中国对虾选育群体“黄海1号”和野生群体不同组织基因组DNA甲基化的MSAP分析

DNA甲基化在调节动物生长发育和组织分化中发挥了重要作用。本研究主要从酶切、预扩和选扩等方面优化了中国对虾DNA甲基化分析的MSAP技术,给出了适合中国对虾MSAP分析的最近反应程序和体系,并采用该技术分别对中国对虾选育群体"黄海1号"和野生群体的肌肉、鳃和血细胞三种组织基因组DNA的CCGG甲基化水平进行分析。研究结果表明,中国对虾野生群体肌肉、鳃和血细胞的DNA甲基化比例分别为23.1%、22.3%和19.7%,选育群体"黄海1号"肌肉、鳃和血液的甲基化比例分别为21.4%、19.6%和18.9%。鳃组织的DNA甲基化水平在两群体中差异极显著(P <0.01),肌肉间的甲基化水平差异显著(P <0.05),而血细胞中甲基化水平差异不显著(P >0.05)。中国对虾野生群体和"黄海1号"同一组织间的甲基化水平不同(P ≤ 0.05),而不同组织间的甲基化水平也各不相同(P ≤ 0.05)。DNA甲基化多态性分析表明,野生群体和选育群体"黄海1号"的鳃和血细胞组织的甲基化多态性比例变化明显,而肌肉组织甲基化水平较稳定,这些变化趋势与CCGG位点的甲基化和去甲基化有关。     

斑节对虾4个地理群体遗传多样性的AFLP分析

为研究斑节对虾(Penaeus monodon)4个地理群体的遗传背景,作者应用AFLP分子标记技术对非洲(F)、中国三亚(S)、泰国(T)和印度尼西亚(Y)的斑节对虾群体进行遗传多样性分析。选取8对引物组合对斑节对虾4个群体共128个个体进行分析比较,共获得1 000个位点,其中多态性位点数为830个,各群体多态位点比率为47.8%~58.5%;群体Nei’s遗传多样性指数为0.0917~0.1271,Shannon’s信息指数为0.1484~0.2032。4个群体间的遗传距离,Y与F之间最大,为0.331,T与S之间最小,为0.217。4个群体UPGMA聚类时,S、T与Y聚为一支,F为单独一支;128个个体的UPGMA聚类结果表明,F群体除4个个体外其余个体聚为一大支,S、T、Y群体的部分个体互相混杂。AMOVA分析发现,35.92%的变异来自于群体间,64.08%的变异来自于群体内,群体间的遗传分化系数为0.3592,表明4个群体间的遗传分化程度很大。本研究为斑节对虾遗传育种提供了种质遗传背景资料,并为斑节对虾资源的开发与利用提供基础数据。     

中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)“黄海1号”部分生长相关性状的QTL定位分析

在已构建好的中国对虾"黄海1号"F2代遗传连锁图谱上,使用WinQTLcart2.5软件进行复合区间作图定位,通过置换实验(1000次重复)确定连锁群显著性水平阈值。在对体重、各腹节长和尾节长8个性状的QTL定位分析中,共检测到29个QTL,其中与体重相关的QTL(BW1.2)、腹节1长相关的QTL(A1L2.1、A1L9.2、A1L17.3、A1L26.4)、腹节3长相关的QTL(A3L16.1)、腹节4长相关的QTL(A4L26.1)、腹节6长相关的QTL(A6L20.3)及尾节长相关的QTL(T3L17.3)等9个达到连锁群显著水平(P=0.05),对性状的贡献率为11.14%—23.60%,其中位于第16连锁群(LG16)上的与腹节3长相关的QTL(A3L16.1)的贡献率为23.60%,达到了极显著水平(P0.001),但它们的加性方向并不一样,除了与腹节1长相关的QTL(A1L2.1)和与腹节6长相关的QTL(A6L20.3)方向为负以外,其余7个主效QTL均呈正方向。本研究同时发现了与QTL紧密连锁的分子标记,如位于第1连锁群(LG1)上的分子标记D9f446、位于第17连锁群(LG17)上的M10f246、位于第26连锁群(LG26)上的SX18和位于第30连锁群(LG30)上的B2f260等,这些与QTL距离仅为0.01cM(厘摩)的分子标记,将为QTL精细定位提供参考。     

