养殖黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco) 鮰爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)的分离鉴定与生物学特性研究

从四川眉山与新津两地患红头病的养殖黄颡鱼体内分离到2株优势菌(CHNYC001与CHNYC002),以腹腔注射与浸泡的方式进行人工感染试验,证实其为养殖黄颡鱼红头病的病原菌。根据分离菌株的形态、生理生化特性,结合16SrDNA序列测定(GenBank登录号分别为FJ766524、FJ766525)与系统发育分析,将其鉴定为鮰爱德华氏菌(Edwardsie lla ictaluri)。分离菌株最适生长温度为20—30℃,最适生长pH为7.0,在含盐量2%以上的培养基上不生长,对氟苯尼考、强力霉素、洛美沙星等敏感,对乙酰螺旋霉素、磺胺甲基异噁唑和麦迪霉素等不敏感。临床病理特征分析发现,养殖黄颡鱼感染爱德华氏菌临床上分为急性与慢性两种类型,急性型主要表现为败血症的病变特征,慢性型表现为头顶出血,发红与溃疡的病变特征。     

黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco) 爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)感染的动态病理学及病原分布研究

采用病理形态学方法与免疫组化法进行了黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco) 爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)感染的动态病理学与病原分布研究。结果表明, 感染鱼主要临床特征为游动缓慢, 旋游, 体表出血, 腹部膨大, 腹腔内充有淡黄色或含血的腹水, 肝、脾与肾肿大, 出血; 病理组织学上, 感染后8—12h, 肝细胞空泡变性和间质性肾炎; 24h后肝出现局灶性坏死, 肾小管上皮变性和更严重的间质性肾炎, 脾出血和淋巴细胞坏死; 48h 后, 肝、脾、肾坏死更严重, 致感染鱼死亡。感 染后8h, 在肝脏检测到病原菌阳性信号, 12h 后, 在肝、肾、脾中检出阳性信号, 48h 后, 在肝、肾、脾、心、脑、鳃、肠道等都检出阳性信号, 表明爱德华氏菌腹腔注射感染黄颡鱼首先侵袭肝、肾、脾, 然后是心脏、脑、鳃、胃肠等。     

瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco Richardson)幼鱼日粮中主要营养素需要量研究

采用"金字塔"法对瓦氏黄颡鱼幼鱼日粮中主要营养素的需要量进行了研究.试验共持续了60天.实验日粮中蛋白质、脂肪、碳水化合物设定的范围分别为30%-48%、3%-18%和26%-35%.结果表明,当日粮碳水化合物在26%-32%,脂肪6%-12%,蛋白质39%-48%,能量在15.63-16.95MJ/kg和能量蛋白比为364-435J/mg时,瓦氏黄颡鱼幼鱼均获得较好的生长率;日粮脂肪水平为12%以上时肝组织有不同程度的脂肪变性和坏死;肌肉蛋白质、脂肪和碳水化合物的沉积受日粮中的蛋白质、脂肪和碳水化合物的影响,存在显著性差异(P<0.05);肝体指数和肠脂比随日粮中脂肪含量升高而增大,肝脏中的糖原含量受到日粮中添加碳水化合物水平的影响,且有显著差异(P<0.05);日粮中可消化能显著影响肌肉中脂肪的沉积,肠脂比、肝体指数和内脏比都随日粮中可消化能水平提高而呈上升趋势.本实验结果表明,瓦氏黄颡鱼幼鱼日粮中主要营养素的适宜需要量为蛋白质39%-42%、脂肪6%-9%、碳水化合物26%-29%、能量15.63-16.95MJ/kg、能量蛋白比364-435J/mg.     

抗鲶爱德华氏菌多克隆抗体的制备及特性分析

利用2株黄颡鱼"红头病"病原菌——鲶爱德华氏菌的灭活疫苗作为免疫原,免疫新西兰大白兔,制备了高效价的多克隆抗体。通过间接酶联免疫、间接免疫荧光和免疫印迹等技术对多克隆抗体特性进行了分析。测定获得多抗效价分别为1∶215和1∶214,2株病原菌之间存在很强的交叉反应,且2种多抗均与鲶爱德华氏菌、迟钝爱德华氏菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、火神弧菌、河流弧菌、创伤弧菌标准菌株存在交叉反应,与粪肠球菌、大肠杆菌、酿脓链球菌、海豚链球菌、杀鲑气单胞菌、嗜水气单胞菌、类产碱假单胞菌标准菌株均无交叉反应。免疫印迹实验结果表明,2株病原菌的主要抗原决定簇相同,分子量分别为61.1,46.6,41.3,28.8和19 kDa。本实验得到了黄颡鱼"红头病"致病菌高效价的多克隆抗体,可以作为初步筛选"红头病"病原菌的工具,为建立快速有效的疾病监测方法和进一步的免疫学防病研究提供了依据,奠定了基础。     

