基于MethylRAD-Seq技术对仿刺参DNA甲基化图谱的研究

全基因组DNA甲基化作为重要的表观遗传学现象,其在生物体诸多生理生化过程中起了重要作用。研究表明全基因组DNA甲基化在基因的表达调控、维持胚胎正常发育、染色体结构稳定等方面发挥了重要作用。DNA甲基化也成为当今的研究热点之一,目前在脊椎动物领域研究相对较多,但是对无脊椎动物的甲基化规律的研究比较匮乏,因此本研究以棘皮动物门中仿刺参作为研究对象,采用最新的全基因组DNA甲基化检测方法 MethylRAD-Seq技术探究了仿刺参三种组织的甲基化状况,得到了甲基化标签数量、甲基化位点分布以及甲基化标签密度等信息;此外通过整合仿刺参甲基化文库数据和表达谱数据发现基因甲基化水平与表达水平之间存在弱的正相关性,这暗示了无脊椎动物基因组DNA甲基化可能起到促进基因表达的作用。     

仿刺参体壁再生过程中两个核糖体蛋白基因的表达差异

本研究首次从仿刺参(Apostichopus japonicus)体壁中克隆得到核糖体蛋白L30(ribosomal protein L30,RPL30)的c DNA全长序列(Gen Bank:JQ770165),该序列包括56 bp的5′-UTR,162 bp的3′-UTR和339b p的开放阅读框,共编码112个氨基酸;Blast比对分析结果显示该序列的核苷酸序列以及推导的氨基酸序列与其他物种的同源性均在75%以上;RPL30基因在仿刺参各组织中均有表达,其中肠、体腔细胞、纵肌、体壁中表达量分别为呼吸树的7.24倍(P0.01)、4.47倍(P0.01)、3.12倍(P0.05)、1.35倍(P0.05);仿刺参体壁再生不同阶段核糖体蛋白基因RPL30和RPL17的表达存在差异,体壁再生第7 d时RPL30基因的表达出现峰值,为对照组的2.13倍(P0.05),其余天数的相对表达量均低于对照组,其中第1、5、6d的表达量与对照组差异均显著(P0.05);RPL17基因在再生第2、5d分别出现峰值,分别为对照组的7.47倍和5.60倍(P0.05),其余各天的表达量与对照组差异不显著(P0.05)。研究结果表明核糖体蛋白基因除构成核糖体参与蛋白质合成外,还有着各自的核糖体外功能。本研究结果将为进一步研究仿刺参蛋白质合成、再生及多种生理活动的调控机制奠定基础。     

刺参组蛋白脱乙酰基转移酶基因克隆及其在夏眠期间表达特征的研究

刺参(Apostichopus japonicus)利用夏眠的习性来应对夏季的高温胁迫,长期的代谢减退和基因转录抑制是刺参夏眠调控过程中的关键策略。本研究克隆分析了刺参体内关键组蛋白脱乙酰基转移酶(HDACs)的基因全长及结构特征,测定了该家族成员(HDAC1,HDAC3和HDAC4)在夏眠期间的基因表达模式。研究表明:刺参HDAC3和HDAC4与紫海胆(Strongylocehtrotus purpturatus)相关基因的同源性最高,分属HDACs家族的Ⅰ型和Ⅱ型。定量表达分析表明,刺参不同组织中同属Ⅰ型的HDAC1和HDAC3基因在刺参夏眠不同阶段的表达均无显著差异;而属于Ⅱ型的HDAC4基因在深度夏眠阶段表达量显著上调。研究结果表明,II型HDACs在刺参夏眠基因转录抑制中具有潜在的特殊调节作用。     

