两种绿藻—长石莼和袋礁膜原生质体的制备、培养和融合的研究

原生质体是研究植物遗传工程的好材料。自从Cocking(1960)首次用酶解法从蕃茄根尖分离出大量原生质体以来,高等植物原生质体的研究已经开展得比较广泛,但由于技术上的原因,目前从原生质体诱导出完整植株的还只限于烟草、矮牵牛、石刁柏、油菜和马铃薯等十余种。而藻类方面的工作则报道甚少。Miroslav(1970)用蜗牛消化腺提取液处理尾丝藻(Uronema gigas)得到了原生质体。用含有葡萄糖和果胶的培养基培养,观察到了细胞壁的再生和细胞分裂。Rietema(1973)由枝丝藻(Derbesia tenuissima)挤压出原生质体,并得到了再生植株。 近年来,植物原生质体已被广泛地用来研究体细胞融合。Callson(1972)首次     

紫菜营养细胞和原生质体的分离和培养

六十年代初，Cocking(1960)(1)采用酶法大量分离植物原生质体获得成功。二十多年来，植物单细胞和原生质体的分离、培养的研究，得到了广泛的开展，并取得很大成就。这些成就的取得，为植物遗传育种和遗传学理论的研究开辟了广阔前景。     

江蓠原生质体分离和培养的初步研究

以江蓠Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｖｅｒｒｕｃｏｓａ（Ｈｕｄｓ．）Ｐａｐｅｎｆｕｓｓ为材料,用微生物发酵法提取的琼胶酶成功地分离到江蓠的原生质体,经初步培养,原生质体发育为愈伤组织,为江芳江生物工程研究和育苗利用提供了可能。     

长心卡帕藻原生质体分离、培养研究

In this study, protoplasts were successfully isolated from Kappaphycus alvarezii using snail enzymes, abalone enzymes and cellulase. The optimum enzymic ratio was fixed to be 20% of abalone enzyme, 12% of cellulase and the osmotic stabilizer was 2.0 mol/L glucose. The optimum enzymic hydrolysis conditions were found to be dark enzymolysis at 30°C continuing for 4.0 h. The resultant density and yield of protoplasts achieved 32.60×104 mL-1, 65.20×104 g-1 tissue for Kappaphycus alvarezii. Finally, under the temperature of 20°C, light intensity of 1 500–2 000 lx and photoperiod of 12 h/d, two developmental pathways were investigated:(1) callus-like cell mass and regenerated plantlet occurred on protoplast;(2) young shoots and calluslike cell mass occurred in tissue blocks after enzymolysis.     

裙带菜原生质体的分离和培养

本文以裙带菜(Undaria pinnatifida(Harv.)Suringar)为材料,进行原生质体分离和培养研究。取得以下结果: 1、使用海螺酶(sea snail enzymes)和纤维素酶(cellulase,Onozuka R-10),酶解裙带菜细胞壁,在一定的条件下,能够大量地分离成活的裙带菜原生质体。 2、实验表明,氯化钠可作为分离裙带菜原生质体研究中的一种理想的渗透刑。 3、荧光增白剂染色镜检法可作为鉴定裙带菜原生质体的一种辅助方法,并适用于原生质体再生壁的观察。 4、光照(2000—2500Lux)能促使原生质体再生细胞壁,含有蔗糖(W/V,1％)的培养液有助于原生质体再生细胞壁。 5、分离的裙带菜原生质体,经培养,已能长成幼体。     

坛紫菜和拟线形紫菜的原生质体融合及培养

应用PEG 法和电融合法进行了坛紫菜和拟线形紫菜的原生质体融合试验,探讨了PEG 的浓度、处理时间以及洗涤液种类与融合的关系。结果表明,PEG 法的融合率为4.9%～10.2%,电融合率高达32.3%。融合细胞经诱导长成多细胞团的愈伤组织,从愈伤组织上升出小紫菜。     

长石莼（缘管浒苔）（Ulva linza）原生质体再生与分化发育初步研究

采用细胞酶解技术获得长石莼（缘管浒苔）原生质体,再通过细胞培养观察原生质体再生以及各种分化发育途径。结果表明,长石莼（缘管浒苔）主要存在3种分化发育途径：1）部分原生质体可直接分裂形成有假根或无假根得单细胞苗。2）部分原生质体分裂成规则细胞团或不规则细胞团,最后形成苗簇。3）部分原生质体可发育为孢子囊／配子囊,其中部分...     