17 β-雌二醇对雄性瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli)的雌激素效应

以三峡库区小型经济鱼类瓦氏黄颡鱼雄鱼为对象,研究17β-雌二醇对它的雌激素效应.在不同的温度和剂量条件下测定血清卵黄蛋白原、Ca2+、总磷、无机磷的含量,以及肝胰脏RNA/DNA比率.结果表明,与对照组相比,当水温≥16℃、剂量≥1.0μg/g,以及水温≥19℃、剂量≥0.1μg/g条件下,17 β-雌二醇可诱导雄性瓦氏黄颡鱼产生卵黄蛋白原,而且其水平增加呈明显的剂量依赖;当水温≥16℃、剂量≥1.0μg/g时,血清Ca2+含量极显著增加,呈明显的剂量依赖;试验组血清各种 磷组分增加也呈剂量依赖;17 β-雌二醇也引起肝胰脏代谢指标RNA/DNA比率增加.结果表明,雄性瓦氏黄颡对雌激素有较高的敏感性,加上其体型适中,容易获得等特性,可以作为水环境雌激素内分泌干扰物检测的指示生物.血清卵黄蛋白原与Ca2+可以作为污染水体雌激素内分泌干扰物的检测指标.     

迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)研究概况

迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是水产养殖中危害极大的病原菌,本文从发病情况、致病性研究及防治等诸方面将国内外对该菌的研究情况进行了系统的介绍.     

基于线粒体D-loop区分析黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)五个淡水湖泊群体的遗传多样性

采用线粒体D-loop区测序技术,对巢湖、滆湖、洪泽湖、鄱阳湖和太湖5个地理群体的黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)遗传多样性及种群遗传结构进行了研究。结果表明,890个位点中变异位点有151个,简约信息位点24个。143个个体共检测到72个单倍型,平均单倍型多样性指数为0.951±0.011,核苷酸多样性为指数为0.00614±0.00087。鄱阳湖群体和其它4个湖泊群体的遗传距离相对比较大,滆湖和巢湖的遗传距离最小,总体遗传分化指数Fst为0.0896(P<0.01)。群体间基因流系数Nm=2.22,表明5个黄颡鱼种群间存在着一定的基因流动。     

瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachellii)Toll样受体2(TLR2)基因克隆及免疫功能

为探究Toll样受体2(Toll-like receptor 2,TLR2)及下游免疫分子对瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachellii)机体的保护作用,本研究采用RT-PCR及RACE法获得瓦氏黄颡鱼TLR2全长c DNA(2611bp),编码789个氨基酸残基,含有10个富含亮氨酸的重复序列(Leucine Rich Repeat,LRR)和Toll/IL-1R(Toll/IL-1 Receptor Domain,TIR)同源区结构域,属I型跨膜受体。序列同源性比对发现,瓦氏黄颡鱼TLR2 c DNA与斑点叉尾、鲤及虹鳟的同源性分别为78%、62%及49%。系统进化树分析表明,瓦氏黄颡鱼TLR2与斑点叉尾聚为一支。q RT-PCR分析表明,TLR2 m RNA在检测的组织中均有表达,且在头肾和脾脏中表达水平显著高于其他组织(P0.05)。嗜水气单胞菌感染能显著上调瓦氏黄颡鱼肝脏、头肾及脾脏中TLR2 m RNA表达(P0.05),分别在24h、48h及12h达到最大值。头肾中的TLR 2信号通路下游的髓样分化因子、半胱氨酸蛋白酶8、核转录因子kappa B、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1βm RNA均显著上升(P0.05),分别在24h、12h、48h,48h和48h达到最大值。结果表明,嗜水气单胞菌感染激活了TLR2信号通路,通过上调表达,肿瘤坏死因子α,白细胞介素1β等。本研究表明,TLR2在瓦氏黄颡鱼抵御嗜水气单胞菌侵染的过程中发挥了重要的免疫作用。     

牙鲆(Paralichthys olivaceus)TLR21 基因在迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)感染后的表达特征

