雨生红球藻和虾青素研究述评

虾青系作为食品和饲料色素添加剂有着广阔的应用前景,单细胞绿藻雨生红球藻在特定条件下可双大量积累虾青素,有可能成为该色素的良好天然资源,受到微藻学界的重视。但目前雨生红球藻培养还处于实验室阶段,大规模生产尚存在许多问题有待解决,我国这方面的研究处于起步阶段。为此通过微机查阅１９８１￣１９９７年的国内外发表的有关文献,结合我们的实验结果,从该藻的基础生物学特性、虾青素累积的机制、养殖现状进行了综述,并     

利用雨生红球藻生产虾青素的研究进展

作为天然虾青素的最佳生物来源，雨生红球藻已成为近年来国内外微藻研究的热点之一．本文综述了国内外雨生红球藻培养及虾青素积累的研究进展，介绍了国外天然虾青素商业生产的现状，并对现存的主要问题和发展方向做出阐述，以期推动国内利用雨生红球藻生产虾青素的商业化进程。     

雨生红球藻β-胡萝卜素酮化酶基因克隆、分析及叶绿体表达载体构建

β-胡萝卜素酮化酶(BKT)是雨生红球藻虾青素合成途径中的关键酶。根据GenBank中所收录的雨生红球藻BKT的cDNA序列设计特异性引物,以高光照处理的雨生红球藻细胞的总RNA为模板,采用RT-PCR的方法克隆出了β-胡萝卜素酮化酶基因(bkt)。序列测定结果表明,bkt全长960bp编码320个氨基酸。克隆的bkt序列与GenBank收录的BKT的cDNA(AY603347)序列只相差一个碱基。并对其编码的氨基酸进行了二级结构的预测和疏水性分析。同时将所克隆的bkt构建入衣藻叶绿体表达载体p64Dbkt,为基因的进一步表达研究及探索其作用机制奠定了基础。     

雨生红球藻八氢番茄红素脱氢酶pds基因上游序列的分离和分析

在某些蓝藻、绿藻和高等植物中,八氢番茄红素脱氢酶是β-胡萝卜素合成过程中的一个关键酶之一,应用巢式PCR方法从雨生红球藻中克隆了八氢番茄红素脱氢酶基因约1kb的5’上游序列。通过生物信息学方法进行序列分析,发现pds基因上游序列中包含了一些可能的顺式元件,如ABRE调控元件、C-repeat/DRE调控元件等。同时,构建了由pds-启动子控制报告基因的重组载体,并转化到雨生红球藻细胞中,进行了报告基因瞬间表达的检测。结果表明,克隆的pds启动子区域具有启动子活性,可以驱使报告基因进行瞬间表达。     

雨生红球藻虾青素积累机制的研究进展

虾青素(astaxanthin)是一种具有极强抗氧化活性的类胡萝卜素,超强的抗氧化活性赋予了虾青素突出的生理功能,如提高动物免疫力、抑制肿瘤、清除自由基和活性氧等。虾青素具有广泛的应用价值,不仅可以用作水产养殖的饵料添加剂、人的食品添加剂,在药品、化妆品和高级营养保健品等     

雨生红球藻β-胡萝卜素酮化酶基因的cDNA和基因组DNA克隆及序列分析

根据已知的β-胡萝卜素酮化酶(β-carotene ketolase,BKT)的cDNA序列设计引物,利用长距离PCR扩增获得了bkt基因的cDNA完整编码片段及基因组DNA片段,并对这些片断进行了序列测定。cDNA和基因组DNA比对结果表明该基因至少包括5个内含子,它们的剪切位点皆符合GU-AG规律。在比对结果中同时还发现一个19bp的短序列重复,该重复序列在bkt的cDNA和基因组DNA上都发生了多次重复,推测在BKT的表达调控中可能具有一定功能。另外,在序列比对过程中还发现本实验所获得的cDNA和基因组DNA序列与前人报道的cDNA序列之间都存在多处单碱基差异和19bp的短序列差异。     

