白肛海地瓜(Acaudina leucoprocta) 精氨酸激酶的基因克隆与表达

精氨酸激酶是调节能量代谢的重要酶类,在无脊椎动物体内能量平衡过程中起重要作用。利用PCR扩增技术,从白肛海地瓜的cDNA文库中克隆得到精氨酸激酶(arginine kinase)基因,其全长为2139bp,包括5′非翻译区(5’-UTR)序列92bp,3′端非翻译区(3’-UTR)序列934bp和1113bp的ORF,编码371个氨基酸,预测分子量大小和等电点分别为42.32kDa和7.19。构建了精氨酸激酶原核表达质粒并转化表达菌株,经IPTG诱导表达后,获得了与预期的分子量大小一致的表达产物。利用该目的蛋白制备了白肛海地瓜精氨酸激酶的特异性多克隆抗体,经Western blot证明该蛋白为精氨酸激酶。     

泥蚶(Tegillarca granosa)GT微卫星位点的筛选和性质鉴定

采用磁珠富集法,利用生物素标记的(GT)15寡核苷酸探针从泥蚶基因组DNASau3A1酶切的500—1000bp片段中筛选GT/CA微卫星位点。洗脱的杂交片段克隆到PMD18-T载体上构建富集微卫星基因组文库后,通过PCR筛选检测出阳性克隆进行测序。在139条序列中有115条序列包含有重复次数不少于5次的微卫星位点,阳性序列比例达到82.7%。其中perfect类型微卫星最大的重复次数为35次。在112条非冗余序列中,共有100条(88.5%)微卫星重复序列两端有侧翼序列能够进行引物设计。     

泥蚶(Tegillarca granosa)主要经济性状遗传参数的估算

采用巢式设计和人工控制授精方法构建了19个半同胞和41个全同胞泥蚶家系,研究了泥蚶各发育阶段生长性状遗传力及性状间遗传相关和表型相关。结果表明,泥蚶家系间各个阶段生长性状均存在一定变异,总体表现生长早期家系间变异较大,发育至后期家系间变异明显降低。在遗传力参数上,表现为体尺性状遗传力大于体重性状,如11月龄壳长、壳高、壳宽遗传力分别为0.298、0.313和0.257,而湿重遗传力仅为0.138;在体尺性状中,则表现为壳长、壳高的遗传力高于壳宽,如4月龄壳长、壳高遗传力分别达到0.378和0.357,而壳宽为0.312。各性状之间表型相关和遗传相关分析表明,不同发育阶段各性状表型相关系数都达到了极显著水平,而在遗传相关上,早期稚贝遗传相关系数均达极显著水平,发育至后期遗传相关系数变小。     

泥蚶(Tegillarca granosa)生长因子受体结合蛋白2(GRB2)基因的克隆与表达分析

通过已构建的泥蚶(Tegillarca granosa)转录组文库, 利用SMART RACE技术扩增得到泥蚶Tg-GRB2基因的全长cDNA序列, 并对其生物信息学、组织表达及发育阶段表达特征进行了分析。结果表明, 泥蚶Tg-GRB2 cDNA全长1283bp, 开放阅读框为708bp, 编码236个氨基酸; 蛋白结构预测显示, Tg-GRB2蛋白包含SH3-SH2-SH3三个功能域, SH2结构域由两端的α-螺旋和中间反向平行的β-折叠片构成, SH3结构域主要由β-折叠片组成, 具备典型的结构特征; 氨基酸序列比对发现, Tg-GRB2与脊椎动物的同源性为62.1%—63.8%, 而与玻璃海鞘和日本血吸虫同源性较低。qRT-PCR检测结果显示: Tg-GRB2 mRNA在泥蚶血液、斧足、鳃、外套膜、闭壳肌、内脏团6个组织中都有表达, 而在血液中的表达量极显著地高于其它组织; 在泥蚶的不同发育阶段中, Tg-GRB2 mRNA在 2—4细胞胚胎、原肠胚、担轮幼虫、D形幼虫中均有较高的表达量, 而在D形幼虫中表达量最高, 表明Tg-GRB2基因在泥蚶早期发育中发挥重要调节作用。     

