牙鲆病原秦皇岛弧菌的血清型及荧光抗体检验

用分离于病(死)牙鲆(Paralichthys olivaceus L.)的一种新病原弧菌——秦皇岛弧菌(Vibrio qinhuangdaora sp.nov.)的代表菌株(HQ010712-1株),分别制备全菌(OK)及热处理(121℃作用1h)的菌体(O)免疫原,强化免疫接种家兔制备相应抗血清,对供试12株秦皇岛弧菌进行了血清型检定,结果表明均存在同种的K抗原和同种的O抗原(血清同源),其中O抗原具有强免疫原性、K抗原的免疫原性弱但具有强O凝集抑制作用;以相应OK抗血清为第一抗体,以标准的羊抗兔IgG荧光抗体为第二抗体,对12株秦皇岛弧菌的纯培养物及用代表菌株(HQ010712-1)人工感染病死牙鲆的肝组织进行了间接荧光抗体染色,结果显示了特异的荧光反应。     

溶藻弧菌的间接荧光抗体快速检测

建立了大黄鱼病原溶藻弧菌的间接荧光抗体检测方法，溶藻弧菌的特异性抗血清由新西兰兔制备，试管凝集法测定抗血清及交叉反应效价，吸附离心法去除交叉反应，荧光抗体为异硫氰酸荧光素标记的羊抗兔免疫球蛋白，现场检测对具典型弧菌病表症大黄鱼病原检出率为100％，表观健康大黄鱼病原检出率为30％，养殖海水检测结果均为阴性，结果表明，间接荧光抗体检测法不仅可以用于已感染发病大黄鱼的快速检测，而且还能用于已感染未发病大黄鱼的检测。     

间接ELISA技术在病原性鳗弧菌SMP1快速检测中的应用

以大菱鲆(Scophthalmus maximus)出血症的病原菌——鳗弧菌(Vibrio anguillarum)SMP1为抗原,制备兔抗血清,测定了抗血清的工作浓度和对抗原的特异性,建立了在大菱鲆肝肾组织中检测SMP1的间接ELISA方法。SMP1人工感染大菱鲆,用建立的间接ELISA对大菱鲆肾脏和肝脏进行检测,结果肾脏的阳性检出率为87.7%,肝脏的阳性检出率为90%。该方法的建立有助于快速准确地鉴定由SMP1引起的大菱鲆疾病。     

大黄鱼病原菌──溶藻弧菌的ELISA快速检测研究

以灭活溶藻弧菌（0.05%甲醛，30℃,8h）制成菌苗，注射免疫实验兔获得抗血清。该抗血清经吸附后与副溶血弧菌、河流弧菌等10株对照菌株无交叉反应，用该抗血清进行溶藻水中溶藻弧菌浓度均低于最低检测限、外观健康大黄鱼肝脏中溶藻弧菌的阳性检出率为20%、患病大黄鱼的阳性检出率为80%，表明ELISA法不仅可以用于诊断大黄鱼的溶藻弧菌病，也可能检测无病症带菌大黄鱼。     

大黄鱼病原菌——溶藻弧菌的EuSA快速检测研究

以灭活溶藻弧菌(0.05%甲醛,30℃,8h)制成菌苗,注射免疫实验兔获得抗血清.该抗血清经吸附后与副溶血弧菌、河流弧菌等10株对照菌株无交叉反应.用该抗血清进行溶藻弧菌ELISA检测,其最低检测极限为97000cfu/ml.将该方法应用于养殖现场,检测结果为海水中溶藻弧菌浓度均低于最低检测限、外观健康大黄鱼肝脏中溶藻弧菌的阳性检出率为20%、患病大黄鱼的阳性检出率为80%,表明ELISA法不仅可以用于诊断大黄鱼的溶藻弧菌病,也可以检测无病症带菌大黄鱼.     

养殖大黄鱼副溶血弧菌的酶联免疫吸附法研究

本文建立了网箱养殖大黄鱼病原菌--副溶血弧菌酶联免疫吸附法,也即间接ELISA快速检测方法.用0.5×10-3(V/V)甲醛、30℃作用8h灭活病原菌制成菌苗.用该菌苗免疫新西兰兔获得特异性抗血清,以辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG为标记第二抗体,对副溶血弧菌进行间接ELISA快速检测,其最低检测极限为5×104CFU/cm3.现埸检测养殖水体中没有副溶血弧菌检出,患病大黄鱼肝脏副溶血弧菌的检出率为70%,外观健康大黄鱼肝脏副溶血弧菌的检出率为20%.现埸检测结果表明间接ELISA检测法不仅可以用于患病大黄鱼病原菌的快速检测,而且能够检测出无病症带菌大黄鱼.     

