白斑综合征病毒对脊尾白虾的致病性研究

2010年、2011年江苏沿海多数地方海水养殖中发生了脊尾白虾大规模死亡的现象,本课题通过对患暴发性流行病的脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)进行病毒分子生物学检测,发现病虾体内白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,简称WSSV)检测普遍呈阳性;应用发病虾组织制备的病毒粗提液,进行了人工感染实验,实验表明该病毒对脊尾白虾具有较强的致病性,可引起68.5%的死亡率。电镜结果表明,发病虾与感染病虾鳃及肝胰脏等组织器官都发生了相同的细胞病理变化,主要表现为细胞核内染色质边聚、线粒体肿胀、内嵴消失等一系列细胞病理变化,在其细胞核与细胞质中发现了具有单层囊膜结构的对虾白斑综合征病毒粒子,病毒粒子大小约为(130~170)nm×(305~405)nm,核衣壳呈子弹形,一端较细另一端较粗,完整病毒粒子由核心、衣壳和囊膜构成,分子生物学实验表明该病毒为WSSV。实验结果符合柯赫氏法则,可以初步推断WSSV感染脊尾白虾并与引发的大规模死亡有着直接关系。     

脊尾白虾精子体外保存的研究

采用精子存活率和顶体酶活力两种评价精子质量方法,研究了不同稀释剂与抗冻保护剂对脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)精子体外保存效果的影响。结果表明：稀释剂Ⅰ-壬氏液为脊尾白虾精子体外保存的最佳稀释剂,4℃下保存4 d后,稀释剂Ⅰ组精子存活率为71.50%,顶体酶活力为1.803μIU/106,两种指标值均高于其他实验组,各组精子存活率与顶体酶活力之间相关性显著γ=0.846(P<0.05);在液氮-196℃下保存2 d后,稀释剂Ⅰ组精子存活率达83.50%,顶体酶活力为2.507μIU/106,两种指标值均高于其他各组以及4℃下稀释剂Ⅰ组同期保存效果,各组精子存活率与顶体酶活力之间相关性极显著,γ=0.862(P<0.01)。15%DMSO为脊尾白虾精子超低温保存的最佳抗冻保护剂,此条件下超低温保存2 d后,精子存活率为81.32%,顶体酶活力为1.385μIU/106,各组精子存活率与顶体酶活力之间相关性极显著,相关系数γ=0.864(P<0.01)。     

脊尾白虾白斑综合征病毒耐受群体重要免疫相关酶的活性分析

白斑综合征(white spot syndrome,WSS)的爆发已给虾类养殖业造成了严重经济损失,寻找能够指示虾类群体抗白斑病能力的指标对虾类养殖业具有重要意义。本研究以脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda Holthuis)为实验材料,以人工注射白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)攻毒后稳定存活的脊尾白虾作为WSSV耐受群体(命名为Rm),以注射PBS的虾作为对照群体(命名为Vm),分析比较了Rm群体和Vm群体的酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)活性差异以探讨筛选对虾抗病免疫指标的可行性。Rm群体的ACP和AKP活性均显著低于Vm群体(P0.05),而两群体在SOD活性上无显著差异。为进一步检验WSSV耐受群体是否比未经历过病毒感染的虾具有更高的抗WSSV的能力,作者以实验室养殖过程中经过WSSV自然感染后存活的脊尾白虾作为抗性群体(命名为Rn),以未经历过WSSV感染的脊尾白虾作为普通群体(Vn),进行WSSV人工注射攻毒,观察它们在WSSV感染后的存活率,结果显示Rn群体攻毒后存活率为33.2%,显著高于Vn群体的存活率15.1%(P0.05),说明ACP和AKP有可能作为虾类抗WSSV能力的评价指标。     

脊尾白虾的行为学观察研究

在高密度室内饲养条件下,观察了脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)的摄食、相残、运动、蜕皮、间隔、攻击和防御行为。试验结果表明,脊尾白虾摄食行为活跃,运动行为多样,在饥饿或个体较大差异条件下具有一定程度的相残行为,蜕皮行为表现出一定的特殊性,常经数天多次蜕皮行为特征后才能将旧壳蜕下,间隔行为不明显,攻击频率不高。另外,通过设置不同投喂组和投喂间隔时间观察比较了索饵率和相残率,结果表明,索饵率在第8小时已基本达到最高,相残率随投喂间隔时间的延长和空间密度的增大而升高。     

脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)vasa基因cDNA克隆及其在卵巢发育中的表达分析

VASA蛋白属于DEAD-box家族蛋白,是一种RNA解旋酶,在生殖细胞的分化中具有重要作用。本研究从脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)卵巢中克隆得到vasa基因cDNA全长(将其命名为Ec-vasa),Ec-vasa序列长度为2516bp,开放阅读框(ORF)长度为1800bp,编码600个氨基酸,具有DEAD-box家族蛋白的8个高度保守的结构域,与日本沼虾(Macrobrachium nipponense)的同源性最高(80%)。半定量RT-PCR结果显示,Ec-vasa在卵巢组织中特异表达,在肌肉、肝胰腺、心脏和鳃等组织中均未检测到表达。荧光定量结果显示,Ec-vasa在卵巢发育Ⅰ期具有较高表达量,随着卵巢的发育,表达量逐渐降低,在第Ⅳ期达到最低水平。结果表明,Ec-vasa基因可能在脊尾白虾卵巢的早期分化和卵子发生过程中起重要作用。     

不同产地浒苔对幼刺参生长、消化和非特异性免疫的影响

为探究不同产地浒苔型饵料对幼刺参生长、消化和非特异性免疫的影响,本实验将青岛浒苔与宁波浒苔的干粉与海泥分别按一定质量比例混合,开展刺参饲喂实验,并与刺参天然饵料马尾藻进行对比。结果表明,青岛浒苔饵料和马尾藻饵料喂养的刺参的粗蛋白含量分别为14.31%±0.10%和15.43%±1.41%,显著高于宁波浒苔饵料(11.17%±0.63%),粗脂肪和灰分含量无显著差异;青岛浒苔组、宁波浒苔组和马尾藻组的增重率分别为22.65%±5.68%、3.03%±1.17%和20.47%±2.01%,特定生长率分别为(1.44±0.33)、(0.21±0.08)、(1.33±0.12)%/d,青岛浒苔组和马尾藻组刺参的增重率和特定生长率显著高于宁波浒苔组;青岛浒苔组、宁波浒苔组和马尾藻组刺参肠道淀粉酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和纤维素酶活力无显著差异;马尾藻组刺参体腔液碱性磷酸酶活力为(17.57±4.56)金氏单位/100mL,显著高于青岛浒苔组[(5.56±1.32)金氏单位/100mL]和宁波浒苔组[(2.83±0.75)金氏单位/100mL],超氧化物歧化酶和酸性磷酸酶活力无显著差异。由此可见,绿潮暴发时,通过打捞浒苔用以配制刺参饵料,既有助于缓解绿潮的生态灾害,又能够补充刺参饵料来源,具有广阔的生态效益和市场前景,但是其营养成分影响因素较为复杂,配制饵料时应充分考虑不同品种、采集时间和生长地点的差异,并通过一些前处理手段充分发挥浒苔的饵料价值。     

温度对脊尾白虾胚胎及幼体发育的影响研究

为进一步阐明脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)的繁殖生物学习性, 作者分别以脊尾白虾受精卵和初孵幼体为实验对象, 研究了温度对脊尾白虾胚胎发育及幼体发育的影响。结果表明, 温度对孵化时间及胚胎孵化率影响显著(P<0.05): 在实验温度范围内(19～31℃), 胚胎发育进程随温度升高而加快, 19℃和31℃条件下胚胎孵化时间分别为(536.50±18.33) h 和(218.68±5.51) h; 胚胎孵化率在25℃下最高为64.11%±12.54%, 较高(28～31℃)和较低(19～22℃)温度下的胚胎孵化率显著降低。温度对脊尾白虾幼体发育影响显著(P<0.05): 在16～32℃范围内, 体长增长率随温度的升高而增加, 但幼体发育持续时间随温度的升高而减少, 16℃和32℃条件下幼体变态为仔虾所需时间分别为孵化后(27.60±0.22)d和(7.75±0.07)d, 较低温度范围内(16～28℃)P₁变态存活率随温度升高而升高, 28℃的P₁变态存活率最高达91.67%±7.64%。但当温度继续升高时, 幼体的变态存活率急剧降低, 36℃时幼体不能变态为仔虾。根据曲线拟合方程推算的最适胚胎发育和幼体发育温度分别为25.33℃和27.60℃。本实验结果可以为脊尾白虾人工育苗的管理提供参考和依据。     