中国沿海不同地区泥蚶(Tegillarca granosa)的遗传多样性分析

以采自海南海口、广西防城港、广西北海、广东湛江、福建漳州、山东荣成、山东威海7个地理群体62个泥蚶个体为材料,获取592bp线粒体COI基因片段序列,并进行遗传多样性及分化分析。多态性遗传参数统计显示:62个个体共检测出103个多态性位点,定义了26个单倍型;总群体单倍型多样性指数为0.834,核苷酸多样性指数为0.01665,平均核苷酸差异数为9.85772。7个群体均显示出较丰富的遗传多样性,群体内遗传距离及群体内遗传多样性参数显示中国沿海泥蚶遗传多样性由北向南呈升高趋势,而群体内遗传分化系数也呈现升高的趋势。基于26个单倍型COI序列构建的NJ树和UPGMA树以及基于群体间遗传距离构建的UPGMA树显示,荣成群体和威海群体亲缘关系较近,聚成一小支,而后与漳州群体相聚,然而南方类群并没有聚为独立的一支。     

泥蚶(Tegillarca granosa)血细胞转录组序列中免疫相关基因的结构与mRNA表达量分析

贝类血细胞直接参与异物吞噬和包囊作用,还在伤口修复、炎症反应过程中发挥重要作用,是机体免疫防御的承担者。本研究采用RNA-seq测序技术研究了鳗弧菌感染前后泥蚶血细胞的转录组序列,通过序列组装,获得了α-葡萄糖苷酶(GAA)、α-甘露糖苷酶(LAMAN)、芳基硫酸酯酶B(ASB)、天冬酰胺氨基葡萄糖酶(AGA)、整合素β3亚基(ITB3)、热休克蛋白9(HSPA9)和Toll相互作用蛋白(TOLLIP)序列,利用Orffinder获得了其编码蛋白序列,并对蛋白序列进行了理化性质、二级结构、保守结构域和三级结构分析。结果表明:7种蛋白质二级结构均含有α螺旋、β折叠及无规则卷曲,泥蚶和人类ITB3和TOLLIP具有相同的保守结构域, Swiss-model同源建模获得的三级结构与模板同源性均超过35%(TOLLIP除外)。鳗弧菌刺激后,GAA、LAMAN、ASB、AGA和HSPA9的表达量显著增加,ITB3和TOLLIP表达量变化不明显。该研究补充和完善了对泥蚶免疫相关基因的认识,并为进一步开展泥蚶抗病机理研究提供了重要的理论依据。     

地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)对镉胁迫下泥蚶(Tegillarca granosa)的抗氧化酶活性和免疫相关基因表达的影响

本文研究一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)对提高泥蚶耐受镉(Cd2+)胁迫的作用,实验分析了不同浓度地衣芽孢杆菌对Cd2+胁迫下泥蚶(Tegillarca granosa)的存活率及组织中Cd残留量的影响;同时比较了地衣芽孢杆菌作用前后,泥蚶体内两类抗氧化酶,超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性,进一步通过Real-time PCR分析了三类免疫相关基因金属硫蛋白(MT)、小热休克蛋白分子(sHSP)和铁蛋白(ferritin)的表达情况。研究结果显示,地衣芽孢杆菌能降低泥蚶组织中Cd残留量,提高其存活率。并能有效促进泥蚶体内SOD和GSH-Px酶活性的增加,同时降低MT、sHSP和ferritin在mRNA水平上的表达。数据表明该地衣芽胞杆菌可通过调节泥蚶的免疫系统,起到降低Cd2+对泥蚶毒害的作用。     

泥蚶(Tegillarca granosa)个体发育过程中同工酶基因表达与调控的研究

采用不连续垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳法，对泥蚶(Tegillarca granosa Linnaeus)19个发育阶段的ADH、LDH、EST、IDH、ALP、MDH、GDH、POD、ATPase和ME等10种同工酶的基因表达进行检测分析。结果表明，泥蚶在个体发育过程中随着机体分化和生理活动的改变，同工酶基因的表达呈现出显著的时序变化。在10种酶中，LDH和ATPase两种酶的所有酶带及EST、MDH和ME等的部分酶带在各个发育阶段持续表达，其他酶带只出现在发育阶段的某一或某些阶段，并且表现出了与泥蚶营养方式、代谢形式等生理活动的关联性。在泥蚶的个体发育阶段过程中，IDH、MDH、GDH、ME、ALP等5种酶在32细胞期表达的酶带数剧增，因此32细胞期可能是合子基因表达启动的时间；ADH、EST、LDH、MDH、GDH、ME等6种酶在泥蚶的附着变态期酶带大幅减少或产生新酶带，可能与泥蚶附着期运动方式、代谢强度及生活环境的改变有关。     

