淋巴囊肿病毒实时定量PCR检测方法的建立和应用

选取淋巴囊肿病毒(Lymphocystis disease virus,LCDV)主衣壳蛋白(MCP)基因保守序列,利用Primer Express2.0软件设计引物,通过优化反应条件,建立了SYBR GreenⅠ实时定量PCR的检测方法,并进行了敏感性、特异性分析.SYBR GreenⅠ实时定量PCR反应体系的最佳引物浓度为0.5 μmol/L,方法的检测限为30个病毒拷贝,扩增产物的Tm值为74.5 ℃.该方法对淋巴囊肿病毒有特异性,不能扩增流行性造血器官坏死病毒(EHNV)、虎纹蛙病毒(TFV)、蛙虹彩病毒(BIV)、新加坡石斑虹彩病毒(SGIV)、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)及真鲷虹彩病毒(RSIV).对12份发病牙鲆鱼样品进行检测,均感染淋巴囊肿病毒;20份无临床症状的牙鲆经检测不含淋巴囊肿病毒.建立的LCDV的SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法,具有成本低、特异、灵敏、快速等优点,可用于淋巴囊肿病毒的早期诊断.     

利用牙鲆鳃细胞系分离和培养淋巴囊肿病毒

本文利用牙鲆鳃细胞系进行了养殖牙鲆淋巴囊肿病毒的分离及培养 ,并通过电镜对培养细胞中淋巴囊肿病毒的形态及感染循环进行了初步研究。将病鱼的淋巴囊肿组织无菌滤液接种牙鲆细胞系 ,细胞出现了明显的细胞病变 ( Cytopathic effect,CPE)。电镜观察在培养细胞的胞质中有病毒的包涵体 ,胞质中散在 6角形、5角形或圆形的病毒粒子 ,大小为 10 0～ 140 nm之间。在感染细胞的线粒体中也存在大量的病毒颗粒。     

海水网箱养殖鲈鱼淋巴囊肿病的初步研究

在 1996年调查的基础上 ,首次报道了浙江海水网箱养殖鲈鱼淋巴囊肿病的发病情况 :发病季节在 6～ 8月 ,1龄鱼苗发病率 70 %,死亡率 30 %。电镜观察表明 ,体表和鳍上的疣状物主要由淋巴囊肿细胞组成 ,细胞内充满虹彩病毒颗粒。肝细胞和肠上皮细胞内没有发现病毒颗粒 ,但溶酶体数量增多 ,肝细胞结构有部分损伤。本文还描述了虹彩病毒在肥大细胞内的增殖过程。     

云纹石斑鱼淋巴囊肿病的光镜和电镜研究

本文用光镜和电镜对海水网箱养殖患淋巴囊肿病的云纹石斑鱼(Epinethelus moara)进行了研究.分别观察了其囊肿物、皮肤、肝脏、脾脏、肾脏、心脏和肠管等器官.光镜下,可见囊肿物主要由巨大的囊肿细胞构成,这些细胞的细胞质内含有许多包涵体和空泡;肝脏汇管区炎性细胞浸润、肝细胞肿胀并有胞质嗜碱性小体出现;脾脏内白细胞滞留;肾小管变性、萎缩、坏死并形成大面积无肾小管区;心肌炎和心外膜炎等病理变化.电镜下,可见囊肿细胞含有大量的病毒颗粒,这些病毒颗粒散布于核周区域;病毒颗粒切面多呈6角形,核衣壳外大部分还具有一中等电子密度的囊膜,衣壳由3层构成,核髓有明暗相间的区带.本文还对该病与国外报道有差异的问题、病毒的形态和病鱼慢性死亡的病理学等方面作了讨论.     

应用单克隆抗体检测牙鲆血清中抗淋巴囊肿病毒的特异性抗体

应用杂交瘤单克隆抗体技术制备10株分泌抗牙鲆免疫球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。利用单抗2H4,通过间接酶联免疫法(ELISA)对牙鲆血清中抗淋巴囊肿病毒(LCDV)特异性抗体进行了检测。结果表明:无外观症状的牙鲆血清中特异性抗体水平很低(平均OD值为0.092),个别鱼体偏高,证明已感染LCDV,处于潜伏期;患淋巴囊肿病且症状显现的牙鲆血清中特异性抗体水平升高(平均OD值为0.165),患淋巴囊肿病后处于恢复期的牙鲆抗体水平最高(平均OD值为0.231);健康牙鲆接种LCDV灭活疫苗后,特异性抗体水平显著升高。     

牙鲆淋巴囊肿病毒靶器官上病毒结合蛋白的鉴定

利用抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体的间接免疫荧光检测技术,在患淋巴囊肿病牙鲆的表皮、鳃、胃、肠及肾中发现淋巴囊肿病毒的感染,以此确定为病毒感染的主要靶器官。用NP-40细胞裂解液分别抽提靶器官的总蛋白,利用病毒铺覆蛋白印迹技术(VOPBA)对靶器官上淋巴囊肿病毒结合蛋白进行鉴定,结果显示在胃、肠及肾的组织蛋白中均有1个分子量为27.8 kDa的蛋白与淋巴囊肿病毒特异结合,在鳃和表皮的组织蛋白中分别存在分子量为37.6 kDa和56.0 kDa的蛋白与淋巴囊肿病毒特异结合。推测在淋巴囊肿病毒靶器官上的这3种病毒结合蛋白有可能是病毒的受体蛋白。     

云纹石斑鱼淋巴囊肿病病变过程的超微研究

于1989—1990年，对海水网箱养殖的云纹石斑鱼自然感染和人工感染的淋巴囊肿病进行电镜观察。观察结果表明，自然感染和人工感染的淋巴囊肿细胞之间并无区别，它们均含有许多包涵体和病毒颗粒；主要描述用患淋巴囊肿病病鱼的皮肤结节匀浆对实验鱼作皮下注射而感染的淋巴囊肿病的超微病理过程，包括病毒颗粒在成纤维细胞胞膜上的附着和成纤维细胞及其内含物的形态变化等过程；此外，病鱼心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肠上皮也有不同程度的病理变化。     

云纹石斑针淋巴囊肿病病变过程的超微研究

于１９８９１－９９０年，对海水网箱养殖的云纹石斑鱼自然感染和人工感染的淋巴囊肿病进行电镜观察。观察结果表明，自然感染和人工感染的淋巴囊肿细胞之间并无区别，经们均含有许多包涵体和病毒颗粒；主要描述用患淋巴囊肿病鱼的皮肤结节匀浆对实验鱼 下注射而感染的淋巴囊肿病的超微病理过程，包括病毒颗粒在成纤维细胞胞膜上的附着和成纤维细胞及其内含物的形态变化等过程；此外，病鱼心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肠上皮也有不同程     

鱼类淋巴囊肿病毒靶器官的组织病理研究

探讨病毒传播途径,运用组织病理学技术,对患淋巴囊肿病毒病的牙鲆和鲈鱼的组织进行显微观察,并对病毒感染的靶器官进行了研究。结果表明,在牙鲆体表皮下结缔组织中,当大量成纤维细胞膨大、变圆,大小为10~18μm时,细胞膜外未出现囊壁,少数细胞的细胞质中观察到嗜碱性物质;18~20μm的膨大细胞在细胞膜外出现囊壁,细胞质内出现嗜碱性物质;>20μm的细胞具有了淋巴囊肿细胞的典型特征。另外,在牙鲆鳃、肠上皮下结缔组织和粘膜下层中,脾、头肾边缘组织和表面系膜、肝表面系膜,以及鲈鱼的鳃等部位均观察到淋巴囊肿细胞,并在牙鲆和鲈鱼脾内观察到膨大细胞。因此,淋巴囊肿病毒的靶器官主要是鱼体表皮下结缔组织,其次是鳃、体腔膜、肠、脾和头肾。鱼体表皮下结缔组织是淋巴囊肿病毒病的检测、检疫和早期诊断的最佳样品。     

应用单克隆抗体检测牙鲆血清中抗淋巴囊肿病毒

应用杂交瘤单克隆抗体技术制备10株分泌抗牙鲆免疫球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。利用单抗2H4，通过间接酶联免疫法（ELISA）对牙鲆血清中抗淋巴囊肿病毒（LCDV）特异性抗体进行了检测。结果表明：无外观症状的牙鲆血清中特异性抗体水平很低（平均OD值为0．092），个别鱼体偏高，证明已感染LCDV，处于潜伏期；患淋巴囊肿病且症状显现的牙鲆血清中特异性抗体水平升高（平均OD值为0．165），患淋巴囊肿病后处于恢复期的牙鲆抗体水平最高（平均OD值为0．231）；健康牙鲆接种LCDV灭活疫苗后，特异性抗体水平显著升高。．     

免疫细胞化学法测定鱼类淋巴囊肿病毒(LCDV)滴度

利用免疫细胞化学法测定鱼类淋巴囊肿病毒(LCDV)滴度.以牙鲆鳃细胞系(FG)作为感染细胞,将生长旺盛的FG细胞接种于48孔培养板中培养至形成细胞单层,用2倍连续稀释的LCDV粗提液分别接种FG细胞.固定各稀释度LCDV感染后的FG细胞,孵育抗牙鲆LCDV单克隆抗体,其后再运用生物素-亲合素反应系统,以碱性磷酸酶底物APRed试剂盒发色.倒置显微镜观察,被病毒感染的FG细胞的细胞质呈现红色,未被感染细胞的细胞质呈无色.记录各稀释度病毒感染的阳性细胞孔数,按Reed-Muench法计算组织细胞培养半数感染量(TCID0).结果显示,免疫细胞化学法测得LCDV在FG的滴度为1.77×210 TCID50/mL.该法可以用来有效测定LCDV滴度,且结果直观、准确性较好,灵敏度较高.     

养殖牙鲆淋巴囊肿病流行状况与组织病理学研究

１９９７～１９９８年,山东省烟台市和威海市４个养殖场的养殖牙鲆发生了一种危害很大的疾病。该病症状为患病牙鲆的眼睛、口腔内外、鳍及上下体表等部位有明显囊肿物。病症轻的牙鲆援食正常且有自愈现象,病症重的牙鲆基本不摄食、部分出现死亡。自愈牙鲆体质弱,在运输过程中死亡率超过了８０×１０－２,可以说失去了商品价值。据调查,发病养殖场的鱼苗系购自同一育苗场,而该育苗场则使用了韩国亲鱼进行鱼苗生产。病理组织切片表明,在囊肿细胞的胞质内有嗜碱性、具网状结构、形状不规则的包涵体。由于本病的症状和病理组织特征与国内外有关真鲷和石斑鱼等的报道基本一致,所以,本研究初步认为该病为淋巴囊肿病。     

淋巴囊肿病毒mcp基因变异特征及其基因型分析

淋巴囊肿病毒是引起多种海、淡水鱼淋巴囊肿病的病原,且不同淋巴囊肿病毒分离株间存在一定的差异。本文对25株淋巴囊肿病毒分离株mcp基因的变异特征进行分析,结果表明:分离自同一宿主的淋巴囊肿病毒mcp基因序列并非完全一致,有些同宿主分离株间存在着较少的变异,其MCP蛋白序列间的变异位点多位于不规则结构域、属于非蛋白相互作用位点;分属不同基因型淋巴囊肿病毒分离株MCP蛋白序列间的变异位点也多位于不规则结构域,变异位点为蛋白相互作用位点的比率仅占21.98%。金头鲷淋巴囊肿病毒分离株LCDV-sa是一种新的淋巴囊肿病毒基因型,此25株淋巴囊肿病毒可分为7个基因型。对淋巴囊肿病毒变异的研究,可加深对其感染机制的认识,有助于了解其传播途径,可为淋巴囊肿病的防控提供重要的理论依据。     

牙鲆的疾病

综述当前国内外报道的养殖牙鲆危害严重的主要疾病及其防治方法。按牙鲆的病毒病、细菌病、寄生原虫病、吸虫病等顺序分别叙述了各主要病害，尤其对危害严重的病害种类如：牙鲆弹状病毒病、肠道白浊病、鳗弧菌病、腹胀病、腹水病、牙鲆出血性败血病等进行了较为详细的记述，以期对牙鲆疾病的研究提供参考材料     

姬松茸提取物组分体外抗病毒感染活性的研究

为了探明姬松茸提取物的体外抗病毒感染活性及其作用方式,进而为水产养殖鱼类高效抗淋巴囊肿病毒(lymphocystis disease virus,LCDV)感染活性物质的开发和鲆蝶类淋巴囊肿病的防治奠定基础,利用热水浸提和酒精沉淀法得到了5种姬松茸提取物组分(E1～5),并利用MTT、细胞病变程度观察等方法研究了5种组分对LCDV感染体外培养大菱鲆鳍细胞(turbot fin cells,TF细胞)的影响作用.细胞毒性实验结果显示,5种组分对体外培养TF细胞均无毒性.细胞病变程度结果表明,本文所得5种姬松茸提取物组分尤其是E5组分具有显著的抗LCDV感染TF细胞的活性.不同方式感染的实验结果进一步显示,5种姬松茸提取物组分抗LCDV感染TF细胞的作用可能主要是通过直接灭活病毒和/或阻断病毒吸附细胞来实现的.     

褐牙鲆鳃氯细胞的超微结构研究

利用透射电镜技术，研究了褐牙鲆(Paralichthys olrvaceus)鳃氯细胞的超微结构特征。研究表明，褐牙鲆鳃氯细胞主要分布于鳃小叶基部，具有微细小管系统和分泌腔。有丰富的线粒体，细胞核基位。根据氯细胞结构的不同，将其分为4种类型：I型氯细胞、Ⅱ型氯细胞、Ⅲ型氯细胞和Ⅳ型氯细胞。I型氯细胞胞体较大，细胞基质密度较低。微细小管系统发达呈细管状；Ⅱ型氯细胞外形不规则。胞体较大，细胞基质密度较高，微细小管系统主要呈粗网状；Ⅲ型氯细胞外形不规则，细胞基质具有很高的电子密度，微细小管系统不发达，胞内存在大量线粒体，分泌腔小；Ⅳ型氯细胞为扁平状，细胞体积较小，具有较大的分泌腔，但微细小管系统不发达。褐牙鲆鳃氯细胞系统是主要的渗透压调节系统。     

大菱鲆与牙鲆育苗异同的研究

本文结合多年生产实践,比较了大菱鲆与牙鲆人工育苗的异同,在人工繁殖、发育特征、苗种培育、营养与饲料、疾病预防等方面进行了研究,从而为大力发展大菱鲆与牙鲆的人工育苗、提高苗种数量和质量提供技术参考。