应用荧光定量PCR技术, 检测了TLR21 基因在牙鲆(Paralichthys olivaceus)感染迟缓爱德华 氏菌(Edwardsiella tarda)后, 在0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、1 d、3 d、6 d 后, 在心脏、肝脏、脾脏、 头肾、鳃、小肠、肌肉和血的时空表达特征, 并探讨了它们与牙鲆先天免疫反应的关系。结果表明, 大 多组织在感染病原6 h 后TLR21 基因表达明显上调, 尤其是头肾和小肠。头肾6 h 的表达量达到了 对照组的59.3 倍, 小肠6 h 的表达量为对照组的38.6 倍。迟缓爱德华氏菌感染引起牙鲆体内各组织 中TLR21 的上调表达和变化, 为研究牙鲆对迟缓爱德华氏菌的防御机制提供了理论依据。     

黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）鳃的超微结构研究

应用光学和电子显微成像技术对黄颡鱼鳃的表面形态特征、鳃小片血管分布及其内部超微结构进行了观察。结果表明,黄颡鱼鳃耙呈长锥形,鳃弓表面具棘状小刺,鳃小片呈褶皱状,镶嵌排列在长条形鳃丝两侧。光镜可观察到鳃小片两侧红色的入鳃和出鳃动脉以及中部片状毛细血管网。鳃耙、鳃弓、鳃丝及鳃小片表面均被扁平上皮细胞覆盖,其表面微嵴形态结构...     

瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli)卵黄蛋白原的纯化、性质鉴定及ELISA检测方法的建立

腹腔注射17β-雌二醇(E2),使瓦氏黄颡鱼雄鱼在7天内产生卵黄蛋白原(Vtg)。采用凝胶过滤和离子交换两种层析技术,从E2诱导的雄性瓦氏黄颡鱼血浆中分离、纯化出Vtg,采用糖、磷、脂蛋白染色技术证明分离、纯化的蛋白为Vtg,该Vtg在非变性条件下分子量约为240kDa,在SDS变性条件下分子量约为143kDa。纯化的瓦氏黄颡鱼Vtg经检测显示可能含有类胡萝卜素,但没有二硫键,对热相对稳定。利用纯化的瓦氏黄颡鱼Vtg,制备了兔抗瓦氏黄颡鱼Vtg多克隆抗血清。用双向免疫扩散法测得抗血清的纯度较高,效价为1︰32;Western blotting检测显示抗血清的特异性较好。以瓦氏黄颡鱼Vtg多克隆抗血清为抗体,以纯化的瓦氏黄颡鱼Vtg为抗原,建立了间接酶联免疫吸附反应(ELISA)方法检测瓦氏黄颡鱼体内Vtg的含量,标准曲线线性部分的线性方程为y=0.099x+0.4529(R2=0.9327),该方法检测的灵敏度为15.6ng/ml,工作范围为31.2—4000ng/ml,在此范围内,标准曲线具有良好的线性。     

海水工厂化养殖大菱鲆(Scophthalmus maximus)和褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)腹水病病原菌的分离与鉴定

从患腹水病大菱鲆和褐牙鲆成鱼体内分离到两株致病作用强的病原菌FS1和FS2,经人工感染实验表明菌株FS1和菌株FS2为腹水症的致病菌。采用常规的生理生化鉴定方法及梅里埃全自动微生物分析系统(VITEK32),结合分子生物学方法进行病原菌的鉴定。结果表明,菌株FS1和菌株FS2分别为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)和溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)。菌株FS116SrRNA基因序列与迟缓爱德华氏菌的同源性达99%;菌株FS2的16SrRNA基因序列与溶藻弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌等的同源性均达99%。为最终确定菌株FS2的分类地位,测定了其HSP60基因序列,进行网上同源性比对。分析结果表明,菌株FS2与溶藻弧菌的同源性达99%,而与其他弧菌HSP60基因的同源性均低于91%。这两种致病菌混合感染或分别感染均可造成养殖鲆鱼腹水病。     

日粮中添加叶黄素与角黄素对瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli Richardson)体色影响研究

采用传统养殖试验方法研究了日粮中添加叶黄素与角黄素对瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli Richardson)体色的影响。实验设计了11组等蛋白质(42.6%)、等能量(18.5MJ/kg)的实用试验日粮,在试验日粮中分别添加0、25、50、100、200mg/kg叶黄素和25、50、100mg/kg叶黄素与25、50mg/kg角黄素,对照组为野生瓦氏黄颡鱼。结果表明,实验结束时(60d),试验3、8、9日粮组(添加50mg/kg叶黄素、50mg/kg叶黄素+25mg/kg角黄素、50mg/kg叶黄素+25mg/kg角黄素)鱼体体色与对照组鱼(野生瓦氏黄颡鱼)体色相似,试验3、8、9组鱼皮肤中叶黄素含量与对照组鱼差异不显著(P0.05)。本实验认为,在日粮中添加叶黄素对瓦氏黄颡鱼的着色效果明显较角黄素好,是养殖瓦氏黄颡鱼饲料的适宜添加色素。在瓦氏黄颡鱼的饲料中叶黄素的建议添加量为50mg/kg。     