不同光照周期对刺参摄食节律和消化生理的影响

在实验室条件下,研究了全光照(24L︰0D)、半光照半黑暗(12L︰12D)、全黑暗(0L︰24D)3种光照周期下刺参(Apostichopus japonicus)的摄食节律、摄食率以及3种消化酶(脂肪酶、淀粉酶、胰蛋白酶)活力的昼夜变化规律。结果显示:(1)在全光照条件下,刺参极少活动,24 h内的摄食比例较低(6%~10%);在半光照半黑暗条件下,刺参光照阶段运动不活跃,摄食比例较低(0~10%),黑暗阶段运动极其活跃,摄食比例较高;在全黑暗条件下,刺参一直处于较活跃状态,24 h内的摄食比例都较高。3种光照条件下,刺参的摄食高峰都出现在00:00~02:00,且刺参夜晚的摄食比例显著高于白天(P0.05);(2)刺参的日摄食率从全光照、半光照半黑暗到全黑暗依次增加,3种光照周期条件下刺参夜晚的摄食率极显著高于白天的摄食率(P0.01);(3)3种光照周期下,刺参3种消化酶活力的最大值都出现在22:00~02:00,消化酶活力的最大值比摄食高峰早0~4 h。研究结果表明,光照对刺参的摄食节律和消化酶活力昼夜变化都有显著影响,刺参具有提前分泌消化酶为即将到来的摄食做好准备的调节机制。     

光照对刺参幼体存活、生长、发育和附着变态的影响

本实验研究了不同光照强度(0lx、50lx、500lx和2000lx)和不同光照周期(24L:0D、14L:10D、10L:14D和0L:24D)对刺参(Apostichopus ja ponicus)浮游幼体存活、生长、发育及附着变态的影响。结果表明:(1)光照强度和光照周期显著影响刺参幼体的生长(P0.05),幼体在不同光照强度下生长速度的高低顺序为:500lx50lx2000lx0lx,不同光照周期下生长速度的高低顺序为:14L:10D10L:14D24L:0D0L:24D。(2)不同光照强度下,幼体的存活率随光照强度的升高而增大;0L:24D光周期下的幼体存活率显著低于其余3个光周期处理(P0.05)。(3)4种光照强度下,500lx处理组的幼体发育最快,9d时樽形幼体的发生率为30.9%,0lx处理组樽形幼体的发生率仅为5.2%,且致畸率高达17.7%,显著高于其他光照强度处理(P0.05);4种光照周期下,10L:14D光照周期下的幼体发育最快,9d时樽形幼体的发生率为34.8%,显著高于其余光周期处理组(P0.05)。(4)幼体在不同光照强度和光照周期下变态率的大小顺序分别为:50lx500lx2000lx0lx,10L:14D14L:10D24L:0D0L:24D,光照强度与光照周期均显著影响幼体的变态(P0.05)。可见,提供一定的光照对刺参浮游幼体的生长发育更为有利。     

Tc1/Mariner转座子超家族在褶皱臂尾轮虫中的进化和表达分析

为了探究Tc1/Mariner转座子超家族对褶皱臂尾轮虫(Brachionus plicatilis)基因组结构和基因表达调控的影响,本研究基于褶皱臂尾轮虫的基因组和转录组数据,对褶皱臂尾轮虫的重复序列进行了注释,并对褶皱臂尾轮虫的转座子的表达和其临近基因的表达进行了统计和富集,在基因上下游及内部区域富集到了10个转座...     