中国对虾“黄海1号”与野生群体F_1代生长发育规律比较

采用4种生长曲线模型对中国对虾"黄海1号"和野生群体F1代15项形态性状的生长规律进行了拟合,以三次函数模型的拟合优度(R2)最高;采用三次函数模型拟合的2个群体各形态性状的生长曲线、拐点月龄以及拐点体重(各形态性状长度)结果表明,中国对虾"黄海1号"的拐点月龄为2.87(拐点体重14.98 g),野生群体F1代的拐点月龄为4.05(拐点体重26.26 g);中国对虾"黄海1号"各形态性状的拐点月龄分布在0.51～3.07之间,达到最大生长速度的顺序分别为:头胸甲长>第1腹节宽>头胸甲高>腹1高>头胸甲宽>体长>全长>腹节5长>腹节3和4长>尾节长>腹节2长>腹节1长>腹节6长;野生群体F1代除第2腹节长的拐点月龄为0.45之外,其它性状的拐点月龄分布在2.38～3.08之间,达到最大生长速度的顺序分别为:腹节2长>腹节1长>腹节3长>腹节 4长>头胸甲高>腹节5长>头胸甲宽>全长>腹1高>腹1宽>尾节长＝头胸甲长＝体长> 腹节6长,除第1和第2腹节长2个性状外,野生群体F1代的其它性状均比中国对虾"黄海1号"发育迟缓了1个月左右.     

"黄海1号"中国对虾体长遗传力的估计

应用数量遗传学原理和全同胞组内相关法估计了"黄海1号"中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)孵化后3月龄和4月龄体长的遗传力.实验中的36尾亲虾均来自人工养殖的"黄海1号"第9代选育群体.通过人工授精技术,构建了9个半同胞家系和21个全同胞家系,分别测定了3月龄和4月龄时30尾后代个体的体长.利用SPSS软件的一般线性模型(GLM)过程,计算表型变量的方差组分,估计体长性状的遗传力.分析结果表明,"黄海1号"中国对虾3月龄和4月龄体长的狭义遗传力估计值分别在0.46～0.53和0.44～0.48之间.雌性遗传方差组分均显著大于雄性遗传方差组分(P<0.05),说明雌性遗传方差组分存在非加性效应或受环境影响较大.另外,雌性方差组分估计的遗传力由3月龄的0.53下降到4月龄的0.48,下降程度最大,说明雌性方差组分可能存在显著的母体效应.     

中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)人工选育群体不同世代的微卫星分析

采用微卫星DNA技术对中国对虾人工选育快速生长基础群体和4个连续世代共计100个个体进行了遗传分析。对8个基因位点进行了扩增，共得到71个等位基因。每个位点的等位基因数从6到16不等，其大小在159--600bp之间，P，C(Polymorphism Information Content)值为0．6628—0．9051，基因型数为17—67。5个世代群体的平均杂合度分别为0．7188、0．5687、0．6188、0．6438、0．66937。从F-检验的数据来看，配对比较Fst值表明5个世代群体间的遗传分化程度较弱。Fi值的计算结果表明，有5个群体位点杂合度处于过剩状态，但对整个群体而言，5个世代群体均表现为一定程度的杂合子缺失。通过计算每个位点的等位基因数(nα)、有效等位基因数(αe)、基因型数目(G)、最高频率等位基因的频率(F)，以及基于基因型的P值，比较了5个群体的遗传变化。另外，5个世代群体间的相似性系数以及彼此间的遗传距离，体现出人工选育群体间的遗传分化程度较低，说明5个世代群体间的遗传分化程度较低，还有较大的选育潜力，可以继续保持遗传响应。     

中国对虾选育群体与近交群体不同生长时期的生长性状和存活率的比较

对中国对虾"黄海2号"核心群进行全同胞兄妹交配构建近交一代群体,并以核心群的传代家系为对照群体,将2个对虾群体经荧光标记后进行80天的共同养殖测试,期间测量5个不同时间阶段的体重和存活率数据,研究选育群体和全同胞近交一代群体在不同养殖阶段的生长、存活及近交衰退情况。生长实验结果表明,除第10天养殖阶段外,选育群体在其它4个养殖阶段的体重均与全同胞近交一代群体存在显著差异(P0.05);在第30、50和80天,2个群体的特定生长率均呈现下降趋势,从整个养殖测试阶段来看,选育群体的特定生长率高于全同胞近交一代群体,二者分别为2.04、1.91;从各个养殖阶段来看,选育群体的体重变异系数范围为14.89%~24.80%,属于中等变异,说明选育群体依然具有较大的选育空间。在存活率方面,第30、50和80天养殖阶段,2个群体的存活率均存在显著差异(P0.05),且随着养殖时间的延长,选育群体与全同胞近交一代群体的平均存活率差异越来越大。近交衰退结果显示,全同胞近交一代生长性状的近交衰退系数范围为-5%~-14.49%,存活性状的近交衰退系数范围为-1.78%~-7.3%,在5个不同养殖阶段存活性状的近交衰退程度均低于生长性状。研究表明,对于经多代改良的中国对虾选育群体,全同胞兄妹交配一代产生的近交仍会造成不同养殖阶段的显著近交衰退,应该在育种过程中采取严格的近交控制策略来实现良种的选育。     

中国对虾(Fenneropenaeus chinensis) “黄海2号”人工感染WSSV的荧光定量分析

采用人工投喂的方法对人工选育的104个"黄海2号"中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)家系的5557尾个体[体重(2.1±0.7)g]进行WSSV感染实验,分别选取存活时间最长(342h)和存活时间最短(45h)的48尾个体,定义为抗病组和敏感组。用荧光定量PCR方法检测两组对虾体内WSSV含量,结果表明,抗病组和敏感组对虾体内WSSV含量范围分别为(2.64×104)—(3.13×106)和23.2—1.92×106copies/ngDNA,平均值分别为8.71×105和3.19×105copies/ng DNA,抗病组对虾WSSV含量显著高于敏感组(P<0.05),显示抗病组比敏感组具有更强的抗病性能。对感染测试的所有对虾的死亡情况进行统计分析,结果表明,其死亡曲线不符合数量性状的正态分布特征,提示中国对虾对WSSV的抗性可能由少数几个主基因决定。本研究可为揭示中国对虾抗WSSV性状的基因决定机制提供依据。     

凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）不同世代养殖群体的遗传多样性分析

采用微卫星位点对凡纳滨对虾的海南群体（进口亲虾繁育的第1世代：G1）、山东和饶平群体（G2）、湛江2和湛江3群体（G3）、湛江1和上海群体（G4）共4个世代7个养殖群体的遗传多样性进行了分析。从21对微卫星引物中筛选出12对有效扩增引物,对7个群体共280个个体进行扩增,得到10个多态位点,共获得等位基因数63个。各位点的等位基因数在2-15个之间,各群体的平均等位基因数在4．70—5．80之间。平均观测（期望）杂合度在0.36—0．43（0．53—0．65）之间。杂合子偏离指数（D）为负值,表明存在杂合子缺失现象。对7个群体、10个多态位点进行Hardy—Weinberng平衡检测,共有54个偏离平衡。对7个群体间的遗传分化水平进行检测,得到近交系数FIS在9个多态位点均为正值,两两群体间的固定指数FST值在0．149-O．375之间。FST显著性检验表明,各群体之间的遗传分化极显著（P〈0．01）。分子方差分析结果显示,大部分遗传变异（72．17％）来自于群体内,来自于群体间的遗传变异（27．83％）较小。凡纳滨对虾不同世代间遗传变异大,随着繁育世代的增加,遗传多样性降低。     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannanamei)不同世代养殖群体的遗传多样性分析

采用微卫星位点对凡纳滨对虾的海南群体(进口亲虾繁育的第1世代:G1)、山东和饶平群体(G2)、湛江2和湛江3群体(G3)、湛江1和上海群体(G4)共4个世代7个养殖群体的遗传多样性进行了分析.从21对微卫星引物中筛选出12对有效扩增引物,对7个群体共280个个体进行扩增,得到10个多态位点,共获得等位基因数63个.各位点的等位基因数在2-15个之间,各群体的平均等位基因数在4.70-5.80之间.平均观测(期望)杂合度在0.36-0.43(0.53-0.65)之间.杂合子偏离指数(D)为负值,表明存在杂合子缺失现象.对7个群体、10个多态位点进行Hardy-wleinberng平衡检测,共有54个偏离平衡.对7个群体间的遗传分化水平进行检测,得到近交系数FIS在9个多态位点均为正值,两两群体间的固定指数FST值在0.149-0.375之间.FST显著性检验表明,各群体之间的遗传分化极显著(P<0.01).分子方差分析结果显示,大部分遗传变异(72.17%)来自于群体内,来自于群体间的遗传变异(27.83%)较小.凡纳滨对虾不同世代间遗传变异大,随着繁育世代的增加,遗传多样性降低.     

cDNA-AFLP分析方法在中国对虾中的应用

将cDNA扩增片段长度多态性(cDNA-AFLP)分析方法在中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)中进行了应用,旨在建立1套适于中国对虾研究的cDNA-AFLP反应体系.对总RNA提取、cDNA双链合成、双酶切反应、连接反应、预扩增反应、选择性扩增反应和银染等步骤进行了优化和改进.结果表明,用EcoR Ⅰ/Mse Ⅰ双酶切、核心序列加3个选择性碱基的选择性扩增引物、1∶1摩尔比的EcoR Ⅰ端与Mse Ⅰ端选择性扩增引物比和12 μL选择性扩增体积,可得到十分稳定的结果,所得产物经电泳和银染后可获得条带清晰的图像.该方法的建立为cDNA-AFLP技术在中国对虾功能基因组研究中的应用奠定了基础.     

中国北方沿海6个栉孔扇贝群体的AFLP分析

利用4对AFLP引物首次对我国北方沿海主要的6个栉孔扇贝养殖区的自然采苗群体进行了遗传多样性分析,共扩增得到191条清晰带谱,其中175条具有多态性。对各群体进行遗传多样性分析,结果表明各群体均具有较高的遗传多样性水平,香农式多样性指数在0.347 4～0.391 7之间。AMOVA结果表明遗传变异主要来源于群体内,占总遗传变异的87.22%。个体聚类结果表明,烟台、长岛、大连3个群体的个体聚在一起,可看做1个群体;而荣成群体的个体单独聚在一起,具有独立的遗传结构;胶南和日照的一部分个体聚在一起,其他大部分各群体单独聚在一起;推测是海洋环境和人工养殖影响的共同结果。     

中国明对虾摄食后的特殊动力作用

采用耗氧量推算和能量收支推算方法,计算了中国明对虾的呼吸能量消耗,并计算了中国明对虾摄食配合饵料后的表观特殊动力作用（SDA）.体重范围为1.814～18.552g的中国明对虾摄食配合饵料后,24h内摄食1g 干饵料、1g蛋白质、1kJ能量所产生的SDA分别为7.492kJ、16.454kJ和0.383kJ,而体重范围为2.998～19.012g的中国明对虾在28d内利用能量收支方程计算的相应结果为8.570～11.153kJ、20.131～26.197kJ和0.446～0.580kJ.平均体重为1.53g的中国明对虾摄食鱼肉（FF）、虾肉（SF）、蛤肉（CF）、沙蚕（PW）、配合饲料（FD）和混合饲料（MD）后所产生的表观SDA占摄食能的比例分别为0.660,0.679,0.656,0.523,0.592,0.641,对不同饵料的SDA比例与转化效率的相关分析表明：饵料的转化效率与SDA比例负相关,即SDA比例越高的饵料分配到生长的能量比例越少.另外还对能量收支方法在SDA研究中的应用进行了探讨.     

中国对虾体内1株益生菌的筛选与初步鉴定

为给对虾专用益生菌制剂的研制与应用提供理论依据和基础数据,研究了从白斑病毒(WSSV) 耐过中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)肠道中分离的1株海洋细菌B12的益生特性和安全性,并结合形态观察、生理生化特征和16S rDNA序列分析对菌株B12进行了分类鉴定.结果表明:菌株B12能抑制对虾致病性哈维氏弧菌 (Vibrio harveyi)和副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)的生长,不分泌溶血素.对β-内酰胺类、头孢类、氨基糖苷类、喹诺酮类抗生素均敏感;对大环内酯类、四环素类抗生素均耐药;对糖肽类抗生素中度敏感.毒性试验表明菌株B12对中国对虾幼体没有明显毒副作用.该菌为革兰氏阴性可动杆菌,鞭毛极生,菌体大小为(0.5～0.6)×(1.1～1.2) μm,接触酶、氧化酶阳性,葡萄糖发酵产酸,能还原硝酸盐,产淀粉酶,不产明胶酶,不能利用丙二酸.16S rDNA的部分序列分析显示菌株B12与嗜盐单胞菌(Halomonas sp.)SB J85具有98.15%的相似性.形态观察、生理生化特征和16S rDNA序列分析证实B12为嗜盐单胞菌属(Halomonas sp.).     