降低交叉反应的鱼类病原菌检测抗体芯片初步研究

采用菌体吸附法对海豚链球菌(Streptococcus iniae)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、荧光假单胞菌(Psedomonas fluo-rescens)和海洋分支杆菌(Mycobacterium marinum)6种养殖鱼类病原菌的兔抗血清进行吸附,以减小抗血清与其它菌株的交叉反应;吸附纯化后的抗体作为捕获抗体构建了病原菌检测抗体芯片。实验结果显示,与未经过吸附的纯化抗血清构建的抗体芯片相比,血清吸附实验能有效减少交叉反应,降低抗体的非特异性吸附,提高细菌检测的特异性。同时,以迟缓爱德华氏菌为例,采用吸附纯化后抗体制备的抗体芯片检测人工感染迟缓爱德华氏菌和自然发病的牙鲆,均观察到迟缓爱德华氏菌的特异性显色反应,得到了较理想的检测结果。本文结果说明优化后的病原菌检测抗体芯片可用于水产养殖鱼类常见的上述6种细菌性疾病的有效检测。     

《海洋与湖沼》2010 年第4 期论文导读

<正>河流弧菌感染后牙鲆血清抗菌物质的研究采用1×107cells/mL的河流弧菌(Vibrio fluvialis)悬液背部肌肉注射感染牙鲆(Paralichthys olivaceus),用Sephadex G-25凝胶柱对第二次人工注射感染后24 h牙鲆血清进行分离,其中第7~15收集管对河流弧菌具有抗菌     

养殖刺参腐皮综合征两种致病菌Dot-ELISA快速检测

以养殖刺参(Apostichopus japonicus)腐皮综合征两种主要致病原灿烂弧菌(Vibrio splendidus)和假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)为抗原,分别制备兔抗血清,建立了两种病原菌的点酶ELISA(Dot-ELISA)检测方法。根据方正试验,确定检测用一抗、二抗最佳工作稀释度:灿烂弧菌抗血清稀释度320,酶标二抗稀释度3 000;假交替单胞菌抗血清稀释度160,酶标二抗稀释度2 000。阻断试验结果表明两种抗血清特异性均较高。灿烂弧菌抗血清在稀释度为40时与溶藻胶弧菌、河流弧菌、创伤弧菌等弧菌发生微弱交叉反应,提高稀释度到160时,不发生交叉反应。假交替单胞菌抗血清基本不与常见海水致病弧菌发生交叉反应。人工感染试验检测结果表明该方法能从患病海参溃烂组织、未发病海参组织和感染水体检测到相应致病菌,检测灵敏度为9.4×103个/mL。人工感染试验检测结果经直接凝集反应验证。该方法操作简便、灵敏度高,不需复杂仪器设备,适合在基层推广。     

致病性副溶血弧菌脂多糖的制备及其对牙鲆的免疫效应

利用酚水法提取的副溶血弧菌脂多糖 (lipopolysaccharide,L PS) ,经 SDS- PAGE电泳及银染色后表明这种方法提取副溶血弧菌脂多糖显示出 4 1 .3KDa,30 .7KDa,2 5 .4 KDa以及 1 1 .8KDa 4条主要脂多糖带。用此做免疫原 ,采用加强腹腔注射法免疫牙鲆 ,测定牙鲆的血清凝集抗体效价和白细胞吞噬活性。结果表明 ,免疫后的牙鲆对副溶血弧菌的血清凝集抗体效价有显著提高 ,第 3周抗体滴度达到最高值 2 5 6 ;白细胞的吞噬活性与对照组相比有明显加强 (P<0 .0 5 )。     

Ultrastructure study of the diatom——Ⅱ. Synedra, Cyclophora, Plagiogramma, Opephora, Fragilaria and Pseudostaurosira

Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅｄｉａｔｏｍ──Ⅱ．Ｓｙｎｅｄｒａ，Ｃｙｃｌｏｐｈｏｒａ，Ｐｌａｇｉｏｇｒａｍｍａ，Ｏｐｅｐｈｏｒａ，ＦｒａｇｉｌａｒｉａａｎｄＰｓｅｕｄｏｓｔａｕｒｏｓｉｒａ￥ＬｉｕＳｈｉｃｈｅｎｇ（Ｒｅｃｅｉｖｅｄ...     

