马氏珠母贝免疫活性肽的纯化与鉴定

为制备马氏珠母贝免疫活性肽,以马氏珠母贝全脏器为原料,利用体外模拟消化的方法对其进行酶解,然后通过超滤系统收集分子量小于3 ku的酶解液。采用细胞培养方法,以体外免疫活性为指标,利用Sephadex G-25凝胶柱层析、Capto Q强阴离子交换色谱等对马氏珠母贝酶解液进行分离纯化与筛选,获得2个具有免疫活性的肽段,利用电喷雾静电场离子阱串联质谱分别对2个活性肽序列进行测定。结果表明:一个肽的相对分子质量为245.0,肽序列为Ala-Arg/Pro-Met;另一个别肽的相对分子质量为274.0,肽序列为Val-Arg。在浓度0.3 mg/m L时,2种肽能显著促进脾淋巴细胞的增殖与提高巨噬细胞的吞噬能力,表明这2种肽均具有较好的免疫活性。     

琥珀酰化修饰对马氏珠母贝植核免疫的影响

【目的】研究蛋白质琥珀酰化修饰在马氏珠母贝（Pinctada fucata martensii）植核后免疫应答中的作用,为阐明珍珠贝植核反应的分子调控机制提供理论依据。【方法】通过对马氏珠母贝注射琥珀酸钠模拟提高琥珀酰化修饰水平,检测马氏珠母贝植核后鳃组织总蛋白琥珀酰化程度、免疫相关基因表达、抗氧化相关酶酶活以及珍珠贝的存活率和留核率。【结果与结论】注射琥珀酸钠后,鳃组织琥珀酰化修饰水平在12 h和72 h显著上升;使用实时荧光定量PCR检测胁迫应激相关基因的时序表达,胁迫应激相关因子SOD和Caspase2在6 h表达量显著上调,NF-κB和IRAK1在48 h表达量显著上调,TRAF3和IκK的表达量在96 h显著上调（P <0.05）,表明琥珀酰化修饰水平提高后受体贝机体细胞免疫增强;抗氧化相关酶、过氧化物酶和谷胱甘肽活性都在96 h出现显著上调（P <0.05）,表明受体贝体液免疫增强。与对照组[磷酸盐缓冲溶液（PBS）+植核]和植核组相比,实验组（琥珀酸钠+植核）中珍珠贝的存活率在7 d和45 d存在显著差异,在60 d留核率显著上升（P <0.05）。结果...     

珍珠囊发育中马氏珠母贝血清免疫因子的变化规律

马氏珠母贝育珠贝插核手术后的第1、第2、第3、第10、第15、第20、第30和第60天,抽取育珠贝血清,并研究其非特异性免疫因子酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和溶菌酶(LSZ)的活性变化。结果表明:在珍珠囊发育初期(插核后3～10d),育珠贝血清的免疫因子ACP、AKP、CAT、SOD均比对照组(未经插核的马氏珠母贝)显著性增大(P<0.05),LSZ在插核后1～3d比对照组LSZ活性显著性增大(P<0.05);在珍珠囊发育中期(插核后第15～20天),各种免疫酶活性都逐渐降低;珍珠囊发育后期(插核30d后),育珠贝血清中的各种免疫酶活性都已恢复到对照组水平。     

马氏珠母贝TRACP基因的克隆及组织表达

【目的】克隆马氏珠母贝(Pinctada martensii)抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate resistant acid phosphatase,TRACP)基因,分析该基因在不同组织中的表达模式。【方法】用RACE技术克隆得马氏珠母贝TRACP基因(PmTRACP),用实时荧光定量PCR分析该基因在外套膜、闭壳肌、足、性腺、珍珠囊、肝胰腺和鳃中的表达。【结果与结论】PmTRACP基因长度为2 034 bp,开放式阅读框972 bp,编码323个氨基酸,5′UTR长度为27 bp,3′UTR长度为1 035 bp。预测PmTRACP分子质量约为36.39 ku,理论等电点为5.97。该基因含有一个钙调神经磷酸酶样磷酸酯酶结构域。PmTRACP与其他物种TRACP的同源性为48%～65%,与长牡蛎(Crassostrea gigas)TRACP的同源性最高,同时D³²、D⁷⁰、Y⁷³、N¹⁰⁸、H²⁰³、H²¹²、H²³⁷、H²³⁹等8个氨基酸活性位点和N¹¹⁴糖基化位点在不同物种TRACP中高度保守。PmTRACP与长牡蛎TRACP的亲缘关系最近。PmTRACP在马氏珠母贝各个组织均有表达,且在肝胰腺和珍珠囊中高表达。     