绿鳍马面鲀(Navodon septentrionalis)鱼头酸溶性与酶溶性胶原蛋白的分离纯化及理化性质研究

利用酸溶法和酶溶法制备马面鲀鱼头酸溶性胶原蛋白(ASC)和酶溶性胶原蛋白(PSC),并对所制备的ASC和PSC的氨基酸组成、SDS-PAGE、红外光谱、黏度和热变性温度,以及溶解度等性质进行分析。结果表明:马面鲀鱼头中ASC和PSC的提取率分别为0.94%±0.07%和3.91%±0.14%。Gly(265.0和251.8残基/1000残基)、Ala(111.0和107.6残基/1000残基)和Pro(87.0和83.1残基/1000残基)含量较高,而His和Tyr的含量较少,且未检测到Cys。ASC和PSC中亚氨基酸(Pro和Hyp)含量为169.3和160.6残基/1000残基。氨基酸组成分析、SDS-PAGE和红外光谱(FTIR)证实ASC和PSC均属于I型胶原蛋白,热变性温度分别为17.6°C和16.5°C。在酸性p H值范围内,ASC和PSC的溶解度较高;当Na Cl溶液浓度高于2%,ASC和PSC的溶解度会显著降低。综上,相对于哺乳动物类胶原蛋白,马面鲀鱼头ASC和PSC的亚氨基酸含量和热变性温度较低,结构稳定性差,易于降解,可作为胶原蛋白肽的制备原料进行开发。     

大黄鱼(Pseudosciaena crocea)致病性维氏气单胞菌的分离鉴定与药敏特性研究

本研究从自然发病的养殖大黄鱼(Pseudosciaena crocea)肝脏处分离得到1株优势菌9L2,经形态学观察和传统生理生化鉴定,显示该菌为发酵型革兰氏阴性短杆菌,有动力,氧化酶阳性,水解赖氨酸及色氨酸等。利用Biolog细菌鉴定方法进行种属鉴定,确定9L2为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii),相似性达100%。同时对其16S rDNA基因进行PCR扩增、测序和系统发育分析,结果表明该菌与气单胞菌属的菌株亲缘关系最近,与维氏气单胞菌(登录号为LMG13695)的16S rRNA基因序列相似性达99.79%。经人工腹腔注射感染吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)的试验结果表明,9L2对罗非鱼的半数致死剂量LD_(50)为1.08×10~3CFU/g。24种抗生素药敏试验结果表明,该菌株对诺氟沙星、新生霉素、呋喃妥因、头孢曲松等13种药物高度敏感,对洛美沙星、卡那霉素等5种药物中度敏感,对利福平、青霉素等6种药物产生耐药性。20种中药体外抑菌试验结果表明,其中11种对致病菌体外抑菌效果较好,平均抑菌浓度范围为0.11—7.20mg/mL。     

斑点叉尾鮰(Ictalunes punctatus)源中间气单胞菌(Aeromonas media)分离鉴定及药敏特性

从湖南常德某养殖场死亡的斑点叉尾（Ictalunes punctatus）肝脏、肾脏、腹水及血水中分离到一株致病性菌株zy02。对该菌进行了形态特征观察、理化特性测定及分子生物学方法鉴定,用PCR方法同时扩增其16S rDNA和gyrB基因,分析了16S rDNA和gyrB两种基因序列的同源性,并构建了系统发生树。经生理生化测定和16S rDNA与gyrB基因序列分析,zy02株为中间气单胞菌。人工感染该菌后发病鱼表现为与自然发病类似症状,且从组织中再分离的细菌特性与原感染菌相同。腹腔注射后该菌株对斑点叉尾的半致死浓度为3.89×10⁶CFU/mL。菌株zy02对多西环素、庆大霉素及左氧氟沙星等高度敏感;对红霉素中度敏感;对阿莫西林、磺胺异噁唑、克林霉素及利福平等5种药物耐药。本研究为斑点叉尾该病防控提供了理论依据。