泥蚶(Tegillarca granosa)血红蛋白基因(Tg-HbIIA)克隆、分析及免疫表达研究

通过已构建的泥蚶血液cDNA文库,克隆得到泥蚶Tg-HbIIA基因全长cDNA序列,对其进行生物信息学、组织表达及免疫相关分析。结果表明,泥蚶Tg-HbIIA cDNA全长731bp,包含63bp5′非编码区(5′-UTR),246bp3′非编码区(3′-UTR),开放阅读框450bp,编码150个氨基酸;其氨基酸序列与毛蚶(Scapharca kagoshimensis)和不等壳毛蚶(Scapharca inaequivalvis)的序列有较高的同源性,分别达到89%和88%;对其结构预测显示该蛋白具有血红蛋白功能域,含有10个潜在血红素结合位点。qRT-PCR检测结果显示:泥蚶不同组织部位中,Tg-HbIIA mRNA在血液表达量最大,其次为外套膜和鳃,表达量最低的是肝胰脏;在副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticu)、脂多糖、肽聚糖刺激后,泥蚶血液Tg-HbIIA mRNA表达量显著上调,表明Tg-HbIIA在贝类抗菌免疫防御中可能起重要作用,而Tg-HbIIA对不同致病因子免疫反应的灵敏度和表达时序存在一定差异。     

泥蚶同工酶谱在不同组织的差异研究

用聚丙烯酰胺电泳法对泥蚶5种组织中的19种同工酶进行检测分析,发现除其中4种酶未显示任何有活性的区带,两种酶只显示极微弱且不稳定的区带外,其他种酶类在各个组织中都显示出清晰稳定的图谱,且这些酶在分布和活性上均表现出高度的组织特异性,说明泥蚶组织中已存在相当丰富和完整的酶系统,基本具备了与高等动物相类似的机体代谢方式,而且这些酶基因的表达存在着组织分布上的自我调控机制.同时与其他贝类和高等动物相比,泥蚶的同工酶基因的表达既表现出了与其分类地位相一致的特征,又反应出在分类阶元上的特殊性.     

泥蚶(Tegillarca granosa)6个微卫星引物的分离和鉴定

应用6个微卫星标记在奉化泥蚶种群上进行扩增,以检测其遗传信息。扩增结果表明,引物所扩增出的等位基因数目变化从3个到7个,平均等位基因数目为5．4。引物的多态性信息含量范围为0．111-0．814。最大的观察杂合度风为0．690,最小为0．121。期望杂合度风范围为0．117-0．848。位点TMP22显著偏离了哈代-温伯格平衡。6个引物在18个马来西亚泥蚶上进行扩增,结果只有TMP18和TMP36在马来西亚模板上有扩增产物。     

泥蚶(Tegillarca granosa)基因组SSR和EST-SSR的开发及比较研究

采用SSPHunter软件在泥蚶(Tegillarca granosa)磁珠富集文库和454转录组文库中搜索核心序列长度12bp以上的2—6核苷酸重复序列,根据富集文库所得基因组SSR侧翼序列设计47对引物,可成功扩增17对且均为多态性引物,多态率100%,平均等位基因数(Na)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、多态性信息含量(PIC)分别为6.8、0.468、0.785、0.733。11344条EST序列中得到1683个SSR位点,检出率14.83%,平均每3.85kb出现1个位点。根据部分EST序列设计120对引物,62对可扩增出目的片段,其中29个位点具有多态性,多态率为46.77%,平均Na、Ho、He、PIC分别为4.2、0.372、0.554、0.500,均低于基因组SSR。双变量相关性分析的结果表明,46个多态性SSR位点的核心序列长度与其Na、Ho、He、PIC极显著正相关,Spearman相关系数分别为0.632、0.387、0.657、0.6640     