温度对雨生红球藻叶绿素荧光特性及虾青素含量的影响

研究了不同温度(5～35℃)对雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)叶绿素荧光特性及虾青素含量的影响.测定的主要参数有:PSII的最大光能转化效率(Fv/Fm)、PSII的潜在活性(Fv/Fo)、PSII的实际光能转化效率(ΦPSⅡ)、光合电子传递效率(ETR)、细胞密度、叶绿素相对含量以及虾青素含量.单因子方差分析结果表明:在整个培养周期中,温度对雨生红球藻各叶绿素荧光参数、叶绿素相对含量、细胞密度以及虾青素含量均有显著影响(P<0.05).多重比较结果表明,在本实验条件下,雨生红球藻的最适生长温度是20℃,其单位体积虾青素含量以20℃处理组为最高,而单个细胞中的虾青素含量则以5℃和30℃为最高.相关性分析结果表明:培养天数为3～10天时,叶绿素相对含量与细胞密度均成显著正相关关系.本文还初步探讨了叶绿素荧光技术在筛选耐高温或耐低温微藻品系中的应用.     

不同碳氮浓度对雨生红球藻生长及虾青素累积的影响

研究了不同二氧化碳浓度和硝酸钾浓度对雨生红球藻生长及虾青素累积的影响。结果表明,较高浓度的CO2(600×10-6)能够显著促进雨生红球藻的生长、光合作用的进行和虾青素的累积。红球藻单个细胞内的虾青素含量随着培养液中硝酸钾浓度的降低而增加,绿色游动藻种和绿色不动藻种培养12 d后获得的最大虾青素值分别为10.93 pg/个和12.64 pg/个。连续通气是促进雨生红球藻生长及虾青素累积的一种有效碳源提供方式。     

α-酮戊二酸及其钠盐对雨生红球藻生长和虾青素积累的促进作用

雨生红球藻是已知虾青素(astaxanthin, AST)含量最高的生物,是理想的细胞制备工厂。尽管研究表明添加α-酮戊二酸(OG,α-oxoglutarate)能有效促进混养条件下雨生红球藻AST积累,但在自养条件下是否也有类似效果不清楚。研究以自养雨生红球藻为对象,在正常(CK)、高光(HL)、缺氮(DN)和高光-缺氮双重逆境(HL-DN)下从细胞生长和AST积累两方面评估OG及其钠盐(OG-2Na)的促进作用。结果显示,添加OG或OG-2Na显著缓解HL、DN和HL-DN胁迫对细胞生长的抑制作用,培养至6 d的生物量分别为0.58、0.53和0.38 g/L,约是未添加组的2.0倍。添加OG或OG-2Na显著促进AST积累。培养至6 d,在HL、DN和HL-DN下, AST含量分别达到13.62、19.51和28.29 mg/g,是未添加组的2.39、1.16和1.35倍。同时在胁迫条件下,添加OG或OG-2Na有效提高单位细胞中AST含量。针对OG和OG-2Na添加,最大单位细胞AST含量分别出现在HL和HL-DN条件下,达到53.72和60.58 pg/cell,是对照的3....     

藻际可培养细菌对雨生红球藻生长和虾青素积累的影响

为探究雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)藻际可培养细菌多样性及可培养细菌对雨生红球藻生长和虾青素积累的影响,本实验采用培养分离法,在乙酸钠兼养条件下,共分离到8株雨生红球藻藻际细菌,通过16S rDNA测序鉴定,并在NCBI网站比较序列发现,编号为DBQ、HS、BTH、DBB、XBL、HB、FH、JH的菌株分别与Pseudomonas sp.、Methylobacterium sp.、Chryseobacterium sp.、Bacillus sp.、Paracoccus sp.、Planctopirus hydrillae、Rhodobacter vinaykumarii、Brevundimonas vesicularis的16S rDNA序列具有最高的相似性。分别将8株细菌与通过抗生素处理获得的纯种雨生红球藻共培养,测定了8株藻际细菌对雨生红球藻细胞密度、藻液pH、叶绿素及虾青素含量的影响。实验发现,HS处理组在绿色阶段培养第9天获得最高细胞密度,为3.65×10~5cells/mL,且显著高于对照组;DBB处理组虽然能够促进藻细胞密度增加,但与对照组并无显著差异;DBQ处理组藻细胞密度显著低于对照组及其他处理组。第1～7天,藻液叶绿素浓度的变化与藻细胞密度变化趋势有一定相似性,绿色阶段后期,叶绿素浓度呈现下降趋势,也说明藻细胞内部叶绿素向其他色素转变,同时标志着绿色阶段的结束。绿色阶段培养过程中,藻液pH变化幅度较大,由初始值7.0左右上升到9.30左右,但是培养后期处理组与对照组藻液pH并无显著差异。在测定藻液虾青素含量时,仅HS处理组虾青素含量略高于对照组,但并无显著差异;通过计算单个藻细胞虾青素含量发现DBQ处理组单个藻细胞虾青素含量显著高于对照组。     