恩诺沙星对脊尾白虾APND、ECOD和GST活性的影响

为研究脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)药物代谢酶对恩诺沙星的响应及其在恩诺沙星代谢过程中的作用,作者以10、20和40 mg/kg恩诺沙星连续投喂脊尾白虾3 d,于投喂后的第1、2天以及停止投喂药物的第1、4、8、12、24、48、72、120小时取样,测定了脊尾白虾肝胰腺、鳃和血清中的氨基比林-N-脱甲基酶(aminopyrine-N-demethylase,APND)、7-乙氧基香豆素-O-脱乙基酶(7-ethoxycoumarinO-Deethylase,ECOD)和谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase,GST)的活性。结果表明:不同浓度恩诺沙星对脊尾白虾肝胰腺、鳃和血清中Ⅰ相药物代谢酶APND和ECOD活性均呈现显著抑制作用(P0.05)。投喂药物后,APND和ECOD活性呈现先下降后逐渐上升趋势,3个剂量组酶活性均在最后一次给药后8 h达到最低。与对照组相比,不同浓度恩诺沙星对各组织中Ⅱ相药物代谢酶GST活性呈现显著诱导作用(P0.05),此作用呈现先上升后下降的趋势。恩诺沙星对脊尾白虾APND、ECOD及GST活性的作用均呈现剂量依赖性。本研究表明,脊尾白虾Ⅰ相和Ⅱ相代谢酶均会对药物做出反应,可作为其养殖过程中药物代谢及适用性的指示物。     

三氯异氰尿酸对脊尾白虾幼体存活及发育的影响

三氯异氰尿酸(Trichloroisocyanuric acid ,TCCA)是水产养殖中常用的水质消毒剂, 使用不当会给生产和环境带来危害。为指导脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)人工育苗过程中TCCA 的安全用药,作者利用静水试验法研究了TCCA 对脊尾白虾幼体的急性毒性及对幼体发育的影响。实验设7 个浓度梯度组(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/L)和1 个空白对照组, 每组3 个平行。急性毒性实验持续96 h 后结束, 用正常育苗海水代替TCCA 溶液, 正常管理直到幼体全部变态为仔虾, 评估短时间的TCCA 处理对脊尾白虾幼体发育的影响。结果表明, TCCA 对脊尾白虾幼体在24、48、72 和96 h 的半致死浓度分别为3.81、3.03、2.71 和2.47 mg/L, 其安全浓度为0.25 mg/L; 随着TCCA 浓度的升高, 脊尾白虾幼体变态存活率显著降低(P<0.05), 但能成功变态为仔虾个体的变态持续时间及仔虾体长与对照组无明显差异(P>0.05)。本实验结果可以为脊尾白虾人工育苗安全用药提供参考和依据。     

脊尾白虾C-型凝集素基因cDNA全长的克隆和表达分析

本研究利用本实验室构建的脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)血细胞c DNA文库中的C-型凝集素基因EST序列,采用c DNA末端快速扩增(rapid amplification of c DNA end,RACE)技术克隆获得脊尾白虾C-型凝集素基因c DNA全长,命名为Ec CTL。该基因全长1285 bp,包含1041 bp的开放阅读框,编码346个氨基酸组成的蛋白质,分子量为38.56 k Da,为甘露糖型凝集素。同源性分析表明,脊尾白虾Ec CTL基因氨基酸序列与秀丽白虾(Palaemon modestus)的同源性最高,达到91%。荧光定量PCR分析结果表明,Ec CTL基因在血细胞、肝胰腺、肌肉等组织中均有表达,其中在肝胰腺当中的相对表达量最高。感染鳗弧菌(Vibrio anguillarum)和白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)后6~12 h,脊尾白虾血细胞和肝胰腺中Ec CTL的表达量较对照组均显著增加(P0.05),且具有明显的时间差异性。本研究证明脊尾白虾C-型凝集素在其免疫反应中起到重要作用,为进一步探索脊尾白虾免疫系统打下基础。     