化学物质诱导对马氏珠母贝眼点幼虫附着的影响

【目的】研究血清素(5-HT)、蜕皮激素、γ-氨基丁酸(GABA)、腺嘌呤核苷、次黄嘌呤核苷和次黄嘌呤对马氏珠母贝眼点幼虫附着的影响。【方法】以不同浓度的5-HT、蜕皮激素、GABA、腺嘌呤核苷、次黄嘌呤核苷和次黄嘌呤溶液处理马氏珠母贝眼点幼虫,不同时间后,分析眼点幼虫附着率的变化。【结果】在24~96 h作用时间里,5-HT、蜕皮激素、GABA对眼点幼虫附着的诱导效果整体上均呈上升趋势;在24~120 h作用时间里,腺嘌呤核苷、次黄嘌呤核苷和次黄嘌呤对眼点幼虫附着的诱导效果整体上呈上升趋势。眼点幼虫在10^-5 mol/L的5-HT和GABA处理24、48、72和96 h后,附着率均显著高于对照组(P<0.01);10^-5 mol/L的蜕皮激素处理24 h和72 h,10^-6 mol/L的蜕皮激素处理24 h和96 h,10^-7 mol/L的蜕皮激素处理24 h,附着率均显著高于对照组(P<0.01);10μmol/L腺嘌呤核苷处理24、48、72和120 h,1μmol/L腺嘌呤核苷处理24、48、72、96和120 h,附着率均显著高于对照组(P<0.01);10μmol/L次黄嘌呤核苷处理48和72 h,1μmol/L次黄嘌呤核苷处理48、72、96和120 h,附着率均显著高于对照组(P<0.01);10μmol/L的次黄嘌呤处理72、96和120 h,附着率均显著高于对照组(P<0.01)。【结论】5-HT、蜕皮激素、GABA、腺嘌呤核苷、次黄嘌呤核苷和次黄嘌呤溶液在适宜的浓度和处理时间均可诱导马氏珠母贝眼点幼虫附着,其中10^-5 mol/L的5-HT处理24 h对附着率的诱导效果最佳,可达对照组的6.3倍。     

马氏珠母贝育苗方法的多因素试验

用正交试验的方法观察影响马氏珠母贝育苗效果的七个因素：ＥＤＴＡ（Ａ）、水处理（Ｂ）、换水（Ｃ）、充气（Ｄ）、光照（Ｅ）、抗菌素（Ｆ）、倒池（Ｇ）。结果表明：影响成活率的显著因素为Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ；影响贝苗生长的显著因素为Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ。加入ＥＤＴＡ、利用砂滤海水、每天换水、微弱充气、较暗的光照、使用抗菌素和定期倒池为浮游幼虫期较优的育苗方法。     

马氏珠母贝激光育苗的生物学机理

对马氏珠母贝激光育苗的机理进行研究，结果表明：激光能加强精子活力，提高精液品质；影响卵子的通透性；抑制水中的细菌生长，使受精卵发育成健壮的胚胎、幼虫、幼苗。     

Janus激酶3抑制剂对马氏珠母贝珍珠囊发育和免疫相关基因表达的影响

【目的】研究JAK3抑制剂对珍珠囊发育及移植免疫反应的影响。【方法】以马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)为材料,植核前用JAK3抑制剂处理细胞小片和珠核,植核后18 d和30 d取珍珠囊,用石蜡切片技术和H.E.染色法(Hematoxylin-eosin Staining)观察JAK3抑制剂对珍珠囊发育的影响,利用荧光定量技术检测植核后不同时间(6、12、24 h和3、6、12、18、30 d)免疫相关基因NF-kappaB(Nuclear factor kappa B)、IkappaK(I-kappaB kinase)和炎性诱导因子IL-17(Interleukin 17)的表达变化。【结果】植核后18 d和30 d,与对照组相比,JAK3抑制剂对珍珠囊的发育没有显著影响(P> 0.05)。荧光定量结果显示,植核后6 h和12 h,JAK3抑制剂可以显著性抑制IL-17的表达,植核后6、3、6、12 d,JAK3抑制剂可以显著性抑制NF-kappaB的表达,植核后3、6 d,JAK3抑制剂可以显著性抑制IkappaK的表达(P <0.05)。【结论】JAK3抑制剂对马氏珠母贝免疫基因表达有明显的抑制作用,可以有效调控珍珠贝植核后的移植免疫,而对珍珠囊发育的影响不明显。     