稀土元素Ce对雨生红球藻生长及虾青素积累影响的研究

采用反相高效液相色谱分析法（RP-HPLC）研究了稀土元素铈（Ce^3＋）对雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）生长及虾青素积累的影响。结果表明,低质量浓度的Ce^3＋对微藻生长和虾青素积累均具有明显的促进作用,当Ce^3＋的质量浓度为0．1mgm时,对藻生长的促进效果最佳,细胞密度较对照组提高34％;当Ce^3＋的质量浓度为1mg/L时,虾青素质量分数可达到细胞干质量的3．2％,较对照组提高167％。此外,高质量浓度Ce^3＋的对雨生红球藻有抑制作用,当Ce^3＋的质量浓度高于40mgm时,红球藻的生长完全被抑制,虾青素质量分数也明显降低。     

LED灯的光照对雨生红球藻细胞生长及虾青素积累的影响

为提高雨生红球藻的生物量以及细胞内虾青素的积累量,通过不同光源、不同光照强度照射培养藻细胞。研究表明,在总光强为2500lx,红光与白光的强度比例为2:1时,雨生红球藻干重可以达到0.98g/L,比单独使用白光和红光照射下分别提高了36.11%和15.91%。在雨生红球藻转化产虾青素阶段,对比蓝光LED、目光灯以及两者的组合光源照射转化的结果,发现在总光强为7000lx,蓝光与白光的强度比例为3:1时,雨生红球藻中虾青素的积累量为39.79mg/L,明显高于单独使用白光与蓝光转化下的产量。     

不同有机溶剂对雨生红球藻中虾青素提取成分的影响

研究了有机溶剂提取雨生红球藻中虾青素过程中,不同液料比对提取效率的影响,并以分光光度法及高效液相色谱法(HPLC),检测了不同有机溶剂对提取组分及主要组分(叶绿素和虾青素)含量的影响.结果显示,提取率随着液料比的增加而上升,当液料比大于20:1时,其升高变缓,趋于平衡;不同有机溶剂提取物的化学组分无明显差异,但各组分含量的比例差异较大,如二氯甲烷提取物在480nm下吸光度为30.64±0.54,高于丙酮、乙酸乙酯及甲醇(分别为27.68±5.54、25.32±8.43及24.31±0.79),而645和663 nm下吸光度为2.54±0.46和5.33±0.19,较丙酮、三氯甲烷、无水乙醇及甲醇(分别为5.70±0.71、12.87±0.14、7.60±0.23及6.44±0.28)低,说明该种溶剂对于虾青素有较高的提取效率,但其挥发性强且毒性大,而无水乙醇的提取率略低于二氯甲烷,具有安全、低毒的优势,因此无水乙醇是较为合适的虾青素提取溶剂.     

雨生红球藻细胞转化、虾青素积累与光照强度的关系及不同品系间的差异性

于2004年利用3个品系的雨生红球藻(H0、H2和H3)和以去除营养物质的藻液为实验对象,探讨了光强对细胞转化和虾青素积累的影响。结果表明,光照强度对红球藻虾青素积累和细胞转化有显著影响,并在品系间存在一定差异性。其中:品系H0在光强≤25000lx时虾青素积累量随光强的增加而增加,光强在20000～35000lx时虾青素积累量处于较高水平,而光照强度>35000lx时,虾青素积累量随光强的升高而下降;H2品系在光强≤25000lx时虾青素积累量随光强的增加而增加,光强在25000lx左右时虾青素积累量较高,当光强≥35000lx时,虾青素积累大幅度下降;H3品系在≤35000lx时虾青素积累量随光强的升高而增加,20000~45000lx为虾青素积累较适宜的光强,高于45000lx时虾青素积累量则明显下降。进一步分析得出,弱光导致红球藻虾青素含量较低是光照强度不足、细胞内虾青素含量少的结果,而强光下虾青素含量下降则是细胞受到损伤、细胞数量减少导致的。对比研究发现:在较低光强下(20000~25000lx)H2单个细胞内虾青素积累量略低于H0,但其积累虾青素总量却最高,这是由于此时H2不动细胞增长速率比其它品系高造成的,不过适宜H2积累虾青素的光照范围最窄,它对高光强的耐受性也最差;而H3在较低光强下虾青素积累总量及单个细胞内的积累速率均最低,但是它的适宜光照范围最宽,即对高光强的耐受性最强,在较大的光强波动范围内都可以保证较高的安全转化量,这就使得它在较高的光强下虽然单个细胞积累虾青素的速率仍然最低,积累总量反而显著高于其它两个品系。     

雨生红球藻脂肪酸组成和含量的气相色谱分析

以正十九碳酸(C19：0)为内标,用HCI-CH3OH溶液提酯化雨生红球藻后进行毛细管气相色谱分析。通过正交实验确定抽提和酯化雨生红球藻脂肪酸的最佳酯化酸度、超声破碎时间和水浴时间。该法对雨生红球藻游动细胞脂肪酸含量测定的相对偏差为0．4％～9．5％;对雨生红球藻孢子为3．0％～11．8％。仪器的检测限为0．942μg。结果表明,雨生红球藻绿色游动细胞的饱和脂肪酸组分主要是C16：0,含量为2．22％;不饱和脂肪酸主要有C16：1,C18：2,C18：1和C18：3,含量在0.764％～3．28％。雨生红球藻孢子中的饱和脂肪酸主要有C16：0和C18：0,含量分别为4．34％和0．477％;不饱和脂肪酸主要为C16：1,C18：2,C18：1和C18：3;含量在0．901％～8．20％。     

雨生红球藻cDNA表达文库的构建与初步分析

为了筛选雨生红球藻虾青素合成过程中的关键酶基因的反式调节因子基因,以雨生红球藻的绿细胞为材料,提取了高质量的总RNA,并分离纯化了mRNA,经过反转录后的得到cDNA,构建了以λ-ZAPExpress为载体的表达型cDNA文库。经检测,所构建的文库的滴度为5.1×105,重组率为100%。用PCR方法对文库的质量进行了鉴定,文库的平均插入片断的大小为1.7kb。雨生红球藻cDNA表达文库的构建为研究虾青素的代谢工程奠定了基础。     

IPP异构酶基因遗传转化对雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)虾青素含量的影响

采用RT-PCR技术, 从雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)中克隆出IPP异构酶基因(ipiHp1), 构建双元载体pCAMBIA3300-egfp-ipiHp1和基因枪转化载体pBlueScript SKⅡ-bar-egfp-ipiHp1, 利用根癌农杆菌侵染法和基因枪转化法, 将目的基因导入雨生红球藻中, 经过含50?g/mL草丁膦BBM培养基筛选得到阳性转化子。通过荧光观察报告基因egfp和PCR扩增分析, 证明ipiHp1基因整合到转化子的基因组中。生物量测定结果表明大部分转化子的生物量与野生型相似。虾青素含量测定发现, 农杆菌侵染法转化的转化子A3虾青素含量与野生型相比有显著变化, 平均值达到16.49mg/g, 与野生型相比提高了5.16%, 而基因枪转化法转化的转化子虾青素含量与野生型无显著性差异。     