pH 胁迫对脊尾白虾抗氧化酶活力的影响

为了了解pH胁迫下脊尾白虾(Palaemon(Exopalaemon)carinicauda Holthuis)的适应性,作者采用静水毒性的实验方法确定了脊尾白虾的半致死pH,分析了pH胁迫对脊尾白虾抗氧化酶活力的影响。设置pH4~11.1共17个胁迫组,统计脊尾白虾24、48、72和96 h的死亡率。结果显示,脊尾白虾24、48、72和96 h酸性半致死pH值分别为4.25、4.64、4.71和4.78,碱性半致死pH分别为10.87、10.55、10.38和10.29。将脊尾白虾暴露于低pH 6.5、高pH9.5的水体,以pH8.0作为对照,分别于胁迫后0、3、6、12、24、48、72和96 h测定鳃、肝胰腺、肌肉和血淋巴中总抗氧化力、过氧化氢酶、抗超氧阴离子活力。结果发现,pH胁迫后,在3~6 h内各组织中抗氧化酶活力均显著上升,24~48 h开始回落,到96 h之前,各组织中抗氧化酶水平基本恢复到对照组水平。整个实验过程中肝胰腺中抗氧化酶活力水平明显高于其他组织。本实验结果表明,脊尾白虾对pH有很强的适应性,pH胁迫3~24 h之内抗氧化酶活力反馈性升高清除体内多余的活性氧。     

复方中草药对小丑鱼非特异性免疫、消化酶活性的影响及对刺激隐核虫杀灭效果分析

刺激隐核虫寄生感染引起的“白点病”不仅危害水族箱观赏鱼类,还会对水族馆大水体海水观赏鱼带来毁灭性打击,是海水观赏鱼养殖业危害最为严重的病害之一。本研究探讨了在基础饲料中添加不同剂量复方中草药“XCY-1”(苦参、地肤子、蛇床子、黄芪、甘草等按一定比例混合,超微粉碎后收集备用)对小丑鱼血清、肝脏中非特异性免疫指标和肠道消化酶活性指标变化及不同用药方式对防治刺激隐核虫病的效果。研究结果显示,投喂复方中草药“XCY-1”可使小丑鱼血清中溶菌酶(LZM)、超氧化物歧化酶(SOD)、碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP),肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)、总抗氧化能力(T-AOC)活性均呈现先升后降趋势,第21 d各项非特异性免疫指标达到最高值,其中20 g/kg剂量组效果最好,能显著提高小丑鱼的免疫能力;肠道中淀粉酶(AMS)、脂肪酶(LPS)和胰蛋白酶在各取样点活性均高于对照组,20 g/kg剂量组在各取样点胰蛋白酶和AMS活性高于其他剂量组,20 g/kg和40 g/kg剂量组在各取样点LPS活性最高。复方中草药“XCY-1”药浴对刺激隐核虫幼虫的体外杀灭结果显示:4 h内,50 mg/L药物浓度即对刺激隐核虫幼虫具有一定的杀灭效果,400 mg/L药物浓度即可杀灭全部幼虫;当药物浓度达到800 mg/L时,3 h内幼虫全部死亡。不同用药方式防治小丑鱼刺激隐核虫病:实验分为4组,A组20 g/kg剂量组,口服无药浴;B组20 g/kg剂量组,口服且同时按50 mg/L进行药浴;C组20 g/kg剂量组,口服且同时按100 mg/L进行药浴;D组为对照组,仅投喂基础饲料。结果显示:实验第6 d,A、B、C三个药物组与对照组的存活率分别为:51.1%、53.3%、57.7%、0,药物组存活率显著高于对照组(P＜0.05);三个药物处理组每片鳃上仅有0~2个滋养体,对照组每片鳃上滋养体数量是用药组65倍。综上所述,饲料中添加复方中草药“XCY-1”可以提升小丑鱼血清、肝脏非特异性免疫指标和肠道消化酶活性,对刺激隐核虫病起到积极的预防和治疗效果。20 g/kg剂量组、投喂时间14~21 d时效果最佳。该研究为开发无公害、环保型天然植物源杀虫药提供理论参考和技术支撑。     