泥蚶(Tegillarca granosa)遗传连锁图谱的构建

采用AFLP标记技术结合"拟测交"策略,对泥蚶父、母本和109个F1全同胞个体进行了遗传连锁的分析研究,构建了泥蚶的遗传连锁图谱。结果表明,在638个分离标记中,符合1:1孟德尔分离类型位点的母本和父本分离标记分别为235和259个;3:1孟德尔分离类型位点59个。雌性图谱包括21个连锁群,标记间平均间隔为8.12cM,图谱共覆盖1737.8cM,覆盖率为83.1%;雄性图谱包括20个连锁群,标记间平均间隔为5.81cM,图谱共覆盖1388.2cM,覆盖率为84.7%。     

泥蚶(Tegillarca granosa)重组铁蛋白富集锰铁后的磁学性质解析

利用埋栖性双壳类生物泥蚶(Tegillarca granosa)重组铁蛋白富集锰铁的性质,在不同锰铁浓度下制备Fe-铁蛋白和Mn-铁蛋白磁性纳米颗粒,通过扫描电镜观察高、中和低三个浓度下制备Fe-铁蛋白和Mn-铁蛋白磁性纳米颗粒的表面形貌,通过PPMS综合物性测量系统测定Fe-铁蛋白和Mn-铁蛋白磁性纳米颗粒的磁学性质。结果显示,在低浓度(0.1mmol/L)锰铁制备的Fe-铁蛋白和Mn-铁蛋白磁性纳米颗粒粒径均一,分散性好;发现Fe-铁蛋白和Mn-铁蛋白的磁滞回线均表现为超顺磁性,且随着重组铁蛋白对锰铁富集量的增加,磁性强度随之增大,增加速率逐渐减小。通过本实验探索高、中和低三个浓度下制备Fe-铁蛋白和Mn-铁蛋白磁性纳米颗粒的磁化强度变化规律,为Fe-铁蛋白和Mn-铁蛋白磁性纳米颗粒的应用提供数据支持。     

泥蚶(Tegillarca granosa) cDNA 文库的构建及铁结合蛋白基因(Ferritin)序列分析

取正常泥蚶肌肉组织获得总RNA,纯化mRNA后,利用含SfiⅠ酶切位点的CDSⅢ引物逆转录合成cDNA第一链,通过LD—PCR合成cDNA双链,经胶回收除去短片段,与pDNR—LIB载体进行连接,电转化到大肠杆菌DH10B中,构建形成原始文库,进行滴度测试和重组率鉴定。结果表明原始文库的滴度为3．17×10^5cfu／ml,重组率为86．3％,插入片段多在500--2500bp间。随机挑选458个克隆测序,经分析获得94种已知基因及87种未知基因。其中包括铁结合蛋白（Ferritin）的全长cDNA序列。该基因序列全长895bp,5’-端非编码区为163bp,3’-非编码区为213bp,开放阅读框为519bp,编码172个氨基酸。推测其蛋白分子量和等电点分别为20kDa和4．89。氨基酸序列与皱纹盘鲍、太平洋牡蛎、血红扇头蜱、文昌鱼、中华蟾蜍、非洲爪蟾、小家鼠以及人等的同源性有62％-82％。比对结果表明,铁结合蛋白基因在动物进化中高度保守。     

投喂海水小球藻和三角褐指藻对泥蚶成贝镉排出的影响

通过监测泥蚶不同组织器官镉含量的变化及构建相应泥蚶镉排出动力学模型,研究了投喂两种饵料微藻——海水小球藻(Chlorella salina)和三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)对泥蚶(Tegillarca granosa)成贝镉排出的影响。结果表明:投喂饵料微藻对泥蚶外套膜、鳃、内脏团和肌肉的镉排出均有明显促进作用(P0.05),且投喂混合藻种的效果优于投喂单一藻种。经10d暂养净化后,泥蚶不同组织器官的镉排出率大小依次为内脏团鳃外套膜肌肉,其中投喂混合藻时可食用部分(即肌肉部分)的镉排出率和动力学模型拟合得到的排出速率均比不投喂饵料微藻的对照高出1倍左右[30.02%vs16.13%;0.036μg/(g·d)vs0.017μg/(g·d)];同时,通过上述动力学模型还可算得,投喂饵料微藻的泥蚶体内镉的生物半衰期可比对照组缩短14—22d,其食用部分预期达标时间可缩短12—13d。