泥蚶低氧胁迫后血细胞转录组及耐低氧相关基因的筛选与分析

泥蚶(Tegillarcagranosa)是一种比较特别的具有较强耐低氧能力的贝类,但目前其耐低氧分子调控机理尚不知。为探究泥蚶耐受低氧的分子调控机理,本研究对低氧胁迫下的泥蚶(Tegillarca granosa)血细胞转录组中富集的信号通路及生物学过程进行分析,并初步筛选分析耐低氧基因。对低氧(DO=0.5 mg/L)胁迫6、24、72、120 h的泥蚶血细胞进行转录组测序(RNA-seq)并开展生物信息学分析,筛选出差异基因集,并对胁迫72、120 h的DEGs进行GO富集分析、KEGG通路分析,采用qPCR方法检测7个DEGs的表达量并与转录组比较。结果显示从6 h开始到120 h的4个时间点的DEGs数量呈增多的趋势, GO功能分析主要富集在JUN激酶活性的负调控、蛋白质水解的负调控及免疫系统进程等主动抗凋亡、抗逆进程; KEGG通路分析主要富集在胰岛素及胰腺分泌的信号通路、HIF-1通路、钙信号相关通路和细胞凋亡相关通路。qPCR检测结果显示, 7个基因的表达上调/下调趋势与转录组测序一致,证实了转录组测序结果的可靠性。本研究推测胰腺分泌信号通路、钙信号通路及凋亡通路在泥蚶...     

花鲈低氧诱导因子基因(hifs)的序列分析及低氧诱导表达

低氧诱导因子基因(hifs)是由α和β构成的异源二聚体转录因子,在生物低氧应答中发挥着重要作用。本实验对花鲈4个hifs基因进行了序列分析及组织表达检测,并检测了各基因在低氧诱导后的mRNA表达变化。研究表明,通过全基因组比对、进化树分析和共线性分析,共鉴定出花鲈的4个hifs基因,分别为hif1α、hif2α、hif3α、hif1β。组织表达结果显示,hifs基因具有组织特异性表达特征。低氧((1.56±0.24)mg/L)诱导下,hifs各基因的响应时间和响应程度存在一定差异。肝组织中,低氧胁迫3和6 h后,hif1α、hif2α、hif3α和hif1β表达量均出现了显著升高,表明hifα和hif1β基因可能共同起低氧调控作用;而低氧胁迫12 h后,仅hif1α表达量显著高于对照组,表明hif1α基因在肝组织低氧调控12 h内持续起作用。鳃组织中,低氧胁迫3 h后,hif1α、hif2α、hif3α基因表达量出现了显著升高,而低氧胁迫6 h后,hif3α和hif1β基因表达量显著升高,说明在鳃组织前3h的低氧胁迫中仅hifα基因起调控作用,而6 h后hif3α和hif1β基因共同调控低氧胁迫。常氧恢复阶段肝、鳃组织中各基因表达量均与对照组无显著差异。本研究结果表明,4个hifs基因的组织表达具有特异性,同时对低氧的响应时间和程度不同,研究结果弥补了花鲈hifs基因及低氧应答研究的空白。     

单环刺螠转录因子基因Sp8的克隆、原核表达和重组蛋白纯化

转录因子Sp是一类广泛存在的锌指蛋白超家族成员,可与某些基因的上游调控序列结合,参与基因的转录调控。本研究采用同源克隆和RACE技术,获得单环刺螠的Sp8的全长cDNA,该序列长1 913bp,开放阅读框1 521bp,编码506个氨基酸;将其开放阅读框cDNA克隆到原核表达载体pET28a中,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,在37℃条件下,经1mmol/L IPTG诱导表达4h,获得以包涵体形式存在的重组蛋白pET28a-SP,使用8mol/L尿素溶解包涵体,并通过镍离子金属螯合柱纯化获得重组蛋白,SDS-PAGE分析该蛋白的分子量约为50kD。Sp8蛋白体外表达的成功将为研究单环刺螠相关基因的转录调控打下基础。     

夏眠期仿刺参肠组织实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选

在仿刺参(Apostichopus japonicus)正常时期、夏眠初期和中期,应用实时荧光定量PCR技术,检测CA043、dpolm、ro60、grb2、hiat1、nlrc4、farp1、cyc和gapdh9个候选内参基因在肠组织中的表达稳定性。利用DeltaCt、GeNorm、NormFinder和BestKeeper 4种程序进行统计分析。发现上述条件中,9个候选内参基因在上述条件中的表达稳定性存在一定差异,不同的软件处理分析,得到的基因稳定性排序不完全一致。综合4种程序的方法,筛选出基因grb2表达最稳定,可用作内参基因,其次为基因ro60及dpolm,而表达最不稳定的是CA043,不适宜作为内参基因。本研究为仿刺参中基因表达定量分析奠定了基础,同时为仿刺参中内参基因的选择提供一定参考依据。     

大弹涂鱼(Boleophthalmus pectinirostris)单核巨噬细胞低氧胁迫比较转录组学分析

低氧是鱼类在水生环境中的关键压力之一。而大弹涂鱼(Boleophthalmus pectinirostris,mudskipper)可能是少数能在低氧中自然呼吸的脊椎动物。本研究中,我们分析了低氧胁迫8h后大弹涂鱼头肾源单核巨噬细胞(monocytes/macrophages,MO/MΦ)转录组变化。采用Illumina Hiseq 4000平台进行高通量测序,获得了大弹涂鱼MO/MΦ短时低氧胁迫相关的转录组数据,并将获得的原始数据上传至NCBI获得ID号:SRR9771486-SRR9771491 (Bioproject PRJNA543702)。分析结果显示,P0.05和|log2(fold change)|≥1条件下进行差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)筛选,低氧处理组中共获得4487个DEGs,包括2507个上调DEGs,1980个下调DEGs。其中低氧诱导因子(hypoxia-inducible factors,HIF)转录本的表达无显著变化,而血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor-A.VEGF-A)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因转录本表达上调。基因本体(Gene Ontology,GO)注释以及京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)信号通路富集分析揭示了糖酵解/糖异生和氧化磷酸化可能在MO/MΦ应对短时低氧胁迫中具有重要作用。随机选择10个DEGs进行实时荧光定量PCR验证,上述基因表达变化趋势与转录组数据一致。本研究揭示了在短时低氧胁迫下大弹涂鱼MO/MΦ基因表达及信号通路调控机制。     

刺参真核翻译起始因子基因(eif2s1)的cDNA 克隆及表达分析

夏眠是刺参(Apostichopusjaponicas)应对夏季高温低氧等不良环境的重要生存策略,而抑制高耗能的蛋白合成则是夏眠期机体有效降低能耗的重要环节。真核翻译起始因子eIF2是启动蛋白翻译的关键因子,在蛋白合成调控中发挥了重要作用。本研究克隆分析了刺参翻译起始因子eIF2α亚基(eif2s1基因)全长cDNA序列及结构特征,并测定了其在夏眠期间的时空表达模式。结果表明:刺参eif2s1基因序列较保守,与紫海胆该基因同源性最高。同时,刺参eif2s1基因在深度夏眠期组织中出现了不同程度的表达抑制,可能参与了刺参夏眠蛋白抑制调控。     

光照对凡纳滨对虾幼体变态发育的影响

为了解光照对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)幼体发育和存活率的影响,作者在研究中设定了4种单色光(红、黄、蓝、绿光)及不同光照强度(0、1 500、5 500、12 000 lx)进行实验并就光照对幼体产生的影响进行分析。实验表明:4种单色光对幼体发育变态时间和成活率都有较大影响。幼体从ZⅠ变态发育至仔虾P1,蓝光的幼体发育时间最长,为262.83 h,比对照组多28 h;黄光存活率最低,只有14.49%,比对照组低25.00%,差异显著(P0.05)。同时,凡纳滨对虾幼体在不同的发育阶段对不同光色的敏感度不同,红光和黄光只对溞状幼体变态有较明显的抑制作用,但对糠虾幼体的发育却有促进作用;蓝光和绿光对整个发育阶段都有影响。光照强度对幼体的存活和变态影响差异显著(P0.05)。幼体从ZⅠ发育至P1,12 000 lx光照下幼体变态发育耗时最长(257.33 h),存活率最低(1.63%)。在溞状幼体期,光照大于1 500 lx时,幼体的变态时间增加,存活率下降。糠虾幼体期可适应光照在5 500 lx以下的环境,而仔虾期则可适应120 000 lx的光照。建议根据不同发育阶段调整光照强度,当幼体在ZⅠ时,光强应控制在1 500 lx以下,之后可逐渐增强。本实验结果可为凡纳滨对虾育苗期间的光照管理提供基础数据和理论依据。     

盐度骤变对仿刺参hsp70及hsp90基因表达的影响

为研究夏季暴雨导致的养殖池塘盐度变化对仿刺参(Apostichopus japonicus)生理的影响,在实验室内模拟野外盐度变化,采用半定量RT-PCR的方法研究了其hsp70、hsp90a及hsp90b基因的表达。实验中,盐度先以每6h降2.5的速度由30降至20;保持96h后,再以同样的速度由20升至30,随后在盐度为30条件下保持96h。在盐度变化过程中随机取样。hsp70和hsp90b基因在盐度降至20后表达量开始显著升高(P<0.05),hsp90a基因在盐度降至22.5时表达量开始显著升高(P<0.05);但保持在盐度为20条件下,3个基因的表达量均逐渐降低至初始值。在之后的盐度升高及恢复阶段,3个基因表达量均有先升高后降低的趋势,表明hsp70、hsp90a和hsp90b基因是仿刺参在盐度胁迫下的重要响应因子。     

白斑综合症病毒基因组同源重复区结合蛋白WSSV021的鉴定

利用噬菌体展示技术,发现wssv021是与病毒基因组同源重复区中一个包含高度保守结构域的小重复片断DNA结合的蛋白质的编码基因,可能参与病毒复制或调控.时相转录分析发现,wssv021属于病毒感染的早期基因.将wssv021基因克隆到pQE-30表达载体,在E.coliXL1-Blue中进行融合表达.凝胶阻滞分析显示,体外表达的（His）6-WSSV021蛋白可以和同源重复区中小重复片断DNA特异性相互作用.     

鳗草HSF基因家族的筛选与生物信息学分析

鳗草(Zostera marina)作为适应在海洋环境中生长和繁殖的多年生被子植物,是研究海洋高等植物分子进化的理想物种。热激转录因子(HSF)在植物细胞的修复、蛋白的转录修饰以及信号转导中具有重要的作用。为全面了解鳗草基因组中HSF基因家族信息,本文采用生物信息学手段,在鳗草基因组中鉴定了11个ZmHSFs基因,基因长度差异较大,但均不含有内含子。系统发育结果显示11个基因分为HSFA和HSFB两大分支。顺式作用元件分析表明ZmHSFs基因很可能同时受到温度和光照等多种非生物因素的调节。此外,鳗草HSF基因家族数目明显小于其他高等植物,二次入海过程可能导致部分ZmHSFs基因丢失。转录组数据表明HSF基因在3种不同器官中均有表达,且存在一定的器官表达差异。     

刺参虾青素基因的克隆及不同体色个体间表达差异的分析

仿刺参(Apostichopus japonicus Selenka)的体色变化很大,多数背腹均为黄褐色,极少数呈白化特征,背腹均为纯白色。经人工繁育实验发现,白化仿刺参的子代仍多具白化特征。本文研究了虾青素基因与刺参白化特征的相关性。在克隆虾青素基因cDNA全长的基础上,比较了普通仿刺参和白化仿刺参在不同发育时期虾青素基因表达量的差异。结果表明,该基因的cDNA含有2058个核苷酸,编码560个氨基酸。经实时定量PCR分析,白化成参体壁中虾青素基因表达量显著低于普通成参;而在仿刺参色素沉积的早期,白化稚参体壁中虾青素基因表达量从受精后第39天开始显著低于普通稚参。可见,仿刺参体壁中虾青素基因的低表达与刺参白化特征的发生密切相关。     