四种绿藻和四种褐藻脂肪酸组成的比较研究

对绿藻门和褐藻门8种大型海藻的脂肪酸组成进行了研究,发现两类海藻都有其特征脂肪酸或有几种特征脂肪酸组合做为其化学分类的标记。4种绿藻的主要脂肪酸是16:0、16:1ω7、18:4ω3、18:1ω7、18:2ω6、18:3ω3、18:1ω9,其中18:1ω7和18:3ω3的含量相对较高;4种褐藻中16:0、18:1ω9、18:2ω6、18:3ω3、18:4ω3、20:5ω3、20:4ω6的含量占绝对优势,十八碳和二十碳多不饱和脂肪酸是褐藻门脂肪酸的典型特征。另外,褐藻中含有较高含量的EPA,海带和裙带菜尤为明显。对2门类5属8株海藻所含脂肪酸进行聚类分析的结果显示海藻各门及种间的亲缘关系,表明利用静态条件下海藻脂肪酸的聚类分析结果,可在一定程度上判别海藻在分类上亲缘关系的远近,海藻脂肪酸组成的差异可以作为海藻分类的一个辅助技术手段。     

角叉菜(Chondrus ocellatus Holm)原生质体分离、培养与再生的研究

从角叉菜(Chondrus ocellatus Holm)的孢子体和雌配子体中,分离了大量的成活原生质体。分离的最适条件为:纤维素酶3％,粉红鲍鱼酶8％,山梨醇1.2mol/dm~3,pH6.0,温度为15℃。细胞壁的完全解离,已用荧光增白剂的染色不着色和原生质体在低渗溶液中的易碎性证实。培养后再生的细胞,经均等分裂,随后发育成实心球状体;或出芽后不等分裂,发育成丝状体和愈伤组织状细胞团。在PES培养基中,经30～40d培养,部分球状体和愈伤组织状细胞团分化出完整植株,但丝状体未能分化。低浓度的IAA、6—FA和C—751对球状体和愈伤组织状细胞团的生长和分化都有促进作用。由原生质体培养获得完整的再生植株,这在真红藻纲(Florideophyceae)中为首例报道。     

篮子鱼内脏粗提液制备长心卡帕藻和细齿麒麟菜原生质体的初步研究

于2011年9月至2013年1月,在海南陵水热带海藻实验基地,利用篮子鱼(Siganus fuscessens)内脏研磨制备消化酶,开展了酶解制备大型产胶红藻长心卡帕藻(Kappaphycus alvarezii)和细齿麒麟菜(Eucheuma denticulatum)的原生质体研究,观察了不同酶解条件对两种产胶海藻原生质体产量和产率的影响。结果表明,细齿麒麟菜原生质体得率高于长心卡帕藻;在藻泥与酶浓度配比中,长心卡帕藻或细齿麒麟菜藻泥越多,所制备出的原生质体产量越高,而其制备效率却越低;在温度(20~30℃)梯度中,有最高原生质体产量和效率的酶解温度为25℃;在pH 6.0~8.0的实验酶解梯度中,酶解pH 6.0时的酶解效果最好;在12~48 h实验酶解时间梯度中,酶解时间为48 h时原生质体产量和得率最高;酶解时间越长,长心卡帕藻或细齿麒麟菜原生质体制备效率越高。为此建议在25℃和pH6.0条件下,适当增加海藻藻泥用量和延长酶解时间,以更有效获得原生质体。     

海藻工具酶研究Ⅱ.褐藻酸酶的制备、性质及对裙带菜细胞的解离研究

褐藻酸降解菌埃氏交替单胞菌(Alteromonas espejiana)菌株Al01,通过发酵培养制备褐藻酸酶.该酶作用的最适pH为7.0,最适温度为40℃,最适底物浓度为1%～2%;在离子浓度为0.5mmol/dm3时,Mn2+对酶促反应稍有促进作用,Ca2+、Hg2+则有明显的抑制作用.该酶用于裙带菜单细胞和原生质体解离时,以酶液组成为褐藻酸酶1%、纤维素酶1%,45×10-3的NaC1为渗透剂,酶解温度25℃,pH7.0,酶解3-4h效果最好.     

袋礁膜、缘管浒苔和孔石莼金属硫蛋白的诱导与合成

将袋礁膜、缘管浒苔和孔石莼等分别放入含有Cd²⁺的人工海水进行诱导后,匀浆并分离出其可溶性蛋白质,通过葡聚糖凝胶G—75凝胶过滤,将分布收集液中含Cd²⁺的部分集中,再过DEAE纤维素离子交换柱,进行分布收集,并测定其蛋白质及SH基的含量、250mμ和280mμ的消光值及镉的浓度。证实这三种藻均因Cd²⁺诱导而合成一种小分子的蛋白质(通过凝胶过滤法测定分子量约一万)具右高SH基含量、耐热性和同重金属结合的高亲合力,250mμ的消光值也大于280mμ的消光值。由此证明真核藻类中的绿藻也有合成金属硫蛋白的特性。     