Ficolin在毛蚶抗弧菌感染中的作用

Ficolin是一类含FBG结构域的蛋白,在动物免疫防御中发挥重要作用。无脊椎动物中,Ficolin主要作为模式识别受体和免疫效应分子发挥免疫功能。本研究从毛蚶中克隆获得一条Ficolin基因(命名为SsFic1),该基因编码区序列长度为897 bp,编码298个氨基酸,推测的蛋白含有典型的FBG结构域和Coiled coil结构域,但未发现胶原样结构域。SsFic1的mRNA在毛蚶各组织中广泛分布,其中在肝胰腺和鳃中表达丰度较高,但SsFic1转录产物在卵细胞和四细胞期未检测到,说明该基因不是母源性免疫基因。副溶血弧菌和脂多糖、葡聚糖等免疫刺激物均可诱导SsFic1显著上调表达。利用RNAi技术抑制SsFic1基因表达,酚氧化酶激活因子PAF和补体相关基因(C1qDC、补体C3和Fic3)的表达量及CAT、SOD和PO的酶活力均显著下降,而TEP、C1q2和Fic2等基因的表达显著上调。敲降SsFic1表达后,感染副溶血弧菌后毛蚶血细胞数量和吞噬能力均显著低于对照组,这也是RNAi实验组毛蚶死亡率和血细胞凋亡率显著升高的原因。综上,SsFic1可能通过调控补体通路和酚氧化酶原激活通路参与毛蚶免疫防御反应,这对贝类免疫学研究及抗病新品系的选育具有重要意义。     

美国红鱼(Sciaenops ocellatus)、鲈鱼(Lateolabrax maculatus)、斜带髭鲷(Hapalogenys nitens)耐流性试验研究

采用续航游泳时间评测指标作为评测鱼类游泳能力的方法,对一龄美国红鱼、鲈鱼、斜带髭鲷的续航时间,美国红鱼的临界(游泳)速度以及水温对美国红鱼续航时间影响进行了初步研究。结果表明,三种鱼中,美国红鱼耐流能力最强,其次为鲈鱼和斜带髭鲷。美国红鱼、鲈鱼、斜带髭鲷三种鱼的续航时间(或续航能力)与水流流速呈乘幂递减关系。水温对美国红鱼的游泳能力有显著的影响,试验结果表明,本文研究的美国红鱼,在水温20℃、流速84cm/s下的持续续航时间最长,可认为是该规格美国红鱼最适游泳水温范围。     

蜈蚣藻、蜈蚣藻节夹变型和拟厚膜藻卡拉胶的研究

于１９８８－１９９０年对采自青岛的蜈蚣藻，河北的蜈蚣藻节夹变型和浙江的拟原膜所含多糖的产率，物理性质，化学组化和结构进行分析研究。实验结果表明，拟厚膜藻多糖无凝固性；蜈蚣藻多糖凝固性很低；蜈蚣藻节夹变型多糖有些凝固性，是三者中凝固性最好的。     

赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)对蒙古裸腹溞(Moina mongolica)和日本新糠虾(Neomysis japonica)的毒性影响

采用生物急性和慢性毒性实验的方法,研究了赤潮异弯藻对蒙古裸腹溞和日本新糠虾的毒性影响,并初步探讨了赤潮异弯藻导致二者较快死亡的机制。结果发现,赤潮异弯藻不仅对蒙古裸腹溞和日本新糠虾的存活有显著影响,而且使其个体变小、产幼前发育时间延长、总生殖量降低、平均存活时间缩短,种群数量增长受抑制。显微观察发现,蒙古裸腹溞能摄食赤潮异弯藻,但摄食后,其粪便紧紧地粘在蒙古裸腹溞的肠道末端;日本新糠虾不摄食赤潮异弯藻,但该藻粘附在其触须、附肢以及腹部、尾部的刚毛上,以及作为食物的卤虫幼体也被大量粘附在一起,聚集成团,或通过赤潮异弯藻粘附在日本新糠虾的附肢上。因此赤潮异弯藻很可能通过干扰蒙古裸腹溞和日本新糠虾正常的生理活动,而导致其快速死亡。     

一种新的中国对虾弧菌病原菌──产气弧菌

于１９９３年８月，从山东省昌邑县下营镇患败血病的中国对虾血淋巴内分离到多株细菌，其中２株人工感染证实为病原菌；经５０多项形态，生理，生化特性测试鉴定为产气弧菌Ｖｉｂｉｏｇａｚｏｇｅｎｅｓ。其主要特性为：革兰氏阴性，弧状，极生单鞭毛，产生红色素，氧化酶呈阳性，精氨酸双水解酶，赖氨酸脱羧酶，鸟氨酸脱羧酶均为阴性，淀粉酶，明胶酶为阳性，硝酸盐还原阴性，利用木糖，水杨苷，山梨醇发酵葡萄糖产气，利用柠檬酸盐     