不同温度下马氏珠母贝干露耐受能力及其免疫相关基因表达的变化

【目的】探究马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)对干露胁迫的响应,为马氏珠母贝健康养殖和遗传育种提供基础资料。【方法】在不同温度下对马氏珠母贝进行干露胁迫,探究温度对马氏珠母贝干露耐受的影响;筛选出马氏珠母贝干露胁迫敏感组和耐受组,比较两组的免疫相关基因表达量和植核后休养期存活率。【结果】(1)22~34℃条件下,马氏珠母贝干露耐受能力随温度升高及干露时间延长而降低;(2)22℃下,S组和T组的脯氨酸羟化酶(PHD)、葡萄糖转运蛋白(GLUT)、髓样分化因子(MYD88)、热休克蛋白(Hsp70、Hsp20)和凋亡抑制因子(cIAP)6个基因在干露过程中表达量基本呈上升趋势,组间差异显著(P<0.05);(3)植核试验结果表明耐受组植核后休养期的存活率显著高于敏感组(P<0.05)。【结论】马氏珠母贝在高温环境下干露耐受能力降低,在适温条件下耐受组比敏感组表现出较高的存活率。     

体重和温度对马氏珠母贝耗氧率和排氨率的影响

采用室内实验生态学方法对马氏珠母贝的耗氧率和排氨率进行了研究。结果表明:在温度13～33℃范围内,马氏珠母贝的耗氧率和排氨率均与体重呈负相关,可用Y=aW表示;在13～28℃温度范围内,马氏珠母贝-b的耗氧率随温度的升高而增加,28℃时,耗氧率达最大值,温度升高至33℃时,耗氧率反而下降,而排氨率在此温度范围内则呈持续升高趋势;在13～28℃温度范围内,马氏珠母贝呼吸和排泄Q10值分别为1.51～2.71和1.03～2.73,且在该温度范围内,马氏珠母贝的耗氧率和排氨率的比值范围为7.29～13.14。方差分析表明,体重、温度及二者的交互作用对马氏珠母贝的耗氧率和排氨率均有极显著影响(P<0.01)。马氏珠母贝的日常代谢高于标准代谢,耗氧率和排氨率平均值分别提高40.8%和59.1%。     

马氏珠母贝经济性状对体重决定效应分析

采用通径分析方法研究了不同养殖区马氏珠母贝各分性状对体重的决定效应。结果表明:流沙养殖群体分性状壳长、壳高、壳宽、铰合线长、软体部重和闭壳肌重与体重间呈正相关(P<0.01),对体重的直接决定效应分别为0.091、0.072、0.029、0.002、0.089和0.001,间接决定效应分别为0.319、0.284、0.183、0.03、0.304和0.004,总决定效应分别为0.41、0.356、0.212、0.032、0.393和0.005;6个经济性状与体重间的关系在抽样断面上可用线性回归模型拟合,复相关系数达0.939(P<0.01)。6个性状3类决定效应按大小排列均为壳长>软体部重>壳宽>壳高>铰合线长>闭壳肌重。迈陈养殖群体作为验证群体,各效应值与前者有差异,但3类决定效应大小排序与前者完全相同。基于决定效应大小及性状易测性,育种目标性状的选择策略为首选壳长,二选壳高,三选壳宽。研究还发现壳宽对软体部重具有最大的决定效应,提出加大壳宽选择强度以培育大型珍珠新观点。     

