)体壁在加酶量1.97%、温度55.7°C、水解136.8min的条件下,水解度为83.39%;海地瓜(Acaudina leucoprocta)体壁在加酶量1.70%、温度55.4°C、水解115.6min的条件下,水解度为63.68%。之后通过使用超滤膜、反相高效液相色谱(RP-HPLC)、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)技术和蛋白测序仪等分析手段从水解产物中分离鉴定出4种多肽。其中,经N端序列鉴定出仿刺参多肽S1、S2氨基酸残基序列分别为Gly-Pro-Val-Gly-Ala-Ser-Gly-Pro-Gln-Gly-ProGln-Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Ser-Ala-Leu和Trp-Pro-Pro-Gly-Asn-Ser-Gly-Ile-Gln-Gly。海地瓜多肽A1和A2氨基酸残基序列分别为Gly-Ala-Asn-Gly-Asn和Trp-Leu-Pro-Gly-Asp-Thr-Gly-Pro-Gln-GlyVal-Thr-Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Ala-Gly。     

一株海洋几丁质酶产生菌的筛选及其产酶条件的初步研究

从胶州湾的海泥中分离到一株几丁质酶高产菌株。经16SrDNA序列分析,认为该菌属于假交替单胞菌(Pseudoaltermonas),并将其命名为SS01。对该菌产几丁质酶的最佳培养条件进行了研究,发现与其它几丁质酶产生菌相比,SS01菌株的最适产酶温度较低,酶活较高。在Zobell2216E培养基中,SS01菌株培养9h进入稳定期。胶体几丁质可诱导该菌几丁质酶的产生。在几丁质培养基中,SS01菌株产酶的适宜条件是:培养温度24℃,培养基起始pH7.0左右,蛋白胨为N源(5g/L),胶体几丁质为C源(5g/L),170r/min振荡培养130h,酶活可达116.2U/mL。     

豚鼠气单胞菌CB101的GIcNAc利用系统及调控蛋白NagC对chil转录的调控

L8和L10是豚鼠气单胞茵（Aeromonascaviae）CB101的两株转座子突变株,突变位置发生在nagA基因,可以组成型表达几丁质酶．我们构建了基因文库,利用Southern杂交从中筛选到一个克隆子包含了三个基因：magB、nagA和nagC．序列分析显示nagBAC的转录方向相同,而且基因的间隔仅有几个碱基．根据已有报道我们推测NagC是几丁质酶的转录调控蛋白。转座子插入nagA破坏了下游的调控蛋白基因nagC的转录和表达,从而几丁质酶成为组成型表达．我们通过构建NagC缺失突变株、凝胶阻滞迁移以及对NagC氨基酸序列的分析初步证明了NagC属于ROK（repressors,opening reading frames,and kinases）家族的调控蛋白,是chiI的转录阻遏因子．     

产甲壳素酶菌株的发酵条件、酶的分离纯化及酶学性质研究

利用甲壳素为唯一碳源从土壤中筛选得到1株产甲壳素酶活力较高的菌株HD002,初步鉴定其为Massilia属。确定菌株产甲壳素酶的最适培养基组成为(g/L):(NH4)2SO45,K2HPO40.7,KH2PO40.3,MgSO4.7H2O 1,胶体甲壳素10;最适产酶培养条件为:培养基起始pH值6.0,培养时间192 h,发酵液酶活力达1.314 U/mL。采用70%饱和度硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose F.F阴离子交换层析、Sephadex G-75凝胶过滤层析对该甲壳素酶进行纯化,SDS-PAGE证明达到电泳纯。该甲壳素酶的分子量为60.2 kDa,最适反应温度为55℃,最适反应pH值为5.0,Cu2+和Fe3+对酶活力有明显的抑制作用,Ca2+和Na+对酶活力有明显的促进作用。     

豚鼠气单胞菌CB101的GlcNAc利用系统及调控蛋白NagC对chiI转录的调控

L8和L10是豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)CB101的两株转座子突变株,突变位置发生在nagA基因,可以组成型表达几丁质酶.我们构建了基因文库,利用Southern杂交从中筛选到一个克隆子包含了三个基因:nagB、nagA和nagC.序列分析显示nagBAC的转录方向相同,而且基因的间隔仅有几个碱基.根据已有报道我们推测NagC是几丁质酶的转录调控蛋白,转座子插入nagA破坏了下游的调控蛋白基因nagC的转录和表达,从而几丁质酶成为组成型表达.我们通过构建NagC缺失突变株、凝胶阻滞迁移以及对NagC氨基酸序列的分析初步证明了NagC属于ROK(repressors,opening reading frames,and kinases)家族的调控蛋白,是chiI的转录阻遏因子.     

