鱼类病原鳗弧菌致病相关因子及分子生物学

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是一种对水产鱼类危害严重的细菌病原,其流行区域广泛,能引起世界范围内的淡、海水鱼类及其它养殖动物发生弧菌病,常给水产养殖业造成巨大的经济损失。鳗弧菌的致病性与许多毒力因子有关,包括由质粒编码的铁吸收系统、细胞外溶血毒素、细菌鞭毛蛋白、胞外蛋白酶等。本文论述了鳗弧菌的主要致病性相关因子及研究进     

环境因子对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)粘附大黄鱼(Pseudosciaena crocea)表皮粘液影响的研究

采用3H-TdR同位素示踪方法研究了环境因子对溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液粘附作用的影响。试验结果表明,溶藻弧菌能很好地粘附于大黄鱼表皮粘液,其粘附量在菌浓度不超过6.52×108cfu/ml情况下随菌浓度的升高而升高;粘附量在25℃下孵育180min趋于饱和,在180min以内与孵育时间呈正相关关系;粘附作用在温度25—30℃、pH值偏酸、盐度35条件下较强;在无Na (盐度为0)时,无粘附作用;Ca2 能显著加强溶藻弧菌的粘附作用,而Mg2 作用不明显。这些结果表明,溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液有较强的粘附作用,其粘附作用受温度、盐度、pH值等环境因子的影响。     

仿刺参体腔细胞原代培养以及灿烂弧菌胞外产物对其毒性的研究

采用CCM、HSM和L-15N 3种培养液对刺参(Apostichopus japonicas)的体腔细胞进行了体外原代培养,并用MTT还原法对细胞的体外存活力进行测定,结果显示:CCM和HSM培养的体腔细胞,在体外分别存活至3 d和6 d大量死亡;L-15N培养液可使细胞在1周内保持存活.用刺参病原菌灿烂弧菌的胞外产物与刺参体外培养细胞共培育,发现对体腔细胞有毒性作用,半致死蛋白质浓度(IC_(50))为27.6 μg/mL.     

仿刺参养殖区泥样中灿烂弧菌拮抗菌的快速筛选及其保护作用

采用不同培养基和泥样加热方法,从红岛仿刺参养殖区泥样中分离出27株可培养细菌,对其进行16SrRNA基因序列分析。发现海泥中可培养细菌多分布于γ-变形菌纲(γ-proteobacteria)(占总菌数的71.4%),其中包括假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、弧菌属(Vibrio)和希瓦氏菌属(Shewanella)等;80℃加热处理20min,海泥中可培养细菌多属于芽孢杆菌属(Bacillus)。人工浸泡感染实验发现,泥样中灿烂弧菌LJ08(Vibrio splendidus)对仿刺参幼参具有致病性。泥样中分离获得的可培养细菌经安全性、抑菌活性和毒性检测,筛选出对灿烂弧菌LJ08有明显抑菌作用的LJ03、LJ04和LJ06并用其进行人工拮抗实验。统计分析显示,添加LJ03和LJ06拮抗组的累计排脏率分别为(36.11±4.81)%和(2.78±4.81)%,与仅添加灿烂弧菌LJ08的阳性对照组差异显著(P0.05)。结果表明,LJ03和LJ06具有很好保护仿刺参幼参的作用,尤其LJ06对仿刺参幼参的排脏保护率达104.7%。作为拮抗灿烂弧菌的潜在有益菌,LJ06在仿刺参养殖中将有良好的应用前景。     

环境因子对鳗弧菌生长和胞外蛋白酶表达的影响

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是一种水产动物的重要致病菌,鳗弧菌分泌的胞外蛋白酶是该菌的致病因子之一.研究了环境因子对鳗弧菌W-1生长及胞外蛋白酶表达的影响.结果表明,鳗弧菌的最适生长温度为28℃,菌体生长量在21 h达到最高,胞外蛋白酶的活力在24 h最高.在37℃培养时,菌体生长和酶活力显著降低;添加葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等碳源物质均能显著促进菌体的生长,但对于胞外蛋白酶表达有明显抑制作用;1 mmol/L EGTA对茵体的生长和胞外蛋白酶表达没有明显影响,而1 mmol/L的EDTA强烈抑制鳗弧菌的生长及其胞外蛋白酶的表达.添加不同浓度的氨苄青霉素对菌体的生长及其胞外蛋白酶表达有明显的抑制作用.     