玉米素和水杨酸对雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)生长及虾青素积累的影响

虾青素是一种具有强抗氧化活性的类胡萝卜素,而雨生红球藻是天然虾青素的主要来源。本文以雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)为材料,研究了植物激素玉米素和水杨酸对雨生红球藻的生长、虾青素含量及相关基因表达的影响。分别添加5种浓度的玉米素或水杨酸,结果发现0.05mg/L玉米素或25mg/L水杨酸处理5d后雨生红球藻虾青素积累最多。该浓度玉米素或水杨酸可显著提高光胁迫下藻细胞密度,最高分别达到3.4×10~5cell/mL和3.0×10~5cell/mL;同时玉米素与水杨酸组中虾青素含量显著上升,分别为1.7%和1.6%,比对照组分别增加29.2%和25.6%。玉米素缓解了高光逆境条件下光合作用基因——Rubisco大亚基(rbcL)及其活化酶(rca)、碳酸酐酶(ca)的下调表达,但对虾青素合成途径β-胡萝卜素酮化酶基因(bkt)的表达量没有显著影响;而水杨酸则相反,在胁迫后期不能缓解光合作用相关基因的下调表达,但可使bkt基因显著上调,最高可达对照组的2.5倍。本研究首次比较了玉米素和水杨酸对雨生红球藻生长和虾青素积累的影响,发现玉米素比水杨酸具有更好的促进雨生红球藻中虾青素积累的效果。     

不同激素配伍对雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)细胞生长和虾青素累积的调节作用、藻株差异及应用

利用生长素(NAA、3-IBA)和细胞分裂素(6-BA、kt)两类植物激素,对比研究了其不同配伍对4株雨生红球藻H0、H2、H3和H4细胞生长以及虾青素累积的调节作用.结果表明,尽管在不同株系之间存在一定的差异,但激素明显促进该藻细胞生长和虾青素累积,而对细胞大小没有产生明显影响.激素对红球藻细胞数量的增加主要是靠加快游动细胞阶段无性繁殖过程来实现的:而激素对虾青素含量的提高却是通过增加细胞数量和细胞内虾青素积累的协同作用结果,其中以细胞数量的增加为主.在激素单因素实验中,3-IBA对H0细胞生长增加效果最好,对H2、H3细胞生长增加效果较好的是kt,对H4细胞生长增加效果最明显的是NAA.与空白对照组相比,上述激素处理后细胞生长速度分别提高了1.95、1.54、4.25和1.78倍.经过激素多因素实验,H0、H2、H3和H4藻株的细胞生长增加效果分别是空白组的1.44、2.62、2.52、1.07倍,而虾青素含量分别为空白组的1.09、1.61、1.37、2-35倍.根据4株藻株的实验结果以及综合考虑各激素的市场价格,建议在规模化生产中,采用1.75mg/NAA和4mg/L 3-IBA以提高红球藻的培养效果.     

microRNA介导雨生红球藻在高光胁迫下次级细胞壁形成和虾青素积累的分子机制

雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)是天然虾青素的最佳来源,它可以在高光胁迫等不利条件下转变成厚壁细胞并积累大量虾青素。然而,目前从微小RNA (microRNA, miRNA)层面来揭示在高光胁迫下雨生红球藻次级细胞壁形成和虾青素合成的机理研究尚未见报道。对高光处理下三个时间点的雨生红球藻样品进行microRNA测序,共鉴定出342个已知miRNA和283个新miRNA。在这625个miRNA中,其中有206个miRNA的表达量受高光影响,这些差异表达的miRNA的靶基因参与了淀粉与蔗糖代谢、甘露糖与果糖代谢、糖酵解和萜类骨架生物合成等重要代谢通路。结合转录组结果发现,高光胁迫下有6个miRNA调控了3个和次级细胞壁形成相关靶基因的表达,有5个miRNA调控了5个和虾青素生物合成相关靶基因的表达。以上结果揭示了雨生红球藻在高光下miRNA调控次级细胞壁形成和虾青素生物合成的潜在机制,为雨生红球藻虾青素的代谢工程奠定了理论基础。