光合细菌在马氏珠母贝育苗中的应用

研究了光合细菌（下简称PSB）作为饵料添加剂在马氏珠母贝育苗中的饵料效果。结果表明：（1）单独投喂PSB,幼虫能生长发育并附着变态形成稚贝,但其长速、稚贝总育成率均低于单独投喂单胞藻的对照组;（2）用PSB与单胞藻混合投喂,幼虫的长速、稚贝总育成率均高于对照组;（3）添加PSB后,在眼点幼虫附着前不换水,幼虫的长速和眼点形成率均高于换水;但在眼点幼虫进入附着期仍不换水,则稚贝生长速度,总育成率均低于换水;（4）当PSB菌液密度为10×10-6个／cm3时,PSB投喂量以每天25×10-6为最佳,稚贝总育成率达到26．6％,而对照组仅为4．6％。     

马氏珠母贝的术前处理试验

本试验根据马氏珠母贝手术贝的不同生理状态，分别用控制海水流量、饵料等抑制贝的生殖腺发育，或促进生殖腺发育并诱导产卵排精的方法，对手术贝进行术前处理，结果表明：手术后休养期成活率平均为９２．９％，最高的达９５．３％；育珠期成活率平均为７５．３％。最高的一组达８５．３％；平均每个贝留核数１．０６粒，最高的达１．１７粒，同时珍珠质量明显提高。用术前处理方法，产量和产值可提高５２．３％。     

马氏珠母贝壳长生长模型研究

以Cp统计量作为确定马氏珠母贝壳长最优生长模型的准则,通过Levenberg-Marquardt迭代法求出模型中各生长参数,用Brody、von Bertalanffy、Gompertz、Logistic和Richards 5个生长模型对马氏珠母贝壳长的生长进行了拟合。结果表明,在马氏珠母贝生长的第一年中,壳长生长过程遵循Brody生长模型,其壳长生长极限值为56.572 mm(43.807～69.337,95%置信区间)。     

马氏珠母贝幼虫假单胞菌病的初步研究

马氏珠母贝人工育苗过程中幼虫经常发生一种严重的病害。发病幼虫症状如下：消化盲囊颜色由正常的均匀的黄绿色变成不均匀的茶褐色或无色;胃中的食物长时间不能消化并变成茶褐色;幼虫趋光性差,活力弱,不能集群,不久即大量下沉死亡。对发病幼虫进行了细菌的分离和纯化,得到3株纯化的菌株,对“D”型幼虫的人工感染试验证实：9401和9402两株菌株是致病菌,通过对细菌进行群体及个体形态观察、生化实验,鉴定9401和9402两株菌株均属假单胞菌（Pseudomonas）。对这2株菌株进行了药物敏感试验、药物预防试验,结果表明,2株菌株对氯霉素、痢特灵、氟哌酸敏感,2×10－6氯霉素可达到预防的目的。     

马氏珠母贝外海深水区养殖的初步研究

采用延绳式、浮筏式、立桩式在外海深水区进行马氏珠母贝［Ｐｉｎｃｔａｄａ ｍ ａｒｔｅｎｓｉｉ （Ｄｕｎｋｅｒ）］人工养殖试验,结果表明：经 １１ 个月的养殖,其成活率分别为延绳式 ５６．３％ ,浮筏式 ３２．８％ ,立桩式２０．８％ ,而同期在港湾浅水区养殖时,其成活率分别为浮筏式 ２８．８％ ,立桩式 １８．５％ 。而且外海深水区养殖马氏珠母贝生长快,个体大,体质强,病害少,附着物少。此外,外海深水区延绳式养殖设施抗风浪能力强,是开发利用外海深水区的一种良好方式     

几种抗菌药物对马氏珠母贝壳顶幼虫的毒性试验

几种抗菌药物对壳顶幼虫的毒性试验结果表明：（１）以９６ｈ平均日生长率作为药物对幼虫毒性的观察指标，求出日生长率仅为对照组一半时的药物浓度（９６ＴＬＭ）及安全浓度（ＳＤ）如下：氯霉素６９×１０－６、６．９×１０－６；呋喃西林７２×１０－６、７．２×１０－６；百炎净７７×１０－６、７．７×１０－６；红霉素９７×１０－６、９．７×１０－６；硫酸链霉素４８×１０－６、４．８×１０－６；青霉素钠大于１００×１０－６、１０×１０－６。（２）１３×１０－６的呋喃西林、１３×１０－６的红霉素、１３×１０－６的青霉素钠对幼虫生长均有促进作用。（３）各试验组随药物浓度递增，幼虫活动逐渐被抑制；摄食率及眼点率逐渐下降。高浓度红霉素对摄食的抑制作用最强。