河流弧菌(Vibrio fluvialis)对牙鲆(Paralichthys olivaceus)粘液的趋化和粘附作用

采用生长曲线法测定了河流弧菌在牙鲆表皮、鳃和肠粘液中的生长情况,结果表明,河流弧菌在3种粘液中都能生长,生长前期符合Logistic模型,然后进入Gompertz模型,在鳃粘液中的生长量高于肠粘液和表皮粘液。采用毛细管法研究了河流弧菌对牙鲆3种粘液的趋化作用,结果表明,河流弧菌对牙鲆3种粘液具有较强的趋化应答,在粘液总蛋白含量相同的情况下,河流弧菌对牙鲆鳃粘液的趋化应答显著强于对表皮粘液的趋化应答（P〈0．05）,而对肠粘液的趋化应答极显著低于对鳃粘液和表皮粘液的趋化应答（P〈0．01）。采用^3H—TdR示踪法进行了河流弧菌对牙鲆3种粘液的粘附作用研究,结果表明,河流弧菌对牙鲆表皮粘液和鳃粘液的粘附率较高,而对肠粘液的粘附率较低,特别是孵育30、60和90min时河流弧菌对牙鲆表皮粘液和鳃粘液的粘附率显著高于对肠粘液的粘附率（P〈0．05）。这些结果表明,河流弧菌能够在牙鲆粘液,尤其是鳃粘液中生长和定植,有利于其进一步感染、致病。     

河流弧菌(Vibrio fluvialis)对大黄鱼( Pseudosciaena crocea ) 鳃粘液粘附特性研究

采用间接ELISA法(最低检测值约104cfu)研究不同培养条件、不同培养阶段、抗体处理、营养饥饿等对河流弧菌粘附作用的影响。结果表明,经TSB培养的菌体的粘附作用极显著强于TSA培养的菌体的粘附作用(P<0.01);河流弧菌能很好地粘附于大黄鱼粘液,粘附量随菌浓度升高而增大并符合饱和粘附动力学:y=0.1782ln(x)1.6923(R2=0.9810);不同生长阶段河流弧菌的粘附能力不同,在培养初期阶段细菌的粘附量先是随着培养时间的延长而增大,并在培养24h后粘附量达到最大,而后随着培养时间的延长其粘附量急剧下降;抗体处理后河流弧菌的粘附量显著低于对照组(P<0.05);营养饥饿菌体的粘附量明显降低。以上结果表明:海水中的河流弧菌能很好地粘附于大黄鱼鳃粘液,其粘附作用受细菌培养条件、营养状况等自身因素的显著影响。本研究结果有助于了解河流弧菌的流行病学和致病机理。     

副溶血弧菌一种糖蛋白酶(复苏促进因子)在大肠杆菌中的表达及性质

用PCR方法从副溶血弧菌8621.4基因组中扩增出1种细胞复苏促进因子家族的糖蛋白酶(Glycoprotease,Gcp)基因,核酸序列分析表明其含有完整的gcp基因开放阅读框,编码233个氨基酸组成的蛋白质.核酸序列与副溶血弧菌糖蛋白酶家族基因的序列相似性为100％.其氨基酸序列与哈维氏弧菌HY01、弧菌Ex25、溶珊瑚弧菌、拟态弧菌和杀鲑弧菌LFI1238等糖蛋白酶的序列相似性为67％～92％.将该基因克隆到表达载体pET28a,在大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达,用Ni琼脂糖亲和柱层析纯化的蛋白为单一条带,利用纯化的Gcp免疫新西兰大白兔制备特异性抗体,Western-Blotting分析发现正常生长及活的非可培养状态(VBNC)诱导过程中的副溶血弧菌细胞内表达的Gcp蛋白为1条带,分子量约为27 kDa,而在VBNC状态的菌体中检测到2条蛋白带.研究结果为进一步探索海洋弧菌活VBNC的形成和复苏机制奠定基础.     