微塑料对黑海参(Holothuria atra)免疫和消化生理的影响

为了研究微塑料对黑海参(Holothuria atra)免疫及消化生理的影响,将体重为(47.61±6.97) g的黑海参暴露于添加了不同浓度(0、10~2、10~4、10~6粒/L)聚苯乙烯微塑料的海水中,分析了黑海参的免疫和消化生理指标的变化情况。结果表明,海水中的微塑料浓度对黑海参体腔细胞的数量和吞噬活性,体腔液中酸性磷酸酶(ACP)、溶菌酶(LZM)和超氧化物歧化酶(SOD)活性均有显著影响(P0.05),而对碱性磷酸酶(AKP)活性没有显著影响。随着微塑料浓度升高,黑海参的体腔细胞数量以及体腔液中ACP、LZM和SOD活性呈先持续增加后降低的趋势,体腔细胞数量、体腔液中ACP活性均在104粒/L浓度达到峰值,体腔液中LZM和SOD活性则在10~2粒/L浓度达到峰值;而体腔细胞的吞噬活性随着微塑料浓度的增加而持续增加。黑海参消化道内的淀粉酶受海水中的微塑料浓度的影响显著(P0.05),胰蛋白酶活性和脂肪酶活性没有显著变化。随着微塑料浓度升高,黑海参肠道淀粉酶活性呈先持续增加,在10~4粒/L浓度达到峰值,而后又降低;胰蛋白酶活性随着微塑料浓度的增加持续增加;而三种微塑料浓度下黑海参的脂肪酶活性均低于空白组。由此可见,海水中添加微塑料后,黑海参体内产生了免疫防御反应,并倾向于优先消化淀粉和蛋白质以快速获取能量从而适应周围环境的改变;海水中高浓度的微塑料可能对黑海参的体腔细胞结构产生损伤,导致其免疫防御能力下降,影响其正常生理活动。     

复方中草药对黑棘鲷生长、非特异性免疫及肠道消化酶的影响

本试验旨在探究复方中草药对黑棘鲷(Acanthopagrus schlegelii)生长性能、非特异性免疫及肠道消化酶的影响。将党参(Codonopsis pilosula)、黄芪(Astragalus membranaceus)、板蓝根(Isatis tinctoria)、金银花(Lonicera japonica)、麦冬(Ophiopogon japonicus)、炽壳(Fructus aurantii)、大黄(Rheum palmatum)、神曲(Massa medicata fermentata)、杜仲(Eucommia ulmoides)、天门冬(Asparagus cochinchinensis)、艾叶(Artemisia argyi)、仙鹤草(Agrimonia pilosa)粉碎混匀,配伍制成复方中草药。试验采用单因素设计,将复方中草药梯度(0%、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%)添加到黑棘鲷(Acanthopagrus schlegelii)基础饲料中,饲喂黑棘鲷28d。结果表明:复方中草药添加量在0.4%时增质量率和特定生长率显著增高,且饵料系数显著...     

脊尾白虾Dnmt2启动子克隆及其转录调控分析

为探明脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda) Dnmt2 (DNA methyltransf-erase2, Dnmt2)启动子对Dnmt2转录的调控作用, 本研究利用染色体步移技术克隆得到脊尾白虾Dnmt2启动子, 使用在线软件预测该基因启动子区域的转录调控元件及转录因子结合位点, 通过构建一系列缺失表达载体, 利用双荧光素酶报告基因检测技术鉴定了该基因核心启动子区, 并对其启动子活性进行检测。结果表明, 克隆的脊尾白虾Dnmt2启动子长度为1315 bp, 转录起始位点“A”位于ATG上游236 bp, 启动子区域含有多种转录因子结合位点, 包括STAT3、SOX、NF-κB、E2F、GATA-1等, 但缺乏CpG岛。双荧光素酶报告基因检测显示, Dnmt2核心启动子区位于–196~+81 bp, 对启动子区域进行活性检测发现, 在该基因启动子–640~–452 bp区域内可能存在促进基因表达的转录调控元件, 而在–1160~ –640 bp区域可能存在抑制该基因表达的转录调控元件。本研究结果为进一步研究Dnmt2启动子的表达调控机制提供理论依据。     

几种益生菌对大菱鲆幼鱼生长及消化酶活性的影响

作者以初体质量为(4.80±0.11)g 的大菱鲆(Scophthalmus maximus)为研究对象,在循环水水族箱中进行60 d 饲喂实验,研究饵料中添加单一益生菌和复合益生菌对大菱鲆生长及消化道酶活性的影响.以基础饲料为对照组,在基础饲料中分别添加枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌...