雄性半滑舌鳎GH基因多态性与激素水平及生长性状相关性分析

以雄性半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)为研究材料,分析了其GH基因外显子区域的多态性,同时分析了各基因型与其体重、体长、激素水平等的关联性。PCR-SSCP和测序结果表明,外显子4有1个突变位点382bp(c.T382C)为非同义突变(p.Phe106Leu)。单因素方差分析显示,382bp位点与体重、去内脏重和血浆T3水平显著相关(P0.05)。通过多重比较,CC基因型体重和去内脏重((234.58±8.11)g和(210.23±7.55)g)显著高于TT基因型((201.64±13.04)g和(180.21±12.13)g);CC基因型(3.01±0.07)ng·mL-1的T3水平极显著高于TT基因型(2.12±0.12)ng·mL-1。结果表明,半滑舌鳎中GH基因的突变可以影响其激素水平和生长性状,382bp位点可以用作分子标记,从遗传学角度辅助半滑舌鳎优良品种的分子选育。     

雄性半滑舌鳎雄激素受体基因的克隆与表达分析

利用RT-PCR方法从半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)中克隆了雄激素受体(Androgen receptor,AR)基因cDNA的部分序列(434 bp),经BLAST比对与狼鲈(Dicentrarchus labrax)、花溪(Kryptolebias marmoratus)、三斑海猪鱼(Halichoeres trimaculatus)和三刺鱼(Gasterosteus aculeatus)的雄激素受体同源性分别为84%,82%,82%和81%.组织表达分析表明,AR基因在半滑舌鳎的性腺、肝、胃、脾、肾、头肾、肠、鳃、心、脑和肌肉这11种组织中均有表达,表达量有所差异.肾中表达量最丰富,鳃中最少.根据其他硬骨鱼类表达模式,推测半滑舌鳎可能只含有1种AR.     

半滑舌鳎des基因的表达及其启动子功能分析

利用NCBI上已经发表的半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)基因组及转录组序列,发现了半滑舌鳎两个有结蛋白(Desmin)基因(des和des-like),且des-like具有两个剪切型des-like_X1、des-like_X2。系统进化树及基因结构分析发现,半滑舌鳎的des基因和des-like基因分别与硬骨鱼的des基因和des-like基因聚为一支,物种间des和des-like氨基酸序列相似性分别在90%和85%以上。保守性与染色体共线性分析发现,半滑舌鳎的des基因和哺乳动物的des基因具有相同的起源,而其des-like基因是通过硬骨鱼的第三次全基因组复制获得的。qRT-PCR的检测分析发现,des基因在肠和心脏中表达量较高,在肌肉中只是痕量表达;而des-like基因则在心脏和肌肉中表达最高,在肠中痕量表达,说明des与des-like已经出现了功能的分化而且可能存在功能上的互补效应。有趣的是,des-like_X1只在心脏中表达,本研究推测des-like_X1对于半滑舌鳎的心脏发育具有重要作用。des基因呈现母源性表达,而des-like在胚胎发育早期表达量较低,从神经胚后表达量开始升高,此时是肌节与心脏发育的时期,说明des-like可能参与胚胎发育时期的肌节与心肌发育。此外,通过PCR克隆了半滑舌鳎结蛋白基因不同长度的启动子片段,并对其进行启动活性分析。结果表明,半滑舌鳎des基因ATG上游长度为667 bp的片段是其核心启动子,为进一步研究des基因的功能奠定了基础。     

10 个半滑舌鳎家系 MHC IIB 基因多态性初步研究

为检测10个半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)家系MHCⅡB(Cyse-DAB)基因的多态性水平、MHCⅡ类B位点数目以及平衡选择的作用,作者利用多聚酶链式反应(PCR)和直接测序的方法对10个半滑舌鳎家系MHCⅡB基因位点遗传变异和平衡选择进行了研究。用特异性引物和PCR扩增的半滑舌鳎MHCⅡB基因片段大约397 bp,包含一部分第一外显子,全部第一内含子和全部第二外显子。10个半滑舌鳎家系中,每家系选取5个体,每个体5个克隆序列分析发现60个不同序列,代表60个等位基因,其中有28个是新发现的,已提交到Gen Bank。同源分析表明60个等位基因相似性为89.36%。共50个个体中,有6个存在5个不同等位基因,表明在半滑舌鳎至少存在3个座位。有9个家系的MHCⅡB序列多肽结合区(PBR)的非同义替换(dN)显著高于同义替换(dS)。     

半滑舌鳎胚胎发育及仔鱼生长与盐度的关系

就半滑舌鳎(CynoglossussemilaevisGünther)受精卵和早期仔鱼生长发育与盐度的关系作了初步探讨。受精卵在盐度低于25的海水中全部下沉,在高于29的海水中浮在水面,而当盐度在26～28.5之间时在海水中呈悬浮状态。受精卵孵化的最适盐度为25～35,此盐度范围内孵化率都可达88%以上,盐度低于20或高于40孵化率降低,初孵仔鱼畸形率升高。盐度对仔鱼生长有一定的影响:盐度在25～35时初孵仔鱼存活率最高,盐度32.5时生长最好;盐度30～32.5范围内刚开口仔鱼的存活率较高,生长最快;盐度低于20时变态期仔鱼的存活率与盐度高于25时没有显著差异(P>0.05),但两者体长存在显著差异(P<0.05)。盐度高于40或低于10会延滞胚胎发育速率,孵化时间在盐度低于10时会相对延长。     

半滑舌鳎促黄体激素受体基因片段的克隆及组织表达分析

采用巢式RT-PCR法克隆了半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis促黄体激素受体(Luteinizing Hormonene Receptor, LHR)基因部分序列,经过BLAST比对,认为该序列与庸鲽、牙鲆、黑鲷、尼罗罗非鱼、青鳉和红鳍东方鲀的LHR基因同源性分别为97%,94%,85%,83%,82%和80%.该基因片段长度为614 bp,编码204个氨基酸,含有典型的跨膜螺旋结构区域(TM helix),属于糖蛋白激素受体(GHR)家族.组织表达分析表明,LHR基因在半滑舌鳎的卵巢、精巢、肝脏、胃、肠、鳃、心、脾、肾、头肾和脑中均有表达,表达量有所不同,以脾和肾中表达量最丰富.     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)Patched 1基因的克隆和表达分析

Hedgehog(Hh)信号通路在脊椎动物和非脊椎动物发育过程中细胞信号传导方面发挥重要的作用。Patched 1 (Ptc1)基因是Hh的受体,通过和Hh配体结合调节Hh信号通路。本研究克隆和鉴定了半滑舌鳎的Ptc1基因(csptc1),该基因cDNA全长为5212 nt,编码蛋白包括1543个氨基酸残基,序列比对和进化分析显示该蛋白在进化过程中较为保守。荧光定量显示该基因在脑,肝脏,心脏,鳃,肠,脾脏、肾脏和性腺组织中普遍表达,在精巢中的表达水平显著高于卵巢。精巢中的原位杂交信号主要位于该基因主要在初级精母细胞,次级精母细胞和支持细胞中,而在卵母细胞中的信号较弱。Csptc1基因在卵巢中的甲基化水平高于在雄鱼和伪雄鱼精巢中。这一研究结果可能说明csptc1基因参与了 Desert Hedgehog (DHH)基因维持雄鱼和伪雄鱼的生殖细胞系以及精子发生等生物学过程。     

半滑舌鳎3个形态性状与体质量的相关及通径分析

为了深入认识半滑舌鳎形态性状与体质量之间的关系,本研究使用831尾12月龄左右半滑舌鳎个体的体质量[BM(g)]和形态性状,包括全长[TL(cm)]、体高[BH(cm)]、体厚[BW(cm)],通过模型拟合筛选获得能够反映雌、雄性个体各个形态性状与体质量关系的最佳模型。建立了以形态性状为自变量、体质量作为因变量的回归方程,并计算了直接、间接通径系数和决定系数。模型拟合结果显示,雌、雄个体全长、体高和体厚与体质量的最优拟合模型都为幂函数曲线模型,雌性个体3个形态性状与体质量的最优模型分别为:y⌒=0.004x3.090、y⌒=0.382x2.983、y⌒=61.912x2.461;雄性个体的3个最优模型公式依次为:y⌒=0.005x3.003、y⌒=0.300x3.147、y⌒=57.681x2.156。通径分析结果显示,雌性个体中体高对体质量的直接影响最大,通径系数为0.535,而雄性个体全长对体质量的直接作用最大,通径系数为0.407。雌、雄个体的3个形态性状对体质量都有极显著的直接作用,其最优多元回归方程:雌性为BM=-88.530+1.297 TL+15.862 BH+39.021 BW;雄性为BM=-71.579+2.587TL+7.351 BH+35.595 BW。     

适宜浓度的维生素E促进半滑舌鳎生长激素基因的表达

本实验旨在探究维生素E对半滑舌鳎垂体组织中生长激素基因表达的影响。作者在每千克等氮等能的基础饲料中分别添加0、400和1 600mg的DL-α-生育酚乙酸酯(维生素E)投喂半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)成鱼(464±2.6) g,进行为期8周的养殖实验;另外,在L-15培养基中添加0、18和54μmol/L的维生素E,对半滑舌鳎成鱼(464±2.6) g的垂体细胞进行为期3 d的体外原代培养实验。分别取垂体组织和原代细胞,通过荧光实时定量PCR分析其gh mRNA的相对表达量。实验结果表明:垂体组织中gh mRNA的相对表达量随着饲料中维生素E含量的增加而呈现先升高后下降的变化趋势,在400 mg/kg组时显著高于其他各组(P0.05);随着细胞培养液中维生素E浓度的升高, gh mRNA的相对表达量显著增加(P0.05)。由此可见,适宜浓度的维生素E能够促进半滑舌鳎垂体组织中生长激素基因的表达。     

半滑舌鳎骨形态发生蛋白2基因的克隆、表达分析及启动子活性分析

骨形态发生蛋白2（BMP2）在脊椎动物的骨形成、尤其是诱导成骨方面具有至关重要的作用。本研究克隆了半滑舌鳎（Cynoglossussemilaevis）BMP2基因的cDNA序列,分析其在半滑舌鳎成鱼的组织表达差异及其在早期发育阶段的定位和表达变化趋势,并检测了其启动子活性。研究结果表明,半滑舌鳎BMP2基因cDNA全长为2048bp,编码422个氨基酸。BMP2mRNA在半滑舌鳎成鱼的14个组织中具有广泛的分布,并在脊髓中表达量最高。此外,BMP2基因在早期胚胎发育阶段（原肠期）具有极高水平的表达,其表达量约为其他发育阶段表达量的10倍。整体原位杂交检测结果表明,BMP2mRNA在1日龄仔鱼主要在冠状幼鳍、心和肝表达,在脊索有微量表达;随后,3日龄仔鱼的BMP2mRNA主要表达于脊索。通过对BMP2基因5''上游调控区片段进行启动子活性分析,发现了-179～+109片段可能包含启动子活性增强原件,生物信息学预测该片段包含的锌指转录因子等可能参与了BMP2的转录调控。     

半滑舌鳎三倍体诱导研究

采用冷休克抑制第二极体排出的方法诱导了半滑舌鳎三倍体,并探讨了三倍体诱导的最佳条件.通过流式细胞仪倍性检测和染色体观察验证各组三倍化率.结果显示:在受精后5 min开始,将受精卵放在4℃海水中进行冷休克处理,持续时间为20 min,三倍体诱导率最高为35％.通过对三倍体染色体进行分析,辨认其雌雄染色体型为ZWW/ZZZ,出现频率为1∶1,没有发现ZZW型雌鱼,暗示半滑舌鳎Z染色体和W染色体之间的交叉和互换受到严重抑制.     

半滑舌鳎封闭式循环水养殖系统的设计与应用

设计了生物承载量为45t、养殖密度为45kg/m3的半滑舌鳎封闭式循环水养殖系统,对养殖半滑舌鳎8个月的水处理效果进行测定和分析。循环水系统设计主要参数为:养殖半滑舌鳎3万余尾,补水量53m3/d,补水率约5%,供氧量7.4kg/h,循环量1 281m3/h,循环次数为20次/d,生物过滤器有效体积为106m3。经系统处理后,养殖池内水温为18～21℃,pH=7.0～8.0,DO≥6.6mg/L,养殖池进水氨氮0.017～0.178mg/L,亚硝酸氮0.012～0.064mg/L,细菌0～220个/mL,弧菌0～30个/mL。系统的水处理效果达到了养殖鱼对水质的要求。试验期间,共投喂饵料34 511kg,饵料系数1.1。试验结束时,生产半滑舌鳎成鱼41 469kg,与传统养殖模式相比,提高了养殖产量。本系统在水产养殖生产中具有一定的借鉴和推广使用价值。     

程序化设计的简并引物克隆半滑舌鳎CYP17基因

采用1种新的简并引物设计方法--CODEHOP法来克隆半滑舌鳎CYP17基因.该法结合NCBI、Blastp、BlockMaker、CODEHOP等生物信息学资源和DNAMAN、Oligo6.0等生物软件,程序性设计半滑舌鳎CYP17基因的CODEHOP引物,从半滑舌鳎卵巢组织中成功克隆了CYP17基因,该基因片段与其它物种的CYP17家族具有较高的同源性,经鉴定,该基因属于整个脊椎动物的CYP17基因群,尤其是鱼类亚群.实验结果表明,程序性设计的简并引物较传统简并引物特异性更高,假阳性率少,更有利于实验成功.     

半滑舌鳎稚鱼脂肪分解关键酶基因的克隆及饲料中脂肪水平对其表达的调控

克隆了半滑舌鳎脂肪分解关键酶基因即激素敏感脂肪酶(Hormone-sensitive lipase,HSL)和脂肪甘油三酯脂肪酶(Adipose triglyceride lipase,ATGL)cDNA部分序列,并探讨了饲料中脂肪水平对半滑舌鳎稚鱼HSL及ATGL基因表达的影响。克隆所得到的HSL和ATGL片段长度分别为589bp和581bp,序列和系统进化分析表明半滑舌鳎的HSL和ATGL与大部分鱼类具有较高的同源性。采用不同水平的鱼油配制成5种不同脂肪水平(6.68%、9.84%、13.47%、17.89%和21.88%干物质)的等氮饲料,饲养35日龄半滑舌鳎稚鱼30d,养殖过程中每天饱食投喂5次,养殖实验结束后采用实时荧光定量PCR分别测定各处理稚鱼内脏团的HSL及ATGL mRNA相对表达量。结果表明,高脂饲料组(21.88%)显著促进了半滑舌鳎稚鱼内脏团HSL基因的表达(P0.05),但饲料脂肪水平对于半滑舌鳎稚鱼内脏团的ATGL表达量未产生显著影响(P0.05)。     

牙鲆GHR基因Promoter区微卫星序列多态性与生长性状关系的初步研究

采用牙鲆GHR基因5'端Promoter区的1个微卫星标记,对胶南和日照2个牙鲆养殖群体进行了群体遗传多样性的研究,并探索该基因多态性位点与牙鲆生长性状之间的相关性.结果表明,2个群体在该座位的等位基因数为12和9个,有效等位基因数为6.26和5.04个,多态信息含量为0.84和0.80.2个群体该座位的Hardy-Weinberg遗传偏离指数均为正值,并没有显示出杂合子缺失,但各基因型分布频率都在一定程度上偏离Hardy-Weinberg平衡(P<0.01).连锁分析中发现,在胶南群体中,IM基因型对应的个体在全重、全长、体长、头长、体高和眼径形态学数据中均是最大的;在日照群体中,BC基因型对应的个体在全重、全长、体高、尾柄高、尾柄长和眼径数据中均是最大的;而CJ基因型对应的个体在体长和头长这两组数据中是最大的.该结果为研究GHR基因的变异对鱼类生长发育的影响及探索将该基因作为生长遗传标记的可行性奠定了实验基础.     

饲料维生素C添加量对半滑舌鳎幼鱼存活、生长、及组织中抗坏血酸含量的影响

在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)基础饲料中添加0、10、50、150、450和1 500 mg/kg的维生素C(维生素C多聚磷酸酯形式),制成6种实验饲料,分别对初始体质量为(4.21士0.02)g(实验Ⅰ)、(116.93±0.91)g(实验Ⅱ)2个规格各6组半滑舌鳎进行10周的摄食生长试验.每组设3个重复,每个重复分别60尾(实验Ⅰ)、18尾(实验Ⅱ),研究饲料中维生素C对半滑舌鳎幼鱼存活、生长和组织中抗坏血酸含量的影响.结果表明,实验Ⅰ中,半滑舌鳎的存活率、增重率、特定增长率和饲料转化率随着饲料中维生素C添加量增加,有上升趋势,但差异不显著(P＞0.05).肝脏、肾脏、肌肉中抗坏血酸含量均随饲料中维生素C添加量增加而显著上升(P＜0.05);实验Ⅱ中,半滑舌鳎的存活率、饲料转化率随饲料中维生素C添加量增加有上升趋势,但差异不显著(P＞0.05),增重率和特定生长率不受饲料中维生素C显著影响(P＞0.05).当饲料中维生素C添加量超过50 mg/kg时,随添加量增加肝脏、肾脏、肌肉中抗坏血酸含量均显著上升并高于对照组(P＜0.05).以上结果表明在本实验条件下,半滑舌鳎幼鱼基础饲料中无需添加额外的维生素C即可满足幼鱼正常生长发育的需要.