三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)微卫星位点的分离和序列分析

采用磁珠富集法,利用生物素标记的(GT)15寡核苷酸探针从三疣梭子蟹基因组DNA的Sau3A1酶切的500-1000bp片段中筛选微卫星序列.洗脱的杂交片段克隆到PMD18-T载体上构建富集微卫星基因组文库后,通过PCR筛选检测出阳性克隆进行测序.在56条测序序列中有49条非冗余序列包含有重复次数不少于5次的微卫星位点,阳性序列比例达到87.5%.其中perfect类型微卫星最大的重复次数为47次.在47条非冗余序列中,共有40条(85.1%)微卫星重复序列两端有侧翼序列能够进行引物设计.本研究中筛选的微卫星位点将为下一步的三疣梭子蟹种群遗传结构分析、经济性状的QTL定位提供遗传标记.     

三疣梭子蟹肌肉乳化病的同工酶病理变化研究

采用垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(PAGE),对患有肌肉乳化病的三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)3种组织中10种同工酶及肌浆蛋白的酶谱表型进行分析,并就患病后酶谱变化特征及原因进行了讨论。证实在部分组织中,除SOD酶外9种酶及肌浆蛋白的酶带均出现明显的紊乱现象,表明病蟹的病理机制极可能与代谢异常有关,其特异性变化可以作为疾病早期诊断及病理分析的生化辅助指标。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)幼体不同干露温度下死亡率的研究

通过设置15℃、20℃、25℃、30℃4个干露温度梯度,检测不同发育阶段三疣梭子蟹幼体的露空时间、死亡率、含水量、失水率及体重消耗率等指标,分析干露温度、发育阶段与幼体死亡率的关系。结果表明,各发育阶段的幼体死亡率均随干露时间的增加而升高(P<0.05);不同温度条件下,Ⅰ期幼蟹(CⅠ)的含水量、失水率和体重消耗率均高于Ⅱ期幼蟹(CⅡ)(P<0.05);CⅡ20℃时的露空时间最长,为11h,半致死时间为7—8h;30℃时最短,为2h;CⅠ15℃时的露空时间最短,为0.5h;20℃时最长,为4h。相同温度下,幼体各发育阶段的耐干露能力为CⅡ>CⅠ>ZⅣ>ZⅢ=M。结果说明,温度≤15℃不利于幼体的存活,温度≥25℃干露耐受性降低。因此,20℃更有利于幼体获得长存活时间。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的保活参数优化及其代谢响应

为延长三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)在捕捞后的存活时间,在优化保活温度和充氧量的基础上,再采用基于核磁共振(NMR)的代谢组学技术,比较分析了三疣梭子蟹前鳃代谢谱在充氧和不充氧保活过程中的变化。结果发现, 12 ℃下的三疣梭子蟹存活率最高, 80%的三疣梭子蟹能存活3.5 d。加大充氧量能提高三疣梭子蟹的存活率, 3.6 L氧气可满足一只三疣梭子蟹成蟹存活到3 d以上。因此,保活三疣梭子蟹的适宜温度和充氧量分别是12 ℃和3.6 L。不充氧保活会导致三疣梭子蟹前鳃中乳酸、丙氨酸和葡萄糖等代谢物的快速积累,但充氧保活可抑制这些代谢物的变化,表明氧气通过缓解三疣梭子蟹前鳃的缺氧和渗透压失衡,从而有效延长三疣梭子蟹的存活时间。研究结果为三疣梭子蟹的保活运输提供可借鉴的方法和理论参考。     

三疣梭子蟹肌肉乳化病的病原及其致病性研究

为进一步搞清养殖梭子蟹肌肉乳化病的病原及其致病机理,找到有效的防治方法,2002-2004年在浙江省宁波、舟山等地养殖场,从濒死的梭子蟹体内分离出1205-11和1205-21两株菌。通过菌体形态、培养特性和生理生化反应,鉴定这2株菌分别为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和葡萄牙假丝酵母(Candida lusitaniae)。人工感染试验证实,这2株菌是梭子蟹肌肉乳化病的病原菌,葡萄牙假丝酵母为继发性感染病原,蟹体外部的损伤及蟹之间相互残伤可能是传染的主要途径。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)卵子发生、激活与早期卵裂的细胞学观察

采用连续切片和光镜技术,对三疣梭子蟹卵子发生、激活和早期卵裂进行了细胞学观察.结果表明,在发育及再发育的卵巢中,三疣梭子蟹卵子发生主要经历了卵原细胞的增殖和初级卵母细胞的分化、生长、成熟这两个阶段.依据卵子发生过程中雌性生殖细胞形态的变化,这两个阶段又可细分为卵原细胞期、卵黄发生前卵母细胞期、小生长期、大生长期、近成熟卵母细胞期和成熟卵母细胞期等6期.成熟卵母细胞处于第一次减数分裂中期,这可作为卵子成熟的形态学标志.第一次减数分裂中期纺缍体长轴的旋转可以发生于卵巢中,与精子及海水的刺激无关.初级卵母细胞达到形态和生理上都成熟的时间窗口很窄.精子入卵引起卵子的激活和减数分裂的完成.23℃下离体培养时,第一和第二极体分别在卵产出后约40min和2h释放.雄原核的形成早于雌原核.雌、雄原核在卵产出后约5h通过联合形成合子核.卵产出后约6h,受精卵处于第一次核分裂后期,但卵裂沟直到卵产出后13h才能观察到,此时核已完成了2次分裂,形成合胞体胚胎.     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)冻藏过程中肌肉蛋白质生化特性的变化

以三疣梭子蟹肌肉基本营养成分、蛋白质组成、肌原纤维蛋白含量、Ca~(2+)-ATPase活性、总巯基含量、二硫键含量以及肌原纤维蛋白的SDS-PAGE分析作为指标,研究了三疣梭子蟹在不同冻藏温度下肌肉蛋白质生化特征的变化。结果表明,三疣梭子蟹是典型的高蛋白食品;随着冻藏时间的延长,水溶性蛋白含量先增加后减少,盐溶性蛋白和不溶性蛋白含量逐渐减少,碱溶性蛋白含量逐渐增加;肌原纤维蛋白含量、Ca~(2+)-ATPase活性、总巯基含量随着冻藏时间的延长,均呈现下降趋势,而二硫键含量则呈上升趋势,且–20℃和–40℃两组之间差异显著(P0.05)。SDS-PAGE分析结果表明,组成肌原纤维蛋白的各种蛋白质均有不同程度降解,且–20℃比–40℃组降解更明显。因此,–40℃冻藏对梭子蟹肌肉蛋白质生化特性的影响较小。     

基于优化模型的莱州湾三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)栖息地适宜性研究

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是莱州湾最重要的经济蟹类,其资源丰度受栖息环境影响显著,为了解不同的环境因子对其栖息地分布的影响,根据2010~2020年夏季底拖网调查数据,研究莱州湾三疣梭子蟹栖息地适宜性及其影响因子。利用广义可加模型(generalized additive models,GAM)选取变量因子,通过提升回归树模型(boosting regression tree,BRT)对因子进行权重分析,构建了4种栖息地适宜性指数(habitat suitability index,HSI)模型,并通过实测值和预测值的Pearson检验,对模型比较和验证。结果表明,GAM和BRT优化的HSI模型好于其他3种模型(未优化模型,GAM优化HSI模型,BRT优化HSI模型),以生物量表征资源丰度的模型好于尾数表征资源丰度的模型,算术平均法构建的HSI模型的整体预测准确率和相关系数高于几何平均法,对莱州湾三疣梭子蟹栖息地有较强的预测能力。底层水温、底层盐度和水深对三疣梭子蟹栖息地影响较大,夏季栖息地适宜性较高的海域(HSI>0.7)主要分布在莱州湾南部、东南部和东北部海域,中部和西南部海域分布较少。研究结果为莱州湾三疣梭子蟹增殖放流工作提供了科学依据。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)肝胰腺内源酶性质的初步研究