大黄鱼溶藻弧菌病组织中巨噬细胞移动抑制因子的检测及意义

本文应用免疫组织化学方法,对健康大黄鱼和患溶藻弧菌病大黄鱼组织中巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)蛋白进行了检测,以研究溶藻弧菌病大黄鱼组织中MIF的表达情况及其对预后的影响。结果表明,MIF在健康大黄鱼头肾、脾、肠各组织中均无表达;MIF在溶藻弧菌病大黄鱼各组织中高表达,表达强度从弱到强依次是肠、脾、头肾,MIF表达阳性率分别为:56%、64%、92%。推测MIF在大黄鱼溶藻弧菌病发病中发挥重要作用。     

拮抗菌对病原性溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)粘附大黄鱼(Pseudosciaena crocea)表皮粘液的影响

采用3H-TdR同位素示踪法研究了病原性溶藻弧菌和9株拮抗菌对大黄鱼表皮粘液的粘附动力学。结果表明,10株细菌的粘附作用都符合饱和粘附动力学特征;R4、R13和R32等3株拮抗菌的最大粘附量高于溶藻弧菌;9株拮抗菌的分离常数都高于溶藻弧菌;R32的亲和指数大于溶藻弧菌,其余8株拮抗菌的亲和指数都小于溶藻弧菌。测定了9株拮抗菌对病原性溶藻弧菌粘附大黄鱼表皮粘液的竞争、排斥和置换作用,结果显示:9株拮抗菌在竞争条件下都能极显著减少溶藻弧菌对表皮粘液粘附(P<0.01);在粘附排斥方面,R4、R13、J26、J28、J312、Y59等6株拮抗菌能显著排斥病原性溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液的粘附作用(P<0.05);在粘附置换方面,J26、J28等2株拮抗菌能极显著(P<0.01)降低病原性溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液的粘附量。研究结果表明,病原性溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液有较强的粘附作用;9株拮抗菌能够抑制溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液的粘附作用,其中竞争作用效果最好,排斥作用次之,置换作用的效果最差;拮抗菌对病原菌粘附的抑制效果受多种因素的影响,各菌株的粘附动力学参数有重要的影响作用。     

最小弧菌热不稳定型溶血素表达载体的构建和高效表达

根据已发表的最小弧菌热不稳定型溶血素（Vibrio mimicusheat-labile hemolysinVmhA）核苷酸序列,设计和合成一对特异性引物,以最小弧菌96-6-3的基因组DNA为模板,PCR扩增得到热不稳定型溶血素基因片段,克隆于表达载体PQE-2/VmhA中,转化大肠杆菌M15,经IPTG诱导,表达出预期大小50.2KD的融合蛋白.Westernblot检测显示,该蛋白与抗最小弧菌热不稳定型溶血素兔血清呈阳性反应,表明该蛋白具有溶血素的免疫原性,可作为基因工程疫苗的候选抗原.     

哈维氏弧菌的生物学特性、流行病学及检测技术

哈维氏弧菌是1种革兰氏阴性、发光的海洋细菌,广泛分布于海洋环境中。它是最近10多年才被认识到的水产养殖动物的重要致病菌。文中综述哈维氏弧菌的生物学特性、流行病学、致病机制、密度感应系统、检测技术、疾病的防治及其应用。     

哈维氏弧菌生物被膜体外模型的建立及成膜特性研究

采用改良微孔板法建立哈维氏弧菌Vibrio harveyi TS-628菌株生物被膜体外模型,并进一步研究环境因子对哈维氏弧菌体外形成生物被膜的影响。结果发现,哈维氏弧菌TS-628菌株可以在聚苯乙烯板中形成生物被膜,并且该菌生物被膜的形成受起始菌液浓度、温度、pH等理化因子的显著影响。温度为30℃、NaCl质量分数为3%—6%、pH为7、孵育时间为36h是哈维氏弧菌形成生物被膜的最佳条件。此外哈维氏弧菌在分别经表皮黏液、鳃黏液、肠道黏液、肝脏提取液、脾脏提取液、肌肉提取液包被的基质上成膜效果显著,其中在经肝脏提取液包被的基质上形成的生物被膜量显著高于在其他生物基质上形成的生物被膜量(p<0.01)。     

海洋弧菌HN897 β-琼脂糖酶基因vas1-1339异源表达及活性分析

海洋弧菌HN897株是一株高产琼脂糖酶的Vibrio astriarenae菌, 前期功能缺失实验证明其β-琼脂糖酶基因vas1-1339的缺失可显著降低弧菌HN897株的琼脂水解活性。文章在大肠杆菌中异源表达Vas1-1339基因编码蛋白, 分析该基因的表达及蛋白功能活性。首先, 构建含vas1-1339基因开放阅读框全长的表达载体pET28a-1339, 利用原核表达技术在大肠杆菌中成功地异源表达了Vas1-1339琼脂糖酶; 然后, 利用卢戈氏碘液染色分析发现异源表达Vas1-1339琼脂糖酶的大肠杆菌能够高效水解琼脂, 且异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)最优诱导浓度为10μmol·L^-1; 免疫印迹分析发现胞内基因表达产物羧基端可能存在切割现象, 推测Vas1-1339琼脂糖酶存在复杂的成熟过程。对纯化的琼脂糖酶活性分析发现海洋弧菌HN897株β-琼脂糖酶Vas1-1339能够独立发挥琼脂糖降解功能。     

哈维氏弧菌FlaA基因的克隆、序列分析及真核表达质粒的构建

哈维氏弧菌是水产病害中常见的致病菌.参照基因库上登录的弧菌鞭毛丝蛋白FlaA基因序列设计简并引物,PCR扩增哈维氏弧菌TS-628株的FlaA全基因,并克隆到pMD 18-T载体中测序,经序列分析该基因全长1 140 bp,编码379个氨基酸.与基因库中其他弧菌的同源基因序列比较显示,哈氏弧菌FlaA基因与霍乱弧菌FlaA基因的同源性最高(79.5%),该基因编码的多肽缺乏半胱氨酸,并在N-,C-两端的氨基酸序列较为保守,中间区域的变异较大.对该蛋白的氨基酸组成及空间结构进行了分析和预测,并推测该蛋白质的平均分子量为40.6 kDa.在该基因末端加上一段编码Flag短肽的核苷酸序列后克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),获得带哈氏弧菌鞭毛丝蛋白FlaA基因的真核表达重组质粒pcDNA-FlaA-tag,为其DNA疫苗的进一步研究奠定了基础.     

Cu2+和Zn2+对罗氏沼虾体外培养肌细胞的影响

研究了L-15和M199两种培养基对体外培养罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)肌细胞生长的差异。结果表明，L-15较M199更有利于罗氏沼虾肌细胞的生长。分别测定了不同浓度的Zn^2 (0～160ug／L)和Cu^2 (0～10ug／L)对罗氏沼虾离体培养肌细胞的影响，通过MTT法测定肌细胞的增殖．NBT法测定肌细胞活性氧的产生，结果表明，Zn^2 浓度为80～120ug／L时细胞的增殖效果较好，细胞内活性氧的产生最少；Cu^2 浓度为8ug／L时细胞的增殖达到最大，活性氧产生最少。     

白令海峡夏季流量的年际变化及其成因

白令海峡是连接太平洋和北冰洋的唯一通道,穿过海峡的海水体积通量在年际尺度上的变化主要取决于海峡南北两侧的海面高度差,白令海峡的入流对北冰洋海洋过程有重要的意义。利用SODA资料计算夏季白令海峡海水体积通量,对其年际变化及成因进行分析。结果表明夏季白令海峡的体积通量主要是正压地转的;当体积通量为正距平时,楚科奇海、东西伯利亚海、拉普捷夫海以及波弗特海南部海面高度为负距平,同时,白令海陆架海面高度为正距平;对这些海域的Ekman运动、上层海洋温度、盐度和垂直流速进行分析,发现海面高度异常与海峡体积通量的这种关系主要是与海面气压异常分布所产生的Ekman运动有关。当白令海峡的体积通量为正距平时,北冰洋中央海面气压为正距平,白令海海盆海面气压为负距平。这种气压的异常分布在一定程度上解释了上层海洋运动、海水温盐结构与白令海峡入流的关系,从而把夏季大尺度大气环流和白令海峡体积通量的年际变化联系了起来。