橙色莫桑比克罗非鱼和荷那龙罗非鱼的AFLP分析

运用AFLP分子标记技术检测了橙色莫桑比克罗非鱼（Oreochromis mossambicus）和荷那龙罗非鱼（Oreochromis hornorum）的种群遗传多样性。提取2种鱼的基因组DNA,经EcoR Ⅰ和Mse Ⅰ限制性内切酶酶切并加接头,从16对选扩引物组合中选出3对扩增结果较好的引物进行PCR扩增。扩增产物经PAGE胶电泳、银染,检测其多态性。3对引物在2种罗非鱼的40个个体中共扩增出94条带,其中多态性条带76条,占总扩增条带的80．9％,2个群体的多态性条带比例分别为71．6％和52．4％。根据Nei氏（1978）统计分析得出橙色莫桑比克罗非鱼种群内遗传相似系数为0．765。荷那龙罗非鱼的为0,821,表明2个罗非鱼种群均具有较高的遗传多样性,橙色莫桑比克罗非鱼种群内遗传多样性相对更高些。2种罗非鱼的种间遗传距离为0．279,推测该杂交组合可能具有杂种优势。     

太空搭载卤虫诱变效应的AFLP分子标记检测

本文比较研究了经过太空诱变的卤虫(Artemia sinica)同地面对照组卤虫4对选择性扩增引物的AFLP指纹图谱,旨在探讨用AFLP技术进行诱变个体遗传差异检测的可行性.其遗传相似系数用Nei的计算方法进行计算,遗传距离则用Lynch的计算方法进行计算.实验共检测出384个位点,分子量在50～1 500bp之间,其中绝大多数片段为太空诱变组同地面对照组所共有,多态位点73个,占19.0%.遗传指纹图谱显示:经过太空诱变的群体与地面对照组相比,从整个基因组角度来看,其遗传差异并不明显,但是太空诱变组有2个个体的基因确实产生了较为显著的变异.研究结果表明:太空诱变能够不定向地促进基因的变异,是水产新品种选育的途径之一;AFLP技术不仅是各水产动物种质鉴别的有效手段,用于各种诱变个体的遗传差异研究也是适宜和可信的.     

青岛石老人海域石花菜遗传多样性分析

石花菜(Gelidiumamansii)是1种重要的大型经济海藻,本研究采用AFLP技术对青岛石老人海域石花菜的遗传结构进行了分析,7对引物组合共扩增出346个位点,多态性比例为47.8%。不同个体间的遗传距离分布范围在0.029~0.390之间。群体内Na(观测等位基因数)为1.504 3,Ne(有效等位基因数)为1.298 5,Nei's基因多样性指数为0.175 5,Shannon信息指数达到0.263 3。UPGMA聚类分析将30个个体分为2个大的类群,在一定程度上反映了石老人海域石花菜群体遗传多样性不高的现状。     

中国对虾家系幼体对氨氮和pH值的耐受性比较

采用人工授精技术建立中国对虾家系,对建立的20个家系幼体通过急性毒性试验进行抗氨氮和pH值性状的比较.结果表明:不同试验时间中国对虾家系对氨氮和pH值的耐受性差异极显著(P<0.01)和显著(P<0.05),24,48和72 h对氨氮耐受性的平均半数致死值分别为62.15,30.31和15.60 mg/L,对pH值耐受性的平均半数致死值分别为9.99,9.41和9.12.以平均LD50值为评价指标,综合24,48和72 h各家系对氨氮和pH的耐受性,最终筛选出对氨氮耐受性最强的家系8个,对pH值耐受性最强的家系10个,对氨氮和pH值耐受性均较强的家系7个,为构建中国对虾抗逆基础群体,开展中国对虾抗逆新品系的选育工作提供了基础.