内源酶是三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)体内重要的酶,往往会导致梭子蟹死后肌肉组织迅速软化,严重影响了蟹肉的贮藏品质。为了探明该酶的基本特性,本试验从三疣梭子蟹肝胰腺中提取了粗酶,优化了提取方法,并对其部分酶学性质进行初步研究。结果表明:三疣梭子蟹肝胰腺内源酶最佳浸提时间段为4～12 h,酶比活显著高于0～4 h和12～14 h;以酪蛋白为水解底物,内源酶作用最适温度为65℃、最适p H范围为7.0～8.0;丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂,包括大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)和苯甲基磺酰氟(PMSF),对内源酶活力的相对抑制率分别为100%、70.46%±6.27%,显著高于其他抑制剂的相对抑制率,推测丝氨酸蛋白酶为主要内源酶;在硫酸铵分级沉淀中,分别以酪蛋白和Boc-Phe-Ser-Arg-MCA为底物,前者最适盐析浓度为0～70%,后者为30%～70%,酶比活显著高于其他盐浓度;当硫酸铵浓度为40%～60%时,盐析蛋白质含量、粗酶酶活和丝氨酸蛋白酶活均显著高于其他盐浓度。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)半乳糖凝集素PtGAL的基因克隆与原核重组表达

半乳糖凝集素(Galectin)是动物凝集素家族的一员,在脊椎动物和无脊椎动物中都参与了重要的免疫防御反应,是一种重要的免疫因子。通过RT-PCR和RACE技术克隆获得了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)半乳糖凝集素基因全长,并命名为PtGal。该基因全长875bp,开放阅读框为669bp,编码222个氨基酸,包含一个糖识别结构域CRD(位于16—142位氨基酸),预测蛋白的分子量(Mw)为23529.4Da,理论等电点(p I)为5.21。同源性比对结果显示,PtGal编码的氨基酸序列与中华绒螯蟹、南美白对虾、日本囊对虾galectin的同源性分别为77%、66%、58%。实时荧光定量PCR(qRT-RCR)结果表明,PtGal在三疣梭子蟹肝胰腺、肌肉、肠、胃、鳃、心脏、性腺中都有表达,其中在性腺中的表达量最高,在肝胰腺中的表达量最低,但人工感染溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)后,肝胰腺的表达呈先升高后降低的趋势。利用原核表达系统对三疣梭子蟹PtGal进行了重组表达,并通过纯化复性获得了重组目的蛋白rPtGal,ELISA检测rPtGal与不同细菌及真菌的结合活性,结果表明,该重组蛋白与革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌均有较强的结合。本研究为进一步深入研究三疣梭子蟹半乳糖凝集素的功能奠定了基础。     

三疣梭子蟹(portunus trituberculatus)不同地理种群内自繁和种群间杂交子一代生长性状的比较

采用不同地理种群体内自繁和种群间杂交的方法,进行了自繁和杂交子一代生长性状的比较研究.结果表明,80日龄时的杂交子一代在各项指标都表现出一定的杂种优势(0.24%-13.50%),LS在这5个性状中都高于zL.100日龄时杂交子一代表现出的杂种优势有所下降,杂种优势率在-0.88%-4.13%之间,甲长表现出杂种劣势.120日龄时杂交子一代的杂种优势范围为-1.91%-4.37%,甲长、甲宽表现出杂种劣势.可见不同杂交组合、不同性状、不同时间表现出的杂种优势有显著差异.AN0vA分析表明:80日龄、100日龄、120日龄时,5个生长性状在群体之间存在极显著差异.实验结果表明:三疣梭子蟹4个杂交子一代在生长性状上存在一定程度的杂种优势,可见种内群体间杂交是培育三疣梭子蟹优良新品系的重要方法之一.     

三疣梭子蟹全人工工厂化育苗技术

2000年笔者在日照市水产研究所利用1450m^3水进行梭子蟹全人工工厂化育苗生产，共出Ⅱ-Ⅲ期幼蟹512．7万只，创造了出苗量为3500只／m^3，总产值为150多万元的直接经济效益，同时对幼体培育的密度进行了初步试验，结果表明：从Z1至M期幼体培育密度10－15万／m^3为宜，M期以后密度以0．8－1．5万／m^3为宜。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)幼蟹饲料中胆固醇的适宜添加量研究

采用单因素实验设计方法, 以初始体重为20g左右的三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)幼蟹为实验对象, 胆固醇添加量为0.003%、0.3339%、0.655%、0.986%、1.303%和1.628%的实验饲料投喂8周, 研究其胆固醇需求量。结果表明, 饲料中添加0.003%—1.628%胆固醇对各处理组的存 活率无显著性影响(P>0.05)。随饲料胆固醇水平的上升, 三疣梭子蟹幼蟹的增重率呈先上升后下降的趋势, 当饲料胆固醇水平≥0.655%时, 三疣梭子蟹幼蟹的增重率呈下降趋势。折线模型表明, 饲料中胆固醇添加量为0.6%时, 三疣梭子蟹幼蟹的增重率、性腺指数和壳宽增加达到最高值。根据增重率折线模型结果, 作者认为三疣梭子蟹幼蟹饲料中添加0.6%左右胆固醇较为适宜     

THE GENETIC DIVERSITY AND PHYLOGENETICANALYS OF ITS1 IN MITOCHONDRIAL DNA OF FOUR POPULATIONS OF PORTUNUS TRITUBERCULATUS

对我国沿海4个野生群体三疣梭子蟹的核糖体RNA转录单元内间隔区ITS1基因片段进行克隆和测序,获得长度为515—571bp的ITS1核苷酸序列,在4个群体的三疣梭子蟹中共检测到变异位点56个,多态位点比例为9．5％,其中简约信息位点25个,共检测到40种单倍型。通过统计单倍型多态性、平均核苷酸差异数和核苷酸多样性指数,结果显示：舟山群体多样性指数最高,其次是鸭绿江口群体和海洲湾群体,莱州湾群体最低。在三疣梭子蟹ITSl序列中共发现5种微卫星位点,AMOVA分析结果显示4个群体间的遗传差异显著。另外,将本研究所得序列结合GenBank数据库中十足目12种蟹ITSl序列构建系统进化树,系统树显示同属的不同种各自聚支,与形态学分类吻合。     

三疣梭子蟹雌雄隔离养殖技术研究

在193亩池塘中开展三疣梭子蟹雌雄分养和雌雄混养对比试验。其中雌雄分养面积93亩，亩产商品蟹182公斤，平均壳宽12．6厘米，平均个体重230．1克，成活率40．2％。与雌雄混养相比，亩产量提高了53．6％，成活率提高了1.51倍。专家鉴定认为，梭子蟹雌雄分养，方式新颖，效果明显，技术水平属国内先进。     

三疣梭子蟹对饵料鱼和蛤摄食参数的研究

研究体重为(9.20±1.50)g的三疣梭子蟹在分别投喂饵料鱼和兰蛤及有无沙底质条件下的昼夜摄食节律、摄食率和昼夜摄食量的差异.结果表明:投喂兰蛤组的三疣梭子蟹摄食高峰在20:00左右,投喂饵料鱼组三疣梭子蟹的摄食高峰在02:00左右;沙底质条件下三疣梭子蟹的夜晚摄食量占全天摄食量的94.34%,而无底质组为75%,表明在潜底环境条件下三疣梭子蟹具有更明显的昼夜摄食节律;投喂兰蛤组三疣梭子蟹黑夜摄食量比值显著高于白天,分别为75%和25%,而投喂鱼组黑夜摄食量比值仅略高于白天,分别为59.21%和40.79%.此外,投喂鱼组白昼摄食率可达80%,显著高于投喂兰蛤组的10%,表明投喂鱼饵料有利于三疣梭子蟹的白昼进食.根据昼夜摄食量对比分析,建议采用白昼投喂占总投喂量20%～30%的鱼肉以降低蜕皮残食,夜晚投喂70%～80%的兰蛤的投喂策略促其生长,并减少梭子蟹的残食.     

三疣梭子蟹ftz-f1 基因的克隆及相关核受体基因在蜕皮中的功能分析

采用RACE 技术克隆三疣梭子蟹核受体fzt-f1 基因, 全长cDNA 序列1763bp.该基因3'和 5'非编码区分别为1034bp 和141bp, 开放阅读框为588bp, 推测编码195 个氨基酸, 预测分子量为 22.8kDa, 理论等电点为6.35, 命名为PTNHr 基因。同源性和系统进化分析表明, 三疣梭子蟹fzt-f1 基因与刀额新对虾同源性高达75.4%, 并且与刀额新对虾聚为一支。对核受体基因fzt-f1、EcR 和RXR 在蜕皮周期中的表达情况进行实时荧光定量PCR 分析, 结果表明, 三个核受体基因在不同蜕皮时期, 均出现表达差异, 说明这三个基因都参与蜕皮调控过程。其中, fzt-f1 和RXR 基因在不同蜕皮时期的 表达模式上出现相反的表达特征, 预测这两个基因存在相互抑制的调节关系。EcR 和RXR 基因在不 同蜕皮时期的表达模式上出现部分相似的表达特征。     

不同环境因素对三疣梭子蟹“科甬1号”(Portunus trituberculatus)仔蟹蜕壳的影响

为探究三疣梭子蟹"科甬1号"仔蟹最佳蜕壳环境条件,先采用单因素变量实验设计方法,选取温度、盐度、光照时长、p H和底质五种环境因素,分析其对"科甬1号"仔蟹蜕壳的影响。温度组设置17、20、23和26°C,盐度组设置10、15、25和35,光照时长设置0、12和24h光照组,p H组设置6.0、7.5、8.0、8.5和10.0,底质设置有沙和无沙组。实验结果表明,温度组20°C时仔蟹存活率和蜕壳率最高,但蜕壳所需时间最长,26°C时蜕壳起始最早,所需时间最短,但存活率较低;盐度组中,15和25仔蟹存活率和蜕壳率最高;p H组中,7.5、8.0和8.5仔蟹存活率和蜕壳率最高;有沙组仔蟹存活率显著高于无沙组;而光照时长实验组结果差异不显著(P0.05)。综上所述,得到单因素条件下"科甬1号"仔蟹最佳环境条件:温度20—23°C、盐度15—25、正常日周期光照、p H 7.5—8.5,有沙环境中。利用正交设计实验方法,研究温度、盐度、底质3个因素对"科甬1号"仔蟹蜕壳的影响,并构建多元线性回归模型。结果得到"科甬1号"仔蟹最佳环境条件:温度26°C、盐度25,需要有沙环境,并且拟合得到其日存活率线性回归模型以及日蜕壳率线性回归模型。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)4个野生群体ITS1序列分析及系统进化分析

对我国沿海4个野生群体三疣梭子蟹的核糖体RNA转录单元内间隔区ITS1基因片段进行克隆和测序,获得长度为515—571bp的ITS1核苷酸序列,在4个群体的三疣梭子蟹中共检测到变异位点56个,多态位点比例为9.5%,其中简约信息位点25个,共检测到40种单倍型。通过统计单倍型多态性、平均核苷酸差异数和核苷酸多样性指数,结果显示:舟山群体多样性指数最高,其次是鸭绿江口群体和海洲湾群体,莱州湾群体最低。在三疣梭子蟹ITS1序列中共发现5种微卫星位点,AMOVA分析结果显示4个群体间的遗传差异显著。另外,将本研究所得序列结合GenBank数据库中十足目12种蟹ITS1序列构建系统进化树,系统树显示同属的不同种各自聚支,与形态学分类吻合。     

海水硬骨鱼白点病组织病理学研究

在光镜水平下研究了刺激隐核虫寄生黄鳍鲷和真鲷后引起宿主组织病理学的变化。该寄生虫可在宿主皮肤、鳃上皮和舌上皮的组织内寄生。与正常组织相比,被寄生的皮肤表皮层明显增厚、粗糙,其增厚部分主要是粘液细胞层、表皮层与真皮层间的联系被破坏。寄生囊内有较大的空隙。虫体内含有大量的宿主细胞残骸。由于寄生虫的感染,使得非寄生部位的脏器也出现某些病理变化:肝细胞萎缩,窦状隙增大;脾肾内都有颗粒性沉积。本研究结果还与淡水“白点”病引起的病理组织学变化进行了比较。