南方鲇(Silurus meridionalis)豚鼠气单胞菌溶血素的分离、纯化与致病性研究

采用硫酸铵盐析、DEAE-Sephadex A50凝胶层析法对豚鼠气单胞菌的溶血素进行分离、纯化,获得分子量为32.2kDa的单一多肽溶血素,测定溶血价为25。将该溶血素倍比稀释后梯度接种南方鲇,研究其对南方鲇的致病性和组织病理损伤情况。结果表明:豚鼠气单胞菌溶血素具有较强的毒力,对南方鲇的半数致死剂量(LD50)为0.29mg蛋白/kg体重;病鱼表现为体表褪色,腹部膨大,肝、脾、肾肿大,肝、脾淤血、出血明显;胃肠道内充有大量粘液,黏膜充血、出血;组织病理学表现为骨骼肌水肿、变性,肝细胞变性、坏死,血窦扩张淤血,肾小管上皮细胞变性、坏死,脾脏淋巴细胞减少,胃肠道黏膜上皮变性、坏死,脱落。     

凡纳滨对虾内脏几丁质酶基因的克隆、序列分析与结构预测

几丁质酶是甲壳动物顺利完成生理性蜕壳的关键功能酶．已有研究表明几丁质酶是一个多基因家族．根据甲壳动物几丁质酶保守序列设计引物,应用反转录PCR方法从凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）内脏中扩增得到部分几丁质酶编码基因片段,进一步结合RACE法,克隆得到该几丁质酶完整编码序列．生物信息学分析表明其含有信号肽序列、几丁质酶催化中心序列、PEST连接区和几丁质底物结合部位序列．序列比对发现其与中国对虾（ABB85237．1）、斑节对虾（AF157503．1）和日本对虾几丁质酶（BAA12287．1）具有很高的相似度．     

产甲壳素酶菌株HD001的发酵条件研究及酶的分离纯化

通过对降解甲壳素菌株 HD001 的发酵条件研究,确定了其产甲壳素酶最适培养基组分为 ( w/v ):( NH4 ) 2SO4 2.0%, NaCl 0.5%, K2HPO4 0.07%, KH2P O4 0.03%, MgSO4·7H2O 0.05% 以及葡萄糖 0.1%、酵母粉 0.3% 和胶体甲壳素 1.5%;最适产酶培养条件为:培养基起始 pH 值 6.0,培养温度 30 ℃,培养时间 120 h,发酵液酶活力达 376.2 U/mL.采用硫酸铵分级盐析、DEAE-纤维素离子交换层析、Sephacryl S-100 凝胶过滤层析对该酶进行纯化后,SDS-PAGE电泳显示单一条带,其相对分子质量约为 85.7 kDa.     

长牡蛎碱性磷酸酶的分离纯化及部分性质研究

本文以长牡蛎为酶源提取材料,用正丁醇抽提,硫酸铵分级分离,DEAE-52和Sephadex G-100柱层析,得到一定纯度的碱性磷酸酶,提纯倍数为61.96,比活力达1.326U/mg.该酶的最适pH值9.6,最适温度38℃,初速度6.8μmol/(dm~3·min),米氏常数Km值为1.30mmol/dm~3.实验结果表明,Mg~(2+)对该酶有明显的激活作用;Zn~(2+)、Cu~(2+)、Hg~(2+)对该酶有明显的抑制作用.     

中华鲟卵黄脂磷蛋白的分离纯化及性质分析

采用Sephacryl S-300凝胶过滤和DEAE Fast Flow阴离子交换两种层析法分离纯化中华鲟(Acipenser sinensis)卵黄脂磷蛋白(lipovitellin,Lv),对每个峰进行SDS-PAGE电泳及油红O、甲基绿和Schiff试剂特异染色,峰Ⅱ蛋白均呈阳性,表明峰Ⅱ蛋白为中华鲟卵中的一种卵黄脂磷蛋白,SDS-PAGE电泳分析表明其由一种分子质量为43.5 ku的亚基构成。对中华鲟Lv氨基酸组成进行研究,证明其是一种含有相对较多天冬氨酸、谷氨酸、缬氨酸和亮氨酸的蛋白。     

Purification, characterization and ELISA of metallothionein from red scorponifish, Sebastiscus marmoratus

INTRODUCTIONATislowKWCys-rich(aboutonethird)metal-bindingprotein,lackofaromaticaminoacidresidues.AThasbeenfoundinkidneysandliversofmanymammals,andalsoininvertebrates,microorganismsandplants.ThepresenceofanAT-likeproteinhasbeenfoundinanumberofaquaticorganisms,includingtheplaice(Overnelletal.,1977),rock-fish(Olafsonetal.,1974),goldfish(Marafant,1976),andcrabandshrimp(Olafsonetal.,1979).AThasbecomethesubjectofgreatInterestinrecentyearsduetotheirwideexistenceandmetalaffinity.Scientistsha…     

Purification and characterization of lipoxygenase from Entermorpha clathrata

The purification and characterization of lipoxygenase （LOX, EC 1.13.11.12） from the green algae Enteromorpha clathrata were studied. Two components marked LOX - 1 and LOX - 2 were purified and their molecular masses were estimated to be 102 and 79 ku by SDS - PAGE. Both LOX - 1 and LOX - 2 were stable over the pH wide range 6.0 - 10.0 and had the optimum pH of 10.0 and 8.6, at optimum temperature of 30 and 25℃, respectively. Substrate specificities of LOX - 1 and LOX - 2 were the greatest towards linoleic acid, followed by arachidonic acid and linolenic acid. The Michaelis constant values of LOX - 1 and LOX - 2 were 0.23 and O. 20 mmol/dm^3 with the substrate of linoleic acid. The LOX activities were stimulated greatly by Ca^2＋ but inhibited by Hg2 ~ and the antioxidants such as BHA, BHT and TBHQ. The hydroperoxide products of LOX were analysed by HPLC with the substrate of methyl linoleate, and the results showed that LOX - 1 formed mainly 9-hydroperoxides while LOX - 2 formed both 9- and 13-hydroperoxides at a ratio of 24： 76.     

Vibrio sp.510产褐藻胶裂合酶的底物专一性分析

Vibrio sp.51 0具有很强的产生褐藻胶裂合酶的能力。本实验对该菌发酵产生的褐藻胶裂合酶经疏水色谱除去杂蛋白 ,再经灌注色谱分离得到 3个酶组分峰。经底物专一性检测 ,峰 1和峰 3对聚甘露糖醛酸和聚古罗糖醛酸均具降解作用 ,峰 2只对聚甘露糖醛酸有降解作用。园二色谱测定酶的二级结构 :峰 1结构最为复杂 ,以β-转角为最高 ,占 31 .5% ,无规线团占 2 7% ,α-螺旋占 2 5.8% ;峰2为β-折叠 ,占 95.5% ;峰 3以 60 %的α-螺旋和 40 %的无规线团形式存在。 3个分离峰的底物专一性和二级结构的差异证明了褐藻胶裂合酶蛋白的结构与功能之间的相关性。     

从中国对虾分离纯化的一种杆状病毒及其超微结构的研究

从患病和濒死的中国对虾(Penaeus chinensis)头胸部分离提纯出一种杆状病毒,同时经对病虾的鳃、胃和中肠组织进行超薄切片及电镜观察,亦在上述组织的细胞核内发现大小相同、形态一致的大量杆状病毒粒子.成簇的病毒粒子主要在核内装配,并导致细胞结构的病变.病毒粒子大小约为320～400nm×100～130nm,两端钝圆,中部膨大,有囊膜,分内外两后,核衣壳大小为250～300nm×70～100nm.细胞内未观察到有核型多角体或颗粒体类包涵体存在.根据病毒学分类原则,该病毒应属于杆状病毒属无包涵体杆状病毒亚群,即杆状病毒C亚群.     

太平洋鳕鱼脑中硫苷脂的分离纯化和分析

以太平洋鳕鱼为原料,从鳕鱼脑中分离硫苷脂,确立了提取及纯化的条件,并对硫苷脂的纯度和分子种进行分析。首先,采用氯仿/甲醇(2∶1,v/v)提取总脂。然后,依次采用氯仿/甲醇/水(7∶3∶0.3,v/v/v)洗脱硅胶柱层析,含0.2mol/L乙酸铵的氯仿/甲醇/水(30∶60∶8,v/v/v)洗脱DEAE Sephadex-A25离子交换柱层析,40%甲醇脱盐和100%甲醇洗脱反相C8柱层析,获得硫苷脂纯品。最后,利用500YMC Diol液相色谱柱(3.0mm×250mm,5μm)分离,以正己烷/异丙醇(70∶30,v/v),异丙醇/水/甲酸/氨水(100∶13∶1∶0.14,v/v/v/v)为流动相梯度洗脱,采用负电喷雾电离(ESI)和母离子扫描模式,用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法分析了鳕鱼脑硫苷脂的纯度和分子种组成,并比较了其与哺乳动物脑中硫苷脂分子种组成的异同。结果表明,本实验制得的鳕鱼脑硫苷脂纯度为90.74%,与哺乳动物类似,鳕鱼脑硫苷脂的长链碱基以鞘氨醇为主,主要分子种为d18∶1-C24∶1,但脂肪酸的羟基化程度略低,且含少量独特的分子种,如d18∶1-22∶1和d18∶2-25∶2。     

Flammeovirga sp. SJP92琼脂酶的分离纯化及其酶学性质

琼胶酶是一类能够降解琼脂糖生成琼胶寡糖的酶类,具有广泛的应用范围.从海洋性高产琼胶酶菌株Flammeovirga sp. SJP92的发酵液经硫酸铵沉淀,DEAE 琼脂糖离子层析,分离纯化获得了一个分子量约为70KDa的琼胶酶AgaB.经过酶学性质分析,它的最适pH值为70,最适温度为40℃,在最适温度下能够保持较好的稳定性.进一步的分析表明, MgSO4和β Me对该酶有明显的促进作用,而CaCl2、MnCl2、ZnCl2、CoCl2、FeCl3、CuSO4等则会强烈抑制它的活性.此外,通过产物分析表明,该酶能够通过内切作用将琼脂糖最终降解成6糖和4糖.AgaB的分离纯化及其酶学性质分析为其工业应用奠定了基础.