青岛仿刺参中3种海参皂苷的分离纯化及结构鉴定

对青岛产仿刺参体内皂苷类成分进行分离及结构鉴定,确定其皂苷的主要组成及比例。应用大孔树脂,正相硅胶柱层析和半制备型HPLC对青岛产仿刺参体内的皂苷成分进行分离纯化,根据化合物的理化性质和波谱数据鉴定其结构。共分离并鉴定3种三萜皂苷类化合物,分别为Cladoloside B(1),Holotoxin A1(2)和Holotoxin B1(3)。青岛海域仿刺参体内的皂苷组成主要为Cladoloside B(1),Holotoxin A1(2)和Holotoxin B1(3),比例约为1∶4.5∶1.7。     

仿刺参(Apostichopus japonicus)肠道菌群的地域性差异与共性研究

作为高附加值水产养殖物种,仿刺参(Apostichopusjaponicus)的病害和病原微生物研究受到人们关注,但对其共生菌群组成、地域性差异及与水体环境间交流等方面的研究仍十分有限。本研究收集了来自中国、日本和韩国共786例仿刺参肠道、水体和沉积物的16SrRNA基因高通量测序数据,比较细菌群落组成以探寻仿刺参肠道微生物与环境和地域之间的关系。分析结果显示,尽管仿刺参肠道、水体和沉积物中各细菌组分的比例不同,但共有菌属甚多,表明仿刺参可以从外界环境大量获取微生物。与水体和沉积物的样本类型相比,仿刺参肠道微生物多样性最低且所含菌属的种类最少,进一步提示仿刺参肠道对外界来源的微生物进行了富集和筛选,其中变形细菌门(Proteobacteria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)和利斯顿氏菌属(Listonella)的富集尤为明显。中国、日本和韩国来源的仿刺参肠道微生物Alpha多样性无显著差异,但主坐标分析将它们聚为不同的簇,且各自拥有独特的细菌门类。比较中国渤海和黄海两个海区的仿刺参肠道菌群获得了相似的结果,体现出广泛的地域性差异。基于细菌分类的功能预测发现三个国家仿刺参肠道微生物均具有发酵、化能异养和需氧化能异养功能,表明共生菌群在功能上存在共性,并可能对宿主生理产生相同的作用。本研究揭示了仿刺参肠道微生物在不同地域之间存在明显差异,并且与水体环境之间存在着密切的联系,能够为仿刺参共生微生物及其与宿主健康的相关性研究提供基础性资料,并可能在自然循环过程和渔业资源保护过程中发挥作用。     

刺参对人工礁体设计关键指标的选择性

采用平均聚集率(Mean Attractive Rate,MAR)作为统计分析指标,研究了仿刺参(Apostichopusjaponicas Selenka)对人工礁体结构设计关键指标(孔径、间隙、颜色、夹角)的选择性及其行为特性。结果表明:(1)随着实验时间延长,仿刺参在礁体模型上的聚集数量呈上升趋势;(2)礁体模型在自然光照条件下的聚参效果优于黑暗条件下的聚参效果(P<0.05);(3)孔径组各水平间聚参效果比较:2 cm>4 cm、16 cm>8 cm(P<0.05),4 cm与16 cm间差异不显著;间隙组各水平间聚参效果比较:2 cm>4 cm>6 cm>8 cm(P<0.05);颜色组各水平间聚参效果比较:黑色、蓝色、红色>绿色>白色>透明(P<0.05),黑色、蓝色、红色间差异不显著;夹角组各水平间聚参效果比较:15°>30°>45°、60°>90°、120°(P<0.05),45°与60°差异不显著,90°与120°差异不显著。说明仿刺参适应礁体模型需要一定时间,呈负趋光性。10 g至30 g的仿刺参,对设计指标为2 cm孔径、2 cm间距、深色、15°夹角的人工礁体,具有较好地选择性。