塔玛亚历山大藻和赤潮异弯藻对黑褐新糠虾和卤虫的急性毒性作用

以黑褐新糠虾和卤虫为实验材料,研究了两种典型有毒有害赤潮藻,塔玛亚历山大藻和赤潮异弯藻的毒性.结果表明塔玛亚历山大藻和赤潮异弯藻都能影响糠虾的存活,在9 h内塔玛亚历山大藻和赤湖异弯藻对糠虾的半致死浓度分别约为7000和450 000个/cm3;在24 h内塔玛亚历山大藻和赤潮异弯藻对卤虫存活没有显著影响,而赤潮异弯藻能对卤虫的活力产生强烈的抑制作用,0.1,1.5,5和24 h的半抑制浓度分别为15 000,7500,4500,3000个/cm3,但在赤潮异弯藻较低浓度为3000个/cm3时,经过48 h卤虫的运动能力能够恢复到正常水平.结果表明,这两种有害藻对同一种生物的毒性大小存在差异,而这两种甲壳类生物对同一种有害藻的反应也不相同.     

东风螺、弯竹蛏和斑节对虾的壳基质蛋白组学分析

从软体动物中的腹足纲、双壳纲以及节肢动物中的甲壳纲分别选取了3种中国沿海常见的品种——东风螺、弯竹蛏、斑节对虾,提取并分析它们的壳基质蛋白。利用液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）技术对蛋白质组学进行分析发现特定的蛋白质具有明显的种属差异：①N66蛋白（一种碳酸酐酶）通常存在于弯竹蛏中,但不存在于东风螺和斑节对虾中,揭示N66蛋白质具有特异性,在未来的物种鉴定中可能具有重要的参考意义;②角质层蛋白AM1199和CP14.6存在于斑节对虾的表皮结构中,在东风螺和弯竹蛏中未检测到;③血蓝蛋白同时在3种动物外壳的基质蛋白中被鉴定出来,揭示了其在不同物种的外壳形成与发育过程中的重要作用。该研究为壳基质蛋白在软体动物或节肢动物外壳中的鉴定提供了基础,也为探索不同物种的生物矿化过程提供了重要参考。     

黑暗条件下缢蛏(Sinonovacula constricta)对牟氏角毛藻(Chaeroeeros moelleri)和青岛大扁藻(Platymonas subcordiformis)的滤食效应

采取捕食者-猎物间捕食效应研究方法,研究了黑暗条件下缢蛏对牟氏角毛藻、青岛大扁藻的滤食效应。结果表明,缢蛏滤食牟氏角毛藻和青岛大扁藻的功能反应均属Holling-Ⅱ型,拟合的圆盘方程分别为Na=0.981×N0/1 0.00039×N0和Na=0.7949×N0/1 0.00636×N0;缢蛏自身密度对滤食牟氏角毛藻、青岛大扁藻功能反应影响的数学模型分别为E=0.985P-1.0256和E=0.778P-1.1819;缢蛏自身密度与牟氏角毛藻、青岛大扁藻藻浓度间的联合反应方程分别为Na=0.9663XP-0.1819×N0/1 0.00039×N0和Na=0.6182×P-0.1819×N0/1 0.00636XN0分析了缢蛏的滤藻速率、滤藻功能反应类型及滤藻效应特征。     

牙鲆gnrh基因的表达分析

本文通过qPCR方法,研究了我国重要海水鱼类——牙鲆（Paralichthys olivaceus）雌、雄成体组织以及性腺分化期的脑、性腺中gnrh1、gnrh2和gnrh3的表达水平。结果显示,gnrh1分布于所有检测的组织：在脑、垂体、肾脏和肝脏中高表达,在性腺中表达相对较低;gnrh2则在雌、雄性的肝脏以及雄性的肠、肾脏、眼睛和头肾中;而gnrh3只在雄性的肾脏、眼睛和肌肉中检测到微弱表达。人工诱导的牙鲆雌核发育鱼苗分别用17β-雌二醇（E₂）和17α-甲基睾酮（MT）处理,使其分化为雌性或雄性个体表型。在性腺分化期的脑中,gnrh1的表达呈现上升趋势,在全长（total length,TL）4 cm鱼苗中,E₂组的表达显著高于MT组（P<0.05）;gnrh2在2 cm TL时E₂组显著高于MT组（P<0.05）,随后在E₂和对照组的表达水平均出现下降趋势;gnrh3在2 cm TL时E₂和对照组的表达均显著高于MT组（P<0.05）,自6 cm TL时MT和E₂组的表达开始下降。在性腺中,三种gnrh在性腺分化前2 cm TL表达量都相对较高,随后呈现下降趋势。综上,推测牙鲆gnrh1可能参与了性腺分化的启动、分化过程及性腺发育,gnrh2主要参与了性腺分化的启动,gnrh3主要参与了性腺分化的启动和分化过程。