低分子质量κ-卡拉胶钾的酶法制备及其对原发性高血压大鼠降血压作用的研究

为了探究低分子质量κ-卡拉胶钾对原发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat, SHR)血压的影响,以κ-卡拉胶粉为原料,酶解法和醇沉法相结合制备分子质量为3.5 kDa的低分子质量κ-卡拉胶寡糖(low-molecular-weightκ-carrageenan, LC)。将LC与KCl溶液混合,经醇沉操作除去游离的钾离子,以此获得高结合率的低分子质量κ-卡拉胶钾(low-molecular-weightpotassiumκ-carrageenan,LCP),使得LC中结合型钾元素的含量由原先的6.5%上升至8.7%。各组灌胃剂量:实验组600mg/kgLCP,空白组灌胃蒸馏水,阳性对照组10 mg/kg卡托普利。结果显示, LCP对SHR有稳定且持续的降压作用,与空白组相比,显著降压18mmHg。LCP显著降低了RAS系统中肾素(P0.05)和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)(P 0.01)的水平,推测LCP的降压机理可能是降低了RAS系统的活化程度;此外, LCP显著降低了血液中脂多糖(LPS)的水平(P 0.05),并显著改善了肠道上皮结构的完整性。     

琼胶降解菌F-6筛选、培养条件及对条斑紫菜(Porphyra yezoensis)细胞解离作用的研究

利用琼胶作为唯一的碳源从青岛太平角海域的海水和红藻样品中筛选分离得到一株高产琼胶酶的海洋菌F-6,对其最适的产酶条件,利用琼胶酶分离条斑紫菜的原生质体和原生质体的培养进行研究。结果表明,通过单次单因子和正交实验确定琼胶降解菌株F-6最适产酶培养基配方为(W/V):琼胶0.7%;酵母粉0.3%;蛋白胨0.5%;NaCl2.0%;K2HPO40.1%;CaCl20.02%;MgSO4·7H2O0.05%;FeSO4·7H2O0.002%;起始pH=7.5,最适的发酵产酶条件为:26℃培养36h。经条件优化后,粗酶液的酶活高达631.6U/ml。发酵液经过6000g离心30min得到粗酶液,粗酶液经过8k分离膜超滤,加入1mol/L渗透剂,0.22μm滤膜过滤除菌后降解条斑紫菜组织块,成功地分离得到大量的紫菜原生质体,其产率为3×106个原生质体/g新鲜紫菜组织。原生质体经初步培养发育成愈伤组织,其成活率为60%。     

紫菜原生质体的纯系培育、诱变处理和种间细胞融合的研究

紫菜是国内外养殖最多的重要经济海藻之一。1982年唐延林首次用酶法分离出紫菜体细胞和原生质体,并培养获得再生植株,随后在国内外相继开展了紫菜单细胞和原生质体的分离工作。在短短的几年里,紫菜的基础和应用研究均取得明显的进     

硫酸软骨素酶高产菌株的筛选、鉴定和发酵培养条件的研究

通过透明圈法从土样中初筛到2株产硫酸软骨素酶能力较高的菌株,经复筛,28号菌株产酶能力更强,对该菌株的形态特征和生理生化特性考察,初步鉴定为少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)。该菌株的发酵产酶条件研究表明,其产酶最适培养基组分为(%,w/v):酵母粉1.0,硫酸软骨素0.5,NaCl 0.5,KH2PO40.03,MgSO4.7H2O0.5,起始pH=8.5,其余为水。其最适产酶条件为:250mL三角瓶装液量40mL,1%(v/v)接种量,25℃,100r/min培养36h。在最适产酶培养条件下,菌株发酵液中硫酸软骨素酶的活力可达1.2U/mL。本研究筛选出产硫酸软骨素酶高的菌株,并为发酵法制备硫酸软骨素酶提供一定的实验依据。     

龙须菜(Gracilariopsis lemaneiformis)中两种分支酸代谢酶对温度和水杨酸的响应及其原核表达研究

龙须菜(Gracilariopsislemaneiformis)在我国主要用作鲍饵料和琼胶生产原料,但是南方夏季高温限制了龙须菜的栽培和产业化。抗逆植物激素水杨酸(salicylicacid,SA)与分支酸代谢之间存在着密切的联系。本文以两种分支酸代谢酶——异分支酸合成酶(isochorismate synthase,ICS)和分支酸变位酶(chorismatemutase,CM)为研究对象,分析了23℃(常温)和33℃(高温)条件下添加SA对龙须菜中两种分支酸代谢酶编码基因转录水平的影响。结果表明高温和SA不同程度地刺激了两种分支酸代谢酶转录水平的表达,如在3—12h,SA添加后ics表达量分别提高到常温对照组的2.84—4.76倍和高温对照组的1.25—1.62倍;在24h时,cm表达量分别提高到常温对照组的2.73倍和高温对照组的1.82倍。然后,我们将两种酶的编码基因分别转化到原核表达载体pET28a中,结果得到了多以包涵体形式大量表达的重组ICS和CM蛋白,其最佳诱导条件为0.1mmol/LIPTG在16℃诱导24h,并用镍柱初步纯化了重组蛋白。该研究为阐明温度和外源SA对龙须菜中两种分支酸代谢酶的影响规律,以及为从蛋白水平研究这两种